Analisi dei farmaci (medicinali)

Farmacopea italiana (XII) e Farmacopea europea (EP X)

• La X edizione italiana (1998) è l’ultima che riporta le monografie delle sostanze; dalla XI ed. (2002) le monografie sono contenute nella Farmacopea Europea (dalla IV ed. del 2002).
• La farmacopea è un codice farmaceutico, cioè un complesso di disposizioni tecnico/scientifiche ed amministrative, rivolte a permettere il controllo della qualità dei medicamenti, delle sostanze e/o dei preparati finali, mediante l'indicazione di metodi di verifica analitica e tecnologica delle specifiche di qualità, dei metodi di preparazione o della formulazione. Contiene inoltre le disposizioni opportune e necessarie a regolare l'esercizio della farmacia.
• È un elenco ufficiale in cui sono registrati i nomi di tutti i preparati medicinali in uso, con la descrizione delle loro formule, dei requisiti analitici, dei metodi di preparazione.

Applicazioni della farmacopea

Applicazioni della farmacopea (soprattutto analitiche)

• Controllo analitico di una materia prima: analisi diretta o dopo reazione con un gruppo funzionale, analisi elementare e metodi spettrofotometrici, metodi separativi,...
• Analisi di formulazioni farmaceutiche: compresse, creme, unguenti, supposte, sciroppi, soluzioni oleose.
• Analisi di formulazioni multicomponenti.
• Analisi di prodotti naturali.
• Analisi delle impurezze: origine delle impurezze, determinazione delle impurezze.

• La Farmacopea Ufficiale della Repubblica Italiana risulta costituita dai testi della Farmacopea Italiana XII edizione nonché dai testi della IX edizione della Farmacopea Europea e successivi supplementi, recepiti direttamente in lingua inglese e francese.
• La XII edizione della FU rimane lo strumento di supporto per il SSN sia in relazione al processo di autorizzazione all’immissione in commercio dei generici che per quanto riguarda l’attività preparatoria delle farmacia ospedaliere e private.
• L’obiettivo della Farmacopea Ufficiale è la promozione della salute pubblica mediante la messa a punto di norme comuni riconosciute e che devono essere utilizzate dal personale sanitario e da chi coinvolto con la qualità dei Medicinali. Tali norme o specifiche debbono essere appropriate a costituire la garanzia in materia di sicurezza d’uso dei medicinali per i pazienti e consumatori.
• La Farmacopea Europea contiene le monografie delle sostanze per uso farmaceutico e le loro caratteristiche, nonché i requisiti di qualità cui esse devono soddisfare.
• Contiene inoltre delle monografie generali sulle modalità di preparazione e sulle metodologie analitiche da utilizzare per i preparati farmaceutici.
• Le monografie della Farmacopea Europea fanno parte integrante delle Farmacopea Ufficiale Italiana XII Edizione e come tali hanno valore di legge.
• Nel laboratorio di analisi dei farmaci è il testo di riferimento per l’operatore per l’esecuzione del metodo analitico nel riconoscimento del medicamento.
• Nella Farmacopea Europea (E.P. X ed.) sono presenti diversi tipi di sostanze (sostanze incluse in monografie) che possiamo sommariamente classificare in:

1. Organiche;
2. Inorganiche;
3. Metallo-organiche;
4. Sali inorganici di basi organiche.

(Guarda contenuti farmacopea slide 13-16)

Tipi di sostanze F.U.

1. Sostanze solide

a. Inorganiche. Formate da cationi e anioni. Ad es. Alluminio fosfato (AlPO4), Calcio cloruro (CaCl2), Zinco cloruro (ZnCl2), Potassio solfato (K2SO4), Bario solfato (BaSO4), ecc.

b. Metallo-organiche. Sono sali in cui la componente organica acida viene salificata con opportuni cationi metallici quali: Al³⁺, Ag⁺, Ba²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Ca²⁺, NH4⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, K⁺, Na⁺, Li⁺.

c. Organiche: sono a loro volta suddivisibili in:

• Molecole semplici (es. acido acetilsalicilico, caffeina, isoniazide, ecc..);
• Sali formati da un catione ed un anione entrambi organici (ad es. pentazocina lattato, piperazina citrato, ecc.). A volte si tratta anche di principi attivi in cui la funzione ossidrica –OH è stata esterificata con acido opportuno a formare l’estere corrispondente (es. estradiolo benzoato, betametasone acetato, ecc.).
• Sali inorganici di basi organiche. Sono sali nei quali la componente organica basica (es. ammine) viene salificata con opportuni anioni inorganici quali: Cl^-, Br^-, F^-, CO3^2-, SO4^2-, PO4^3-, NO3^-, BO3^3-, B4O7^2- (cloridrati, bromidrati, solfati, etc..). Questo si fa perché le basi organiche sono liquide e la loro salificazione con acidi inorganici produce sostanze solide.

