Analisi strumentale dei farmaci

Analisi strumentale

Mentre le analisi quantitative sfruttano reazioni chimiche in cui l’analita reagisce con un opportuno reagente, le analisi strumentali sfruttano la misura di proprietà fisiche tipiche dell’analita, come la conducibilità, l’assorbimento e/o l’emissione di radiazioni elettromagnetiche, la misura del rapporto carica/massa, ecc., per riconoscerlo. L’evoluzione tecnologica ha consentito anche lo sviluppo di apparecchiature che, sfruttando tecniche cromatografiche ad alta efficienza (es. HPLC, UPLC) ed elettroforetiche (CE), hanno permesso la separazione ottimale di analiti da miscele estremamente complesse.

Definizione di cromatografia e parametri cromatografici

Secondo la definizione IUPAC, la cromatografia è “un metodo fisico di separazione, in cui i componenti da separare sono distribuiti tra due fasi, una delle quali è stazionaria (nome comune per indicare il materiale di riempimento della colonna, o lo strato depositato sul supporto planare), mentre l'altra si muove in una direzione definita - fase mobile o eluente (un liquido, un gas o un fluido supercritico che scorre continuamente attraverso la colonna) - trasportando gli analiti, ovvero le specie chimiche da separare, lungo una colonna cromatografica”.

I componenti più fortemente trattenuti dalla fase stazionaria si muovono lentamente lungo la colonna cromatografica al fluire della fase mobile, mentre i componenti che vengono trattenuti debolmente dalla fase stazionaria si muovono velocemente, perché hanno maggiore affinità per la fase mobile. La dispersione delle molecole lungo la colonna cromatografica (che come vedremo dipende dall’EFFICIENZA della colonna, vedi dopo), dovuta alla diversa velocità di migrazione dei componenti della soluzione, genera una banda di eluizione di tipo gaussiano, il cui apice rappresenta la velocità media del soluto. Tale banda di eluzione è denominata picco cromatografico.

Tipologie di eluizione della fase mobile

• Eluizione isocratica: Quando la fase stazionaria è in grado di trattenere in maniera differenziata gli analiti, con tempi di ritenzione accettabili, senza la necessità di variare la composizione della fase mobile (la quale rimane costante per tutto il tempo dell’eluizione). Con una fase mobile debole, i soluti che interagiscono debolmente con la fase stazionaria vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali, mentre quelli che interagiscono fortemente con la fase stazionaria eluiscono con tempi di ritenzione eccessivi (con un notevole allargamento dei picchi); con una fase mobile forte, i soluti che interagiscono debolmente con la fase stazionaria eluiscono rapidamente, con tempi di ritenzione troppo ridotti, mentre quelli che interagiscono fortemente con la fase stazionaria eluiscono con tempi di ritenzione normali.
• Eluizione a gradiente: Quando gli analiti da separare presentano un’elevata affinità per la fase stazionaria, in condizioni isocratiche eluiscono - come detto - in tempi lunghissimi. In questo caso, pertanto, è più conveniente procedere con un’eluizione di tipo a gradiente, ovvero con un’eluizione in cui viene variata, di momento in momento, la composizione della fase mobile (concentrazione tampone o variazioni del pH). Con una fase mobile a gradiente di polarità, si ottiene un’eluizione con tempi di ritenzione ottimali per tutti i soluti.

Oltre alla migrazione differenziale dei vari analiti (separazione cromatografica), il processo cromatografico determina un allargamento della banda di ogni analita, rispetto alla sua larghezza iniziale, man mano che il grafico viene generato. L’entità dell’allargamento è funzione del tempo che il soluto trascorre nella colonna (maggiore è il suo tempo di ritenzione, maggiore sarà l'allargamento della banda). In definitiva, la cromatografia comprende un gruppo di metodologie analitiche che permettono la separazione, l’identificazione (analisi qualitativa) e la determinazione quantitativa (analisi quantitativa) di singoli componenti presenti in miscele complesse (es. formulazioni, campioni biologici, estratti vegetali), ma anche l’identificazione di materie prime e impurezze in matrici semplici.

