Patologia molecolare - Appunti

Patologia molecolare

Prof. Lollini, Nanni e Grilli

Il corso sarà composto da due corsi integrati: Oncologia genetica (cause e meccanismi generali delle malattie ereditarie) e Oncologia. Esame orale durante il quale è possibile verbalizzare il voto derivato dalla media con immunologia.

Programma/Contenuti - Pier-Luigi Lollini

Le alterazioni del genoma come causa di malattia

Tipi e cause di mutazione e loro effetti patogenetici.

Basi molecolari di malattie cromosomiche

Sindrome di Di George (CATCH). Le sindromi di Prader-Willi e Angelman e i meccanismi dell'imprinting parentale. Metilazione del promotore.

Sindrome dell'X fragile, Corea di Huntington e meccanismo di espansione delle triplette

Basi molecolari di malattie mendeliane

Alterazioni di proteine del citoscheletro: la sferocitosi ereditaria. Il gene DMD, ruolo della distrofina e distrofie muscolari di Duchenne e di Becker. Alterazioni di proteine della matrice extracellulare: le malattie del collagene (osteogenesi imperfetta, sindromi di Ehlers-Danlos) e della fibrillina (sindrome di Marfan).

Alterazioni di proteine recettoriali: l'ipercolesterolemia familiare. Struttura del recettore delle LDL e le diverse classi di mutazioni. Alterazioni di enzimi lisosomiali: i meccanismi di "sorting" degli enzimi lisosomiali e le tesaurismosi. Alterazioni dei canali ionici: la fibrosi cistica. Ruolo della proteina CFTR nel trasporto del cloro.

Alterazioni di proteine di membrana della cellula nervosa. Malattie prioniche: ipotesi di Prusiner. Forme ereditarie della malattia di Alzheimer: ruolo della proteina APP e delle preseniline.

Meccanismi generali di controllo e conservazione dell'integrità genomica

Meccanismi di riparazione del danno genotossico: NER, BER, ricombinazione omologa e "mismatch repair". Il "network" di rilevazione del danno genotossico: il ruolo dei geni ATM e p53.

Sindromi neoplastiche ereditarie (alterazioni geni gatekeeper)

Alterazioni di geni "gatekeeper". Il retinoblastoma: ipotesi di Knudson. Il cancro del colon ereditario poliposico: ruolo della proteina APC nel controllo del ciclo cellulare e nella mitosi. La von Hippel Lindau e i meccanismi di rilevazione dell'ipossia.

Sindromi neoplastiche ereditarie (alterazioni geni caretaker)

Xeroderma pigmentosum, atassia telangectasia, forme ereditarie di cancro mammario, Li-Fraumeni, cancro ereditario del colon non poliposico.

Il genoma umano

In generale, tutte le malattie sono il risultato di una combinazione tra ambiente e il nostro genoma e ogni malattia ha proporzioni variabili di cause derivanti dall'uno o dall'altro. Nelle malattie ereditarie è minore il contributo ambientale mentre nei tumori abbiamo una predominanza della componente ambientale.

Il genoma umano è organizzato in due distinti, uno grande nei cromosomi e uno piccolo mitocondriale. Si possono avere malattie con mutazioni che colpiscono uno dei due genomi, anche se i maggiori sono quelli che colpiscono quelle nucleari. Il genoma nucleare è composto da 3300 Mb mentre il mitocondriale è 16,6 Kb. Il DNA che codifica per proteine è il 3% del totale; il 90% è fatto di zone non codificanti, quindi ¼ del DNA è fatto di genie e sequenze relate mentre il 75% è formato da DNA extragenico e non ha un ruolo nella codifica delle proteine. Buona parte del DNA è ripetuto e le ripetizioni sono fonti di errori. Le sequenze ripetute possono appaiarsi in maniera errata. Il DNA extragenico presenta il 40% ripetitivo e il 60% di copia singola o basso numero di copie.

Il 10% del 25% (2,5%) codifica per proteine; il resto sono sequenze associate ai geni che svolgono o un ruolo regolatorio (promotori per esempio) e poi ci sono delle sequenze non codificanti che però possono dare luogo a patologie ereditarie (introni); infine troviamo gli pseudogeni che nel corso dell'evoluzione si sono danneggiati. Anche questi ultimi possono dare luogo a patologia.

Livelli di complessità del genoma

• Chimico: basi, legami e complementarietà;
• Informazionale: sequenza di un gene; le basi sono delle lettere e non più delle strutture chimiche.
• Strutturale: con formazione dei nucleosomi e della cromatina. I cromosomi possono essere considerati come organuli cellulari
• Subcellulare.

Il cromosoma mitocondriale è circolare. Il cariotipo è la colorazione dei cromosomi e la loro messa in ordine mentre il cariogramma è un disegno del cariotipo. Avere i cromosomi tondi (mitocondriali) o lineari è differente quando parliamo per esempio di duplicazione; per esempio il cromosoma tondo non ha fine ed inizio; uno lineare ha delle estremità e gli enzimi che duplicano il DNA, l'ultimo pezzo del DNA (telomero) non è replicabile e quindi non ha sequenze codificanti e sono oggetto di erosione nella progressione delle mitosi. Nelle cellule normali si accorciano. Il problema invece è per le cellule staminali e per le cellule tumorali. In questi casi c'è un enzima chiamato telomerasi che riallunga i telomeri. I cromosomi inoltre hanno un centromero che serve per tirare un cromosoma da una parte e uno dall'altro per evitare che vi siano problemi nella segregazione.

L'inizio della trascrizione non corrisponde all'inizio della proteina ma ci può essere una regione chiamata 5' non traslata che precede il primo esone. Il gene non finisce con un codone di stop perché possono esserci delle regioni 3' non traslate.

I geni umani sono 25000 + 37 mitocondriali; è presente 1 gene ogni 40-50 Kb, circa 3000 geni/cromosoma e circa 130 geni/banda. Le dimensioni in media sono 10-15 Kb e gli esoni sono in numero variabile da 1 a 80 con dimensione media di 2,5 bp. L'mRNA ha una