• Per le sostanze puramente inorganiche si rimanda al Cap. 2 per i saggi specifici di analisi inorganica per cationi ed anioni.
• Per le sostanze metallo-organiche la presenza del metallo, già ipotizzata al saggio della combustione (coccio) dalla permanenza di un residuo non carbonioso (saggi preliminari) sarà confermata dai saggi specifici del Cap. 2, mentre la componente organica verrà riconosciuta con i saggi del Cap.3 relativi ai gruppi funzionali e poi con i saggi specifici (Cap. 4). I metallo-organici sono generalmente solubili in acqua e di solito danno soluzioni non colorate (tranne qualche eccezione: fenilmercurio acetato (bianco giallastro), fenilmercurio borato (giallino), ferro-gluconato (giallo-verde) ed il ferro-fumarato (rosso-arancio).
• Per i sali inorganici di basi organiche, i rispettivi anioni (cloruri, bromuri, solfati, fosfati, carbonati, nitrati, ecc.) saranno riconosciuti con saggi specifici del Cap. 2. con l’analisi inorganica, mentre la componente organica verrà riconosciuta con i saggi del Cap.3.

2. Sostanze liquide

a. Sostanze singole (pure o no)

b. Miscele (olii essenziali)

Fasi fondamentali dell’analisi

Si suddividerà l’analisi in tre fasi fondamentali:

1. Saggi preliminari: servono a individuare caratteristiche generali di comportamento per indirizzare la ricerca verso un gruppo più ristretto di composti (es. se inorganico, organico oppure metallo-organico);
2. Identificazione dei gruppi funzionali: che consente di individuare la categoria di composti organici alla quale appartiene la sostanza (es.acidi, amine, alcoli, etc.). Saggi chimici specifici e selettivi anche strumentali (spettroscopia);
3. Riconoscimento dell’identità della molecola: mediante saggi chimici specifici e caratteristiche individuali (indice di rifrazione, punto di fusione-solo se la sostanza è organica, etc.)

Tipi di reazioni chimiche coinvolte nei saggi di riconoscimento

Tipi di reazioni chimiche coinvolte nei saggi di riconoscimento (anche combinazioni di più reazioni):

1. Reazioni di precipitazione;
2. Reazioni di complessazione;
3. Reazioni di formazione di addotti colorati (SE aromatica, condensazioni o combinazioni varie);
4. Ossidoriduzione.

1. Reazioni di precipitazione

Reazioni che avvengono normalmente in acqua e in cui si ha la formazione di sali con solubilità minore. Si tratta di reazioni nelle quali avviene uno scambio di ioni, in determinate condizioni di concentrazione, pH e T°, a formare specie chimiche con un Kps diminuito e, quindi, atti a precipitare. I precipitati sono colorati o bianchi e possono avere “consistenze” differenti.

2. Reazioni di complessazione

Si tratta di reazioni di formazione di un complesso stabile tra l’agente complessante (legante) e un accettore di legami (un metallo-acido di Lewis). Si instaurano un certo numero di questi legami che definiscono il cosiddetto “n. di coordinazione”. A seconda della natura del legante e del numero di accettori si dividono in complessi:

• Carichi (positivi o negativi)
• Neutri
• Mononucleare (solo un accettore)
• Polinucleare (più di un accettore)
• Chelato (più legami tra il chelante e l’accettore)

3. Reazioni di formazione di addotti colorati

Si tratta di reazioni (addizioni, sostituzioni, condensazioni,...) di formazione di una struttura chimica generalmente più coniugata rispetto il substrato di partenza, per cui c’è un aumento di delocalizzazione di carica che comporta un abbassamento del livello energetico eccitato(*) degli elettroni π (π*) di legame, con conseguente abbassamento della differenza di energia richiesta per la transizione elettronica tra i due livelli (fondamentale ed eccitato). In questo modo viene a diminuire l’energia emessa durante il decadimento elettronico e, quindi, ci sarà uno spostamento verso il visibile (UV) della lunghezza d’onda sotto forma di colore osservato.

Estensione di coniugazione per due anelli aromatici. Si parte da due molecole solubili in acqua e si forma un ppt giallo insolubile.