Parametri cromatografici

• Capacità, selettività, efficienza (numero di piatti teorici), risoluzione e asimmetria dei picchi.
• Fattore di capacità o ritenzione (k’): Il parametro più significativo per descrivere la velocità di migrazione di un soluto lungo la colonna cromatografica (ovvero in che misura l’analita viene ritardato dalla fase stazionaria, e dunque la sua distribuzione tra le due fasi) è il fattore di capacità (k’), il quale esprime il tempo di ritenzione (t_R) di un soluto in funzione del tempo morto (t₀ o t_M). t_R è il tempo necessario ad un analita per eluire da una estremità all’altra della colonna (ed essere “rivelato” dal detector). In altre parole, è il tempo che intercorre tra il momento di immissione dell’analita nel sistema (tempo zero, t₀) e il momento in cui il rivelatore registra l’apice del picco; t₀ è invece il tempo di ritenzione di un analita non trattenuto dalla fase stazionaria, e che pertanto fluisce alla stessa velocità della fase mobile. In definitiva, k’ è un importante parametro sperimentale utilizzato per confrontare la velocità di migrazione dei soluti nelle colonne cromatografiche. Il fattore di ritenzione NON dipende dalla geometria della colonna o dal flusso del solvente, cioè della fase mobile (per una data combinazione soluto/fase mobile/fase stazionaria, qualsiasi colonna di qualsiasi dimensione, operante con qualsiasi flusso, dunque, produrrà lo stesso fattore di ritenzione), bensì dalla temperatura, dall’impaccamento, dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria. Il valore di k’ è un parametro su cui si può intervenire per migliorare la separazione di due picchi sovrapposti (risoluzione, vedi dopo).
• Fattore di selettività (α): Costituisce la base del processo di separazione cromatografica ed è strettamente legata alla differenza dei tempi di ritenzione di analiti diversi (k’), i quali, come già accennato, hanno una diversa velocità di migrazione lungo la colonna cromatografica. La selettività verso due analiti di un sistema cromatografico viene così espressa: Dove: t_R = tempo di ritenzione; t₀ = tempo morto; k’ = fattore di ritenzione. La selettività, in definitiva, dipende dal tipo di interazione che l’analita instaura con le due fasi (mobile e stazionaria) e deve essere > 1,2. Da sola, tuttavia, non è sufficiente per una buona risoluzione cromatografica se i picchi sono talmente larghi da sovrapporsi (vedi oltre risoluzione).
• Efficienza (N): Il parametro più semplice con cui esprimere l’efficienza di una colonna cromatografica è la larghezza alla base del picco (w_b), che in genere è diversa per ogni specie chimica. Può anche venire espressa con il cosiddetto Numero di piatti teorici (N), un concetto preso in prestito dalla teoria della colonna di distillazione. Si può infatti immaginare che una colonna cromatografica, come una di distillazione, sia suddivisa idealmente in tante «zone» (piatti teorici), in ognuna delle quali si instaura un equilibrio tra l’analita, la fase stazionaria e quella mobile.
• Il tratto di colonna nel quale si realizza una condizione “corrispondente” ad uno stato di altezza equivalente di un piatto teorico (HETP o H), espressione anch’essa mutuata dalla teoria delle colonne di frazionamento per distillazione, data l’analogia tra il processo di distillazione frazionata e il processo di ripartizione cromatografica, entrambi utilizzati per separare i componenti di una miscela (è tuttavia importante sottolineare che, a differenza della colonna di distillazione, i piatti non esistono realmente all’interno della colonna, ma sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo). HEPT = L/N Dove: L = Lunghezza della colonna; N = Numero dei piatti teorici. L’efficienza di una colonna, in definitiva, aumenta all’aumentare del numero dei piatti: tanto maggiore è N, tanto più è stretto il picco sul cromatogramma (cioè è minore il valore di H), tanto più si avranno separazioni migliori (migliore risoluzione): Aumentando la lunghezza della colonna aumentano i piatti, MA AUMENTANO ANCHE i tempi di ritenzione e la larghezza dei picchi (con il quadrato della lunghezza della colonna) di ogni singolo analita, che può causare una sovrapposizione con altri analiti.

