Biochimica clinica - Appunti

Biochimica clinica 4° anno farmacia: 10 crocette + orale

La biochimica clinica studia le modificazioni metaboliche che determinano nel corso delle diverse patologie e che possono essere misurate nei vari fluidi biologici. Sono utilizzate molecole specifiche per scopi diversi:

• Come marker diagnostici screening e/o per la diagnosi di una determinata patologia.
• Come marker per monitoraggio trattamento chirurgico o farmacologico.

Un test di screening prevede l’utilizzo di un metodo analitico per studiare la frequenza di una malattia in una popolazione e si può eseguire dopo aver valutato se la malattia di interesse è frequente, se compare dopo un tempo sufficiente dai primi sintomi, se il test è di facile esecuzione ed è accurato, se ci sono adeguati servizi a disposizione per l’esecuzione e se ci sono le coperture economiche per eseguirlo.

La finalità diagnostica è utile per confermare o escludere un sospetto diagnostico. Si può decidere di eseguire un singolo test, un raggruppamento analitico, un profilo metabolico o, ancora, un profilo di organo o di apparato in rapporto al tipo di sospetto diagnostico.

Dal prelievo del campione biologico al referto

1. Fase pre-preanalitica

Il quesito clinico apre le porte a una corretta valutazione biochimico-clinica del paziente. È fondamentale per orientare chi farà le ricerche verso l’obbiettivo del prelievo e delle analisi richieste.

Il primo aspetto da considerare è se le richieste sono indirizzate:

• Alla valutazione delle condizioni di una determinata categoria di lavoratori al fine di poter scegliere le misure sanitarie da adottare.
• Ad analisi di screening per la prevenzione di patologie.
• Al controllo del mantenimento dello stato di salute.
• Al completamento diagnostico nel sospetto della patologia.
• Al monitoraggio di una patologia in fase pre o post-operatoria.
• Al monitoraggio di una malattia durante un trattamento farmacologico.
• A gestire uno stato di emergenza-urgenza del paziente.

La relazione tra il paziente e il personale sanitario all’accettazione si basa su:

• Accertamento dell’identità del paziente.
• Stato di salute del paziente.
• Eventuale firma consenso informato, per eventuali test specifici come ad esempio HIV.

Per una corretta interpretazione dei risultati dell’analisi è importante che si conoscano lo stato di salute e di riposo del paziente al momento del prelievo. Le informazioni sul paziente sono importanti perché possono influenzare l’esito dell’esame clinico: bisogna tenere conto dello stato di riposo, la posizione in cui si effettua il test, ansia, alimentazione del giorno precedente, digiuno (es. in caso di un controllo di lipidi e glucosio), idratazione, farmaci.

I farmaci possono incidere su vari metaboliti come acido folico, bilirubina, acido urico, albumina etc.

I campioni biologici vengono prelevati dal paziente presso il centro prelievi o reparti ospedalieri.

2. Fase pre-analitica

I campioni da analizzare una volta giunti al laboratorio di analisi sono sottoposti al check-in attraverso un sistema automatizzato che:

• Controlla l’esatta provenienza dei campioni.
• Seleziona i campioni.
• Ordina i campioni per tipologia di esame.

I trattamenti preanalitici consistono in una serie di interventi eseguiti sul campione subito dopo il check-in e fino al suo posizionamento nell’analizzatore. Tali trattamenti dipendono dal tipo di campione che sarà sottoposto all’analisi. Se le analisi devono essere effettuate su sangue intero, la provetta è posta direttamente sull’analizzatore. Diversamente, per la preparazione del plasma o siero, il sangue è centrifugato e successivamente conservato a diverse temperature, in base al tipo di analisi a cui dovrà essere sottoposto.

Per minimizzare gli errori si usano sistemi front-end: in questo tipo di sistema tutti i trattamenti preanalitici si susseguono in un grande strumento dotato di un sistema del tutto automatizzato che inizia con il check-in fino al posizionamento della provetta nell’analizzatore.