4. Reazioni di ossidoriduzione

Sono reazioni che avvengono tra due specie chimiche che scambiano elettroni: una specie subisce un’ossidazione, l’altra specie subisce una riduzione.

• Saggio di riconoscimento gruppi aldeidici (carboidrati): si sfrutta la facile ossidabilità del gruppo aldeidico presente in vari composti (come nei carboidrati aldosi) utilizzando un blando ossidante che è il complesso dei reattivi di Fehling (CuSO4+Tartrato di K preparato al momento) per dare un prodotto di riduzione del rame come ossido rameoso (Cu2O) in forma di ppt rosso mattone.

Bilanciamento

Bilanciamento: ricordarsi che in composti organici il n. di ossidazione del C (ma non solo) è dato per differenza dei 4 legami che forma e si assume che:

• Per ogni legame con un altro atomo di C= 0
• Per ogni legame con un atomo di H= -1
• Per ogni legame con eteroatomo = +1

Qualche altro esempio di bilanciamento di reazioni organiche:

Importante: generalmente le ossidazioni portano all’addizione di un atomo di ossigeno così come le riduzioni ad un’addizione di idrogeno:

In realtà anche altri eteroatomi addizionati possono portare ad un’ossidazione e una riduzione non sempre porta ad un’addizione di idrogeno, ciò perché i due termini sono riferiti allo stato dell’atomo di carbonio (o altro atomo) in questione. Es. alogenazione alcheni:

Tecniche di isolamento e purificazione

Separazione di miscele

Le tecniche di separazione non sono dei veri e propri metodi analitici, ma sono di notevole importanza in chimica analitica ed di sintesi chimica, in quanto spesso l’applicazione di una qualunque tecnica strumentale (e non) di determinazione deve essere preceduta da un metodo di separazione parziale o totale dell’analita, in modo da ottenere un composto puro!! La scelta della tecnica separativa dipenderà dal tipo di miscela e dal componente da separare. Le miscele (o miscugli) possono essere costituite da componenti liquidi, solidi o gassosi e si possono dividere in due tipi:

1. Miscele omogenee
2. Miscele eterogenee

Al primo tipo corrispondono quei sistemi nei quali i componenti non sono più distinguibili e si presentano in un’unica fase: si definisce soluzione. Possono essere soluzioni solide, liquide o gassose:

• Solida (leghe metalliche – es.bronzo)
• Liquida (acqua + NaCl)
• Gassosa (aria atmosferica)

Al secondo tipo appartengono quelle miscele i cui componenti differiscono per proprietà chimico/fisiche e/o stato di aggregazione della materia e i componenti risultano ancora facilmente distinguibili.

• Schiume (gas+solido, gas+liquido)
• Sospensioni (solido+liquido)
• Emulsioni (liquido+liquido)

Miscele omogenee e miscele eterogenee

Miscele omogenee Miscele eterogenee

• a) Estrazione f) Evaporazione
• b) Cristallizzazione g) Filtrazione
• c) Distillazione h) Centrifugazione
• d) Sublimazione
• e) Cromatografia

A. Estrazione con solvente

La distribuzione di un soluto fra due liquidi completamente o parzialmente immiscibili costituisce la base dei procedimenti di estrazione con solvente. Il processo di estrazione è regolato dalla: “Legge di Nerst: legge di distribuzione o di partizione” Quando ad un sistema costituito da due fasi (strati) immiscibili o debolmente miscibili fra di loro e si aggiunge una terza sostanza solubile in entrambe, questa si distribuisce in modo tale che il rapporto della sua concentrazione nei due strati risulti costante a temperatura costante.

L’estrazione mediante il solvente B della sostanza X disciolta in A è tanto più efficace, quanto maggiore è il coefficiente di ripartizione (K): Cb Ca.

• K >1 significa >Cb<Ca
• K < 1 significa

Il coefficiente di ripartizione è una costante, e approssimativamente uguale al rapporto della solubilità della sostanza nei due solventi. Il coefficiente K può essere influenzato dal pH o dalla presenza di elettroliti.

Tra i due solventi uno è sempre acqua, dunque se vado a toccare il pH la sostanza può presentarsi o in una forma dissociata o indissociata e quindi diventa più o meno solubile nel solvente acquoso o viceversa in quello organico, immiscibile con l’acqua stessa. Serve per isolare soluti organici di natura acida o basica andando ad influenzare il pH dell’acqua e favorendo l’estrazione di una componente o dell’altra a seconda del pH che io utilizzo per la fase acquosa.

