di Le Biotecnologie - Riassunto
Biotecnologie: sono dei metodi che utilizzano delle tecniche, sia tradizionali che innovative, che hanno come base degli organismi viventi per ottenere obbiettivi di vario genere (ese. Miglioramento genetico).
→ biochimica, chimica, biologia molecolare, genetica, microbiologia, ingegneria di processo
→ l'uomo ha cercato da sempre di migliorare la resa dei campi e la qualità degli animali allevati, selezionando i semi delle piante con le caratteristiche migliori e le specie di animali domestici più adatte.
Biotecnologie tradizionali: tecniche produttive usate da millenni → attività casearia, lievitazione, fermentazione
Biotecnologie innovative: si avvalgono di nuovi strumenti basati sulle tecnologie del DNA ricombinante → modificano l'attività di organismi intervenendo sul loro patrimonio genetico
(piante transgeniche, animali geneticamente modificati, clonazione, mappatura del genoma umano).
Batteri → possiedono un cromosoma costituito da una molecola di DNA circolare (nucleotide) lunga 1 mm e contenente un migliaio di geni. Si riproducono in modo asessuato attraverso la scissione binaria originando dei cloni → qualunque manipolazione genetica condotta su di essi viene propagata in brevissimo tempo a miliardi di individui → il singolo individuo ha la possibilità di modificare il proprio patrimonio genetico scambiando o ricevendo frammenti di DNA ad altri batteri attraverso i meccanismi di:
Trasduzione: i batteriofagi infettano un batterio prelevando piccole porzioni di DNA dai cromosomi dell'ospite e trasmettendole a nuove generazioni di virus, queste infettano i nuovi batteri e vi trasferiscono il materiale genetico sottratto ai precedenti batteri ospiti (METODO DI RICOMBINAZIONE GENETICA DEI BATTERI CHE ACCADE IN MODO NATURALE) → possibilità di utilizzare i virus per trasferire intenzionalmente materiale genetico all'interno delle cellule.
Virus: organismi semplici formati dal capside, una struttura di natura proteica, che all'interno contiene RNA. I virus si riproducono sfruttando i cromosomi dei batteri ospiti. (endo parassita obbligato).
Trasduzione generalizzata → nel corso del montaggio delle particelle virali può accadere per errore che in alcune entri il DNA batterico invece di quello virale. I fagi trasducenti quindi contengono solo DNA batterico che all'atto dell'infezione viene iniettato nel batterio ricevente dove si integra per ricombinazione nel suo cromosoma.
Trasduzione specializzata → il DNA della cellula ospite che viene traferito non è scelto a caso ma è specificatamente limitato alla parte del cromosoma ospite contigua al punto di inserzione del batteriofago.
Trasformazione: i batteri acquisiscono direttamente dall'ambiente extracellulare molecole di DNA provenienti da cellule demolite, che integrano stabilmente nel proprio cromosoma. Solo meccanismo di scambio genetico nei procarioti codificato nel cromosoma.
Alcune specie possono acquisire DNA estraneo dall'ambiente (Naturalmente competenti) → alla fine della fase esponenziale di crescita tali specie diventano competenti → la competenza dipende da una proteina detta ''fattore di competenza'' → questa si accumula nell'ambiente extracellulare fino al raggiungimento di una concentrazione-soglia che induce nella cellula batterica la sintesi di specifici recettori di membrana → questi legano il DNA presente all'esterno della cellula e lo trasportano nel citoplasma → dove avviene un evento di ricombinazione e viene integrato il DNA estraneo.
Trasformazione artificiale: molte specie batteriche non naturalmente competenti si possono trasformazione artificialmente in laboratorio con metodi chimici o fisici che permettono alle molecole di DNA di attraversare la membrana rendendola temporaneamente permeabile → il cloruro di calcio favorisce un maggiore assorbimento del DNA estraneo all'interno del DNA batterico.
Elettroporazione: sottoporre a shock elettrico la membrana cellulare per renderla permeabile al passaggio di DNA.