I vantaggi del sistema front-end sono diversi. Grazie all’aliquotazione del campione:

• È possibile prelevare una piccola quantità di sangue a cui corrisponde la necessità di un minor numero di provette.
• Il sistema consente di risparmiare tempo.
• È vantaggioso da un punto di vista economico perché sono richieste meno risorse umane.
• Garantisce inoltre una maggiore sicurezza sul lavoro, perché l’operatore non entra in contatto diretto con il campione durante l’apertura delle provette e dell’aliquotazione.
• Inoltre è possibile integrare i tipi di analisi in rapporto ai risultati ottenuti.
• Infine i risultati ottenuti possono essere elaborati e validati anche da posizioni esterne alla struttura.

3. Fase analitica

Le analisi qualitative danno informazioni sulla presenza o assenza di uno specifico metabolita in un campione, utili per esempio quando si effettuano test di screening.

Colorimetria: identifica e misura i colori sviluppati in seguito a una reazione biochimica, confrontandoli con un bianco di controllo.

Es. test di Benedict per determinare la presenza di zuccheri riducenti.

Spettrofotometria: si basa sulla valutazione della frazione di intensità di radiazione visibile che una sostanza riflette per diffusione quando viene colpita da luce di lunghezza d’onda diverse. Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, essa viene assorbita più o meno intensamente in funzione della concentrazione.

Occorre fare una curva di taratura, usando soluzioni standard, per poter risalire alle concentrazioni incognite dei campioni. Il principio si basa sulla legge di Lambert-Beer, secondo cui l’assorbanza, cioè lo sviluppo di colore, è direttamente proporzionale alla concentrazione del campione che sto analizzando.

Turbidimetria e nefelometria: usati per misurare soluzioni colloidali o sospensioni. Si distinguono per come arriva il raggio: uno perpendicolare, uno parallelo. Si sfrutta la legge di Lambert-Beer, come nel caso della spettrofotometria. Si usa ad esempio per la determinazione delle lipoproteine.

HPLC: analisi cromatografica quali-quantitativa, che permette la separazione di diverse molecole presenti in un solvente; prevede una fase stazionaria presente all’interno della colonna stessa. Più è alta l’affinità di una molecola per la fase stazionaria rispetto a quella mobile, più tempo sarà necessario perché la molecola attraversi la colonna (tempo di ritenzione). La separazione tra le diverse molecole si ottiene grazie al differente tempo di ritenzione.

UFLC: metodo quali-quantitativo, che consente di misurare la massa molecolare ionizzando la molecola e successivamente frammentandola in ioni di diverso rapporto massa/carica, in modo da ottenere dei profili di frammentazione, che sono specifici per ciascun composto e che, quindi, costituiscono un’impronta molecolare. Si può così individuare la formula di struttura di composti sconosciuti.

Elettroforesi capillare: permette di rilevare e quantificare le proteine permettendo di riconoscere le alterazioni proteiche nel siero e in altri liquidi biologici. Le proteine migrano dall’anodo al catodo, spinti dal gradiente di elettricità. Vedo le proteine tramite l’UV detector. Lo svantaggio è che sviluppa molto calore, quindi può denaturare le proteine. Per questo si usano capillari molto lunghi, per favorire la dispersione del calore.

Citometria a flusso: permette di contare ed eventualmente selezionare e isolare, elementi corpuscolati e cellule opportunamente marcate con un fluoroforo e fatte passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare.

RIA e IRMA: sono due saggi che prevedono l’utilizzo di anticorpi legati a isotopi radioattivi (es. iodio, cobalto etc.) che reagiscono con il campione fino a marcare l’antigene.

FIA: si basa sull’uso di anticorpi marcati con composti fluorescenti, detti fluorocromi, sostanze coloranti che, se illuminate con radiazioni ultraviolette, emettono luce nel visibile.

Chemiluminescenza: reazione chimica che viene rivelata tramite l’emissione di una radiazione elettromagnetica nel campo del visibile e nel vicino infrarosso. La radiazione viene emessa quando gli elettroni, dopo l’eccitazione dell’atomo, dallo stato eccitato tornano a quello fondamentale. La chemiluminescenza diretta o di tipo 1 è una reazione che genera un prodotto eccitato, responsabile dell’emissione luminosa. Quella di tipo 2 è una reazione in cui il prodotto eccitato trasferisce l’energia attivante a un accettore, che è responsabile dell’emissione della luce. Necessita di un substrato chemiluminescente, un accettore di energia per le reazioni di tipo 2, ossigeno, enzima o ione metallico che agisce come catalizzatore e cofattori. È la base per il riconoscimento antigene-anticorpo.