Il concetto del piatto teorico fu inizialmente sviluppato da Martin e Synge. La teoria dei due ricercatori NON metteva però in relazione le prestazioni della colonna ad importanti parametri, come la dimensione delle particelle della fase stazionaria, i coefficienti di diffusione, la velocità del flusso, la temperatura e la viscosità del solvente. Fu dunque successivamente sviluppata la cosiddetta Rate Theory da Lapidus e Amundson (1952), poi ulteriormente perfezionata ed estesa da Van Deemter, divenendo finalmente utile per progettazione di colonne, fasi stazionarie e strumentazioni cromatografiche. Questa teoria individua 3 fattori che partecipano all’allargamento delle bande: i) Percorsi multipli e Diffusione di flusso; ii) Diffusione molecolare longitudinale; iii) Resistenza al trasferimento di massa tra/nelle fasi.

L’equazione sviluppata da Van Deemter correla H con la Velocità lineare della fase mobile (ū) e descrive così l’Efficienza della colonna: H = A + B/ū + C ∙ ūx x Tale equazione può essere considerata la combinazione lineare di 3 equazioni più semplici:

• H = A, dove A (Eddy Diffusion) è associato ai Percorsi multipli e alla Diffusione di flusso. ū Il valore del parametro A può essere espresso come: Column Ciò significa che la Eddy Diffusion dipende dalla regolarità del packing ed è direttamente proporzionale al diametro delle particelle di fase stazionaria (a velocità sufficientemente elevate del flusso è indipendente da esso). Per minimizzare il valore di A, dunque, occorre ridurre il diametro delle particelle della fase stazionaria e la loro distribuzione granulometrica, oltre a migliorarne l’impaccamento. Dato che porosità e impaccamento della fase stazionaria non sono perfettamente uniformi, si possono realizzare percorsi a diversa lunghezza che possono essere attraversati dall’analita. Questo comporta che le molecole, pur partendo insieme, percorrano distanze diverse e arrivino al detector in tempi diversi, provocando un allargamento della banda (il flusso è più veloce al centro e lontano dalla particelle della fase stazionaria): Due sono le soluzioni teoricamente possibili: utilizzare particelle molto piccole, in modo che i vari percorsi possibili risultino poco differenti, oppure utilizzare particelle con granulometria costante. La soluzione migliore è quella di usare granuli quanto più omogenei possibili e dimensioni tali da non causare problemi all’apparecchiatura cromatografica.
• B: è associato alla Diffusione Molecolare Longitudinale, un parametro che descrive lo spostamento in direzione longitudinale delle molecole della sostanza, sia nel senso di scorrimento della fase mobile, sia in quello opposto. B è riassunta dall’espressione: /ū H = 2 g D x B_M fattore di tortuosità E’, ovvero, direttamente proporzionale a g, il , che dipende dall’impaccamento della colonna (vale a dire dalla geometria degli spazi disponibili per la fase mobile, ovvero dalla distribuzione e dal diametro delle particelle della fase stazionaria), e a D_M, il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile, un parametro che riassume tutte le caratteristiche che influenzano la sua resistenza alla diffusione: densità e viscosità. Per ridurre il valore di g occorre usare particelle di dimensioni uniformi (ma non necessariamente piccole); in questo modo, infatti, l’impaccamento risulta più compatto e si riducono gli spazi in cui la fase mobile può consentire il fenomeno della diffusione longitudinale. Al contrario, dimensioni diverse delle particelle lasciano disponibili larghe zone alla fase mobile, con la possibilità di dar luogo a consistenti diffusioni. B è inversamente proporzionale, invece, alla velocità lineare media di flusso della fase mobile, ū (maggiore è la velocità, cioè, minore è il tempo disponibile alla diffusione longitudinale). Per minimizzare la diffusione molecolare longitudinale, dunque, si suggerisce, come già detto, di aumentare il flusso e la viscosità dell’eluente (nella GC la viscosità del gas carrier). H è di scarsa importanza nella LC, perché i coefficienti di diffusione nei liquidi sono bassi, ma è molto importante nella GC per via dei valori elevati dei coefficienti di diffusione nei gas.
• C: è associato alla Resistenza al trasferimento di massa e il suo contributo al valore di H (cioè all’altezza del piatto teorico) è il più importante, dato che cresce costantemente con il flusso della fase mobile. In pratica, più è veloce la fase mobile, minore è il tempo che ha l’analita per equilibrarsi tra le due fasi (stazionaria e mobile), con un conseguente allargamento della banda. Il valore complessivo del termine C è fornito dall’equazione: C = C_S + C_M Dove C_S è il contributo relativo alla fase stazionaria e viene a sua volta espresso dalla relazione: H C = Q ∙ U ∙ D ∙ ū / D_f² S Dove: Q è un fattore legato alla disomogeneità della fase stazionaria; U è la costante relativa alla velocità di migrazione del soluto dalla fase stazionaria alla fase mobile (dipende dall’antagonismo tra le interazioni soluto-fase stazionaria e dalle interazioni soluto-fase mobile); D è lo spessore della fase legata presente sul supporto solido; D è il coefficiente di diffusione del soluto nella fase stazionaria. S f² D e D riducono la frequenza media alla quale le molecole di analita dalla fase stazionaria raggiungono l’interfaccia con la fase mobile, dove potrà avvenire il trasferimento verso la fase eluente. In film spessi, dunque, le molecole dovranno viaggiare di più per raggiungere la superficie, e se hanno anche coefficienti di diffusione piccoli si sposteranno ancora più lentamente. La minore velocità di trasferimento causerà un incremento dell’altezza del piatto. Il trasferimento di massa in fase stazionaria, dunque: dipende dal diametro e dalla forma delle particelle di fase stazionaria; dipende dalla velocità di migrazione (desorbimento o partizione) del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile; è direttamente proporzionale al quadrato dello spessore del film sulle particelle di supporto; è inversamente proporzionale al D del soluto nella fase stazionaria; è direttamente proporzionale alla velocità lineare del flusso della fase mobile.

