Determinanti conformazionali e lineari

Determinanti conformazionali e lineari

Nel caso di un determinante conformazionale, ciò che viene riconosciuto e legato dal paratopo dell’anticorpo non è una struttura lineare, ma il folding della catena polipeptidica. Nel momento in cui si denatura la proteina, si perde il determinante conformazionale che non interagirà più con quel tipo di anticorpo. Se si considera un determinante lineare, la denaturazione non cambia il riconoscimento con l’anticorpo. Ci possono essere tuttavia determinanti che prima della denaturazione erano inaccessibili e che tramite la denaturazione diventano accessibili. Infine, si possono trovare dei determinanti neoantigenici, che possono essere generati per proteolisi.
Infine, si ricorda che gli antigeni possono legarsi in tasche o ad anse del sito anticorpale, a seconda delle dimensioni dell’antigene stesso.
La fusione avviene utilizzando reagenti chimici come il glicole polietilenico, che facilita la fusione delle membrane e la formazione di cellule ibride. Dopo la fusione sarà presente una mistura di cellule non fuse (sia di mieloma che linfociti B) e cellule fuse. Il terreno di selezione (per poter isolare solamente le cellule fuse) è detto terreno HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine).

L’aminopterina è un farmaco che agisce come inibitore del metabolismo del folato, inibendo l’enzima diidrofolato reduttasi, che blocca la sintesi del DNA de novo (necessario per effettuare la divisione cellulare). Ipoxantina e timidina sono intermedi della sintesi del DNA e quindi, inserendoli nel terreno HAT si rende disponibile per le cellule un materiale per costituire nuove molecole di DNA, che permette loro di evadere il blocco dato dall’aminopterina (via di salvataggio). Tale via, però, può essere utilizzata solo dalle cellule che possiedono i geni codificanti per gli enzimi TK e HGPRT. Ne consegue che le cellule di mieloma mutanti che non hanno TK oppure HGPRT non possono sopravvivere e quindi verranno eliminate dal medium HAT, come verranno eliminate anche le cellule della milza del topo perché, dato che non sono tumorali, dopo poco tempo non sono più in grado di dividersi. Sopravviveranno, quindi, solo le cellule ibride che hanno conservato la possibilità di dividersi in maniera indefinita (data dal mieloma) e gli enzimi TK e HGPRT (dati dai linfociti B della milza). Da queste cellule, dette ibridomi, vengono isolati i singoli cloni in modo che, proliferando separatamente, diano origine ad un unico clone. A questo punto verrà analizzato il contenuto di ogni singolo clone, in termini di produzione di Ig, che verrà testato per la capacità di legarsi con un’affinità accettabile con l’antigene utilizzato per immunizzare il topo, in questo caso l’antigene X. Saranno, infine, scelti quegli ibridomi in grado di produrre la maggior quantità di anticorpi monoclonali con l’affinità più elevata.