Test ELISA

Test ELISA: permette di riconoscere in modo veloce un anticorpo o un antigene. Si possono fare in laboratorio ma ci sono anche autotest.

L’identificazione dell’anticorpo permette di rivelare l’avvenuta esposizione.

L’identificazione dell’antigene permette di rivelare la presenza dell’agente patogeno nel soggetto. Ci sono test diretti che usano un solo anticorpo e test indiretti che usano due anticorpi.

Test per riconoscere l’anticorpo (sierologico). Si usa sempre il metodo indiretto. Metto a contatto il siero del paziente con un antigene conosciuto: se c’è l’anticorpo, questo si lega a un epitopo del mio antigene. Per visualizzare la reazione uso un anticorpo secondario, che riconosce una porzione di anticorpo che è legato ad un enzima che reagisce. Mettendo il substrato, se l’anticorpo è presente si sviluppa colore. Ci sono sfumature di colore diverse in base a quanti anticorpi sono legati, quindi in base alla concentrazione di anticorpi.

Test per riconoscere l’antigene (antigenico). Utilizzo degli anticorpi (uno o due) che possono legare l’antigene di mio interesse e che sono già coniugati con un enzima. Se l’antigene è presente avrò la reazione e si svilupperà colore. Se non c’è l’antigene che tiene ancorato tutto il complesso, non vedrò alcun segnale perché l’enzima non reagisce.

Test ELISA a sandwich: per ricercare solo gli antigeni. Può essere diretto o indiretto, in base a quanti anticorpi utilizzo.

Un primo anticorpo immobilizzato su una fase solida riconosce un epitopo dell’antigene e un secondo anticorpo riconosce un altro epitopo diverso. L’anticorpo secondario è legato ad un enzima: mettendo un substrato se l’antigene è presente, si svilupperà colore.

I test usa e getta sono tendenzialmente ELISA sandwich: nella zona di applicazione ho un anticorpo 1 che è marcato e liofilizzato. Questo anticorpo riconosce l’epitopo 1 dell’antigene e costituisce la banda di controllo. Inserisco il siero o saliva trattata nell’applicatore: il liquido del campione trascina gli anticorpi e il possibile antigene lungo la barretta all’interno del dispositivo. In mezzo c’è la banda del test che riconosce l’epitopo 2. C’è poi un terzo anticorpo che riconosce l’anticorpo 1. Faccio avvenire la corsa: se la linea di controllo non esce, il test è nullo. Nel test di gravidanza esce nullo anche se la concentrazione è troppo bassa. Se l’antigene è assente, il test è negativo e avrò una banda sola, quella di controllo. Se invece l’antigene è presente avrò due bande, in quanto l’antigene viene trasportato e riconosciuto dall’anticorpo 2.

Saggio immunologico competitivo: si fa per cercare analiti a basso PM o bassa concentrazione. La positività esce quando la banda colorata sparisce.

Si fa ad esempio per l’analisi delle droghe. Se non è presente la droga, tutti gli anticorpi saranno occupati dall’antigene marcato che ho aggiunto e vedrò sviluppo di luce o colore. Se è presente la droga, l’antigene naturale spiazza l’antigene marcato perché ha concentrazioni maggiori e il segnale diminuisce.

Valori di riferimento e attendibilità

Per i test quantitativi è necessario stabilire i valori di riferimento o valori di normalità, cioè cut-off quantitativi, che sono riferiti alla popolazione sana. Per definire la normalità dei valori si effettuano analisi su un numero elevato di soggetti sani e si riportano i risultati in un grafico di distribuzione ad aspetto gaussiano con gli angoli laterali simmetrici alla media.

Criteri di partizione: numero di soggetti sufficientemente elevato, in buono stato di salute, età, sesso, fattori ambientali, altri fattori biologici: variazioni crono-biologiche.

Criteri di esclusione: malattie sistemiche e disordini fisiopatologici, assunzione di agenti farmacologicamente attivi, es. terapia farmacologica contraccezione orale, tossicodipendenza alcolismo e tabagismo, modificazione dello stato fisiologico: gravidanza esercizio fisico intenso assunzione di cibo prima del prelievo, esposizione a fattori di rischio.

Il range di normalità viene individuato con calcoli statistici tramite metodi parametrici e non parametrici.