L’estrazione può essere di 2 tipi: o un’estrazione con il solvente acquoso o estrazione con il solvente organico; questo dipende da dove è disperso inizialmente il mio soluto da purificare. Quindi se è disperso nell’acqua e lo voglio isolare utilizzerò il solvente organico; viceversa se è disperso in un solvente organico e voglio utilizzare l’acqua per estrarlo.

Esempio di influenza di K dalla presenza di elettroliti

Ad es. l’aggiunta di NaCl alla soluzione acquosa (si usa direttamente una soluzione acquosa di NaCl fortemente satura già preparata) ne abbassa la solubilità dei composti organici in essa presenti che a volte formano sistemi colloidali tra le due fasi e, quindi, tali composti risulteranno meglio ripartiti nella fase organica che sarà più facilmente separabile (salting out).

Metodologie estrattive liquido-liquido

a) Estrazioni in discontinuo: l’estrazione in discontinuo liquido-liquido si effettua con l’ausilio di imbuti separatori.

1. Il solvente contiene una miscela di 2 molecole diverse (palline bianche e nere) che si desidera separare.
2. Si aggiunge un secondo solvente (azzurro) immiscibile con il primo e si agita energicamente l’imbuto tappato. Si lascia stratificare.
3. Si separano i due strati che conterranno le molecole parzialmente separate.

https://www.youtube.com/watch?v=EFiFPoOzqtk

b) Estrazioni in continuo (non usato): l’estrazione in continuo liquido-liquido si effettua con l’ausilio di un sistema raccordato ad un refrigerante, contenente la soluzione acquosa da estrarre, mentre il solvente estraente viene posto in un pallone collegato e viene riscaldato. I vapori del solvente estraente vengono condensati e ricadono nel sistema contenete la soluzione da estrarre. In questo momento avverrà l’estrazione del soluto (ripartizione) e la colonna di acqua sovrastante forzerà il solvente a ritornare nel pallone originale per ricominciare il ciclo.

Composti poco solubili in acqua possono essere estratti con etere etilico o esano, viceversa se trattasi di sostanze alquanto idrosolubili si preferirà l’acetato di etile. Di massima importanza risulta la scelta dei solventi di estrazione da impiegare per estrarre certe sostanze.

Serie eluotropica

È in relazione al potere eluente dei solventi nei confronti di una data fase stazionaria. È la misura del calore svolto dall’interazione del solvente con una data fase stazionaria (fissa) e riflette a grandi linee la scala di polarità (dai meno a più polari).

La scelta del solvente di estrazione viene effettuata in base a:

• Bassa tossicità;
• Favorevole coefficiente di ripartizione (K + alto possibile -> soluto che si ripartisce nel solvente che viene scelto);
• Selettività di estrazione rispetto altri componenti (se ho una miscela di soluti che ha natura simile, devo avere la polarità + specifica per il mio soluto);
• Basso P.eb al fine di facilitare il recupero del campione per evaporazione per non snaturare il soluto;
• Elevata differenza di densità per avere una rapida separazione delle fasi.

Schema generico di estrazione con solvente di alcuni soluti ABCD. In questo caso il solvente è organico apolare con all’interno alcuni soluti apolari e il solvente di estrazione è acqua. Si va ad aggiungere una soluzione acquosa acida (HCl dil)-> se c’è qualche soluto a natura basica, viene protonato dall’HCl e si formano i cloridrati idrosolubili e si ripartiscono in acqua. Così viene separato C. Posso poi separare componenti con natura acida che vengono deprotonati con una base debole come il NaHCO3 e poi con una base più forte NaOH. Vengono separati selettivamente con acqua (leggermente o più) basica i componenti a natura acida. Alla fine per esclusione recupero nel solvente organico il solo soluto di natura neutra.

Inconveniente molto comune è la formazione di emulsioni o strutture colloidali, specie in presenza di sostanze molto basiche; tra le soluzioni adottate, quella più comune consiste nell’aggiungere una soluzione satura di NaCl (effetto salting out) in modo da sfavorire l’associazione estraente-acqua. Nel caso di sospensioni di materiale solido più o meno fine, si può filtrare su carta e poi riestrarre nuovamente in imbuto separatore.

Metodologie estrattive solido-liquido

a) Estrazioni in discontinuo: l’estrazione in discontinuo solido-liquido si effettua con l’ausilio di un pallone contenete la matrice solida dalla quale estrarrà l’analita. Il solvente di estrazione