Coniugazione: Processo di riproduzione sessuata che prevede l'unione di due cellule batteriche e il passaggio di DNA da un batterio donatore a uno ricevente → accoppiamento di batteri di sesso diverso e trasferimento unidirezionale del cromosoma dal donatore al ricevente.
- Viene trasferita una sola parte del cromosoma
- Non si tratta di riproduzione perché il numero delle cellule non aumenta
- I batteri sono in grado di produrre nuove combinazioni di geni
→ l'accoppiamento fra cellule è possibile grazie alla presenza nelle cellule batteriche di molecole di DNA dette plasmidi, contenenti un numero ridotto di geni e capaci di replicarsi autonomamente.
I plasmidi si dividono in:
- degradativi → permettono ai batteri di metabolizzare particolari molecole, spesso tossiche
- col. → codificano per proteine in grado di uccidere altri batteri
- della virulenza → esprimono tossine responsabili della virulenza nei confronti di un organismo ospite
- F. → sono plasmidi coniugativi perché contengono il fattore fertilità che tramite la produzione di pili permette la coniugazione batterica
- R. → sono plasmidi coniugativi, ma contengono anche geni che conferiscono resistenza ad antibiotici (facilmente scambiati fra batteri di specie diverse)
1953: struttura a doppia elica del DNA
1983: prima pianta OGM
1988: progetto genoma umano
1997: pecora dolly
L'insieme delle tecniche che consentono di riuscire a manipolare il DNA in provetta è chiamato tecnologia del DNA ricombinante (ingegneria genetica).
Queste procedure permettono di:
→ estrarre il DNA in punti specifici, utilizzando particolari enzimi batterici (enzimi di restrizione)
→ unire i frammenti ritagliati al DNA di un altro organismo differente.
→ utilizzare opportuni vettori per trasferire il DNA estraneo del DNA della cellula ricevente.
I batteri sono in grado di difendersi dall'infezione virale grazie all'azione di enzimi chiamati enzimi di restrizione.
Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi speciali che sono in grado di tagliare le molecole di DNA dei virus in frammenti, inattivandole e impedendo così la riproduzione del virus. Limitano quindi le possibilità di sopravvivenza del DNA estraneo penetrato nelle proprie cellule.
Tagliano le molecole di DNA solo in corrispondenza di certi siti di riconoscimento (siti di restrizione) caratterizzati da una determinata sequenza di basi azotate.
La sequenza riconosciuta è un palindromo: una sequenza di basi a simmetria binaria che risulta identica in entrambi i filamenti.
Se si mescolano i frammenti di DNA di diversa origine, tagliati dallo stesso enzima di restrizione, le estremità coesive di due frammenti qualsiasi, che hanno sequenze di basi complementari, si appaieranno e si riuniranno in seguito alla formazione di legami idrogeno tra le basi complementari.
Gli spezzoni di DNA vengono saldati da un enzima chiamato DNA-ligasi e in questo modo si forma una molecola artificiale di DNA ricombinante.
Clonazione molecolare: isolamento e amplificazione di molecole identiche di DNA in un organismo.
Grazie a questa pratica è possibile:
→ identificare ed analizzare specifiche sequenze di DNA.
→ studiare le funzioni di un particolare prodotto genico.
→ ''ingegnerizzare'' gli organismi per fini specifici, quali ad esempio la produzione di insulina o l'introduzione di fattori di resistenza verso organismi patogeni.
La clonazione del DNA si suddivide in tre stadi:
1) isolamento della sequenza di interesse.
2) creazione di una molecola ibrida tra la sequenza di interesse e un vettore.
3) introduzione del vettore, unito alla sequenza da clonare, all'interno delle cellule ospiti, attraverso il processo di trasformazione.
I vettori usati per la clonazione sono plasmidi o virus.
Una genoteca è una collezione di cloni, che rappresentano l'intero genoma o l'intero trascrittoma, da cui è possibile selezionare, mediante specifiche tecniche di ibridazione, la sequenza di DNA a cui si è interessati.
Il termine trascrittoma indica l'insieme di tutti i trascritti di un organismo o tipo cellulare (mRNA).
Passaggi per preparare una libreria genomica dopo aver isolato il DNA genomico:
→ taglio in frammenti del DNA genomico con enzimi di restrizione.