Con i metodi non parametrici calcolo l’intervallo del 95% utilizzando la mediana in questo caso i valori risultanti non provengono da una popolazione di riferimento, ma sono elencati in ordine crescente/decrescente.

Si preferisce il metodo parametrico che è rappresentato dalla distribuzione gaussiana a campana: i valori misurati sono distribuiti quasi simmetricamente a destra e a sinistra, rispetto a un valore centrale, e si determinano la media ossia il valore centrale e la deviazione standard (DS); l’intervallo centrale viene definito come “media–2DS” e “media+2DS”.

L’attendibilità di un metodo analitico indica la qualità del risultato ottenuto. I fattori che concorrono a determinare l’attendibilità di un test dipendono dal metodo analitico utilizzato (sensibilità, specificità e accuratezza) e dall’efficienza analitica del laboratorio (l’abilità dell’operatore e il corretto funzionamento della strumentazione).

La sensibilità analitica, cioè la minima quantità di analita rilevabile nel campione in esame. Molto utile nel marker tumorali.

La specificità analitica, è la capacità del metodo di rilevare l’analita oggetto di indagine, senza che questo abbia subito interferenze.

Il personale di laboratorio garantisce il controllo di qualità dei risultati che presuppongono l’accuratezza analitica e la precisione. Un metodo analitico è accurato quando i risultati ottenuti si avvicinano a quelli determinati mediante un metodo di riferimento, mentre è preciso quando i risultati ottenuti convergono su un valore medio, che si basa sulla concordanza tra misure ripetute dello stesso campione.

L’obbiettivo di un test in biochimica clinica è misurare correttamente la presenza e la concentrazione degli analiti di interesse, fornendo una stima del valore ideale.

Un errore casuale o accidentale, è rappresentato dallo scostamento del valore finale dalla media di diverse misurazioni effettuate sullo stesso campione. Questo tipo di errore dipende da fattori imponderabili, ma si può individuare ripetendo le misurazioni e facendo un’analisi statistica dei dati raccolti.

Un errore sistematico, è la tendenza di un metodo analitico a sovrastimare o sottostimare il vero valore dell’analita in esame e potrebbe portare all’inaccuratezza dell’analisi, ma si può individuare e controllare. Questo tipo di errore ha delle cause definite:

• Limite del metodo —> scarsa specificità/sensibilità dei reagenti utilizzati.
• Una non corretta esecuzione dello stesso —-> strumentazione non correttamente calibrata.

Un errore grossolano viene commesso quando un metodo analitico non viene applicato correttamente e può essere prevenuto grazie a una buona organizzazione del laboratorio, seguendo tutte le procedure operative standard.

Sensibilità e specificità diagnostica

Un test di laboratorio deve saper distinguere i soggetti affetti da una malattia rispetto ai soggetti sani e, a tale scopo, deve avere una sensibilità diagnostica e una specificità diagnostica.

La sensibilità diagnostica di un test è la probabilità che il test sia positivo, posto che l’individuo sia malato; rappresenta la proporzione di soggetti con la malattia che sono risultati positivi al test.

La specificità diagnostica è la probabilità che il test sia negativo, posto che l’individuo sia sano; rappresenta la proporzione di soggetti senza la malattia che sono risultati negativi al test:

Per conoscere il reale contributo diagnostico di un test di laboratorio, si utilizzano anche i parametri di predittività positiva e negativa.

Il valore predittivo positivo (VPP) è la probabilità che il soggetto sia malato qualora sia positivo al test; è un valore che indica quanti dei soggetti positivi al test sono realmente malati.

Il valore predittivo negativo (VPN) è la probabilità che il soggetto sia sano qualora sia positivo al test; indica quanti dei pazienti che risultano negativi al test sono realmente sani:

Il cut-off è il valore discriminante tra malati e non malati. Nel test ideale con elevata sensibilità e specificità, non c’è sovrapposizione tra le due popolazioni (sani e malati): tutti i sani hanno un test negativo e tutti i malati hanno un test positivo. In un test reale c’è sempre una sovrapposizione tra le due distribuzioni e per questo si hanno falsi positivi e falsi negativi.

Se ho un’ottima sensibilità, ho basso rischio di falsi negativi. Se ho un’ottima specificità ho un basso rischio di falsi positivi. Per deter