C è il contributo relativo alla fase mobile e viene a sua volta espresso dalla relazione: H C = w ∙ d ∙ ū / D_p² ∙ M Dove: w è una costante che dipende dall’impaccamento e dal diametro della colonna; d è il diametro medio delle particelle della fase solida; D è il coefficiente di diffusione nella fase mobile. Il trasferimento di massa in fase mobile, dunque: dipende dal diametro della colonna; è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle; è direttamente proporzionale alla velocità del flusso; è inversamente proporzionale al D del soluto nella fase mobile.

L’Efficienza di una colonna può dipendere da fattori relativi alla colonna o da fattori extra-colonna (max 10%). In un cromatografo, oltre alla colonna, infatti, sono presenti tubi di connessione, giunzioni della linea di flusso della fase mobile che generano fenomeni di turbolenza o di diffusione longitudinale. L’effetto finale è un allargamento del picco cromatografico, che risulta proporzionale al volume dei circuiti entro i quali passa la fase mobile, e quindi anche alla lunghezza dei tubi di connessione e ad eventuali volumi morti. All’allargamento della banda concorrono in definitiva numerosi fattori che possono essere così riassunti: W_T = W_j + W_f + W_e + W_d + W_c Dove: W_T = larghezza totale del picco; W_j = allargamento dovuto ai volumi morti e alla dispersione del soluto nell’iniettore; W_f = allargamento dovuto alle connessioni dopo l’iniettore e prima del detector; W_e = allargamento dovuto ai capillari di connessione iniettore/colonna e colonna/detector; W_d = allargamento dovuto al detector; W_c = allargamento dovuto alla colonna.