→ unione dei frammenti di restrizione nel plasmide per mezzo di DNA- ligasi
→ inserimento tramite trasformazione delle molecole di DNA ricombinante nelle cellule batteriche ospiti.
Lo scopo della libreria genomica è quello di costruire una collezione di cloni che comprenda tutto il genoma di un organismo.
Affinché la libreria sia rappresentativa deve contenere almeno una copia per ogni frammento del genoma.
Per ridurre al massimo il numero di cloni necessari occorre utilizzare frammenti di restrizione di dimensioni maggiori, che non possono essere inseriti in normali plasmidi. In questo caso si possono usare come vettori i fagi lmbda in grado di accogliere frammenti circa 4 volte maggiori, oppure vettori di più recente sviluppo denominati cosmidi e BAC, in grado di accettare frammenti decine di volte più grandi.
Sonda molecolare: costituita da frammenti di acido nucleico in cui è stato inserito un nucleotide contenente l'isotopo radioattivo fosforo 32. Una sonda molecolare ha il compito di identificare la colonia di DNA contenente il frammento di DNA che c'interessa. Si utilizza una sonda molecolare specifica, la cui sequenza può appaiarsi a quella del gene d'interesse.
L'elettroforesi su gel consente di separare tra loro le macromolecole in base alle loro dimensioni e alla loro carica elettrica. Questa tecnica sfrutta la caratteristica delle macromolecole quali acidi nucleici o le proteine di essere dotate di carica elettrica.
1. Una soluzione contenente segmenti di DNA viene posta all'estremità di un sottile strato di speciale matrice gelatinosa (GEL) distesa su una lastra di vetro.
2. La matrice gelatinosa ha una struttura porosa che ha la funzione di agire da setaccio molecolare: le molecole più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi, quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.
3. La separazione avviene però solo quando la lastra contenente il gel è sottoposta a una differenza di potenziale di alcune decine di volt e immersa in un'apposita soluzione che consenta il passaggio della corrente.
L'impiego delle tecniche di separazione degli acidi nucleici ha permesso lo sviluppo di tecniche di indagine dette ''southern blot'' e ''northen blot''. La prima consente di studiare la presenza e la struttura di una particolare sequenza di DNA in una popolazione di DNA. La seconda è utilizzata per studiare la presenza e l'abbondanza di una particolare gene in una popolazione di RNA messaggeri.
Reazione a catena della polimerasi (PCR): è una procedura che consente di ottenere centinaia di migliaia di copie del DNA di interesse senza dover ricorrere ai comuni metodi di clonazione. Questa tecnica consente di amplificare in vitro e in poco tempo definite sequenze di DNA = Ripetere per un certo numero di volte, attraverso cicli consecutivi di denaturazione-appaiamento fra DNA bersaglio e inneschi, la sintesi di una specifica regione di DNA, in modo da avere un incremento esponenziale delle copie di questo DNA.
Per utilizzare questa tecnica occorre:
→ conoscere con precisione le estremità della sequenza da amplificare per poter sintetizzare degli inneschi specifici complementari a questa sequenza.
→ disporre di una DNA- polimerasi che non si denaturi alle alte temperature per poter effettuare cicli continui di PCR.
Ogni ciclo di PCR si svolge in tre fasi:
→ denaturazione: la molecola di DNA viene riscaldata a 95° e separata nei due filamenti complementari
→ appaiamento: la temperatura viene ridotta per consentire l'appaiamento fra gli inneschi e il DNA bersaglio.
→ polimerizzazione: polimerizzazione del nuovo DNA.
La DNA-polimerasi si lega in corrispondenza degli inneschi e in presenza di nucleotidi liberi catalizza la progressiva formazione di un nuovo filamento di DNA complementare a quello originario.
Per ottenere una quantità di copie sufficiente del DNA desiderato occorrono almeno 20-30 cicli di reazione, ciascuno dei quali dura pochi minuti ed è in grado di raddoppiare la quantità di DNA sintetizzata precedentemente (in poche ore vengono sintetizzate cento miliardi di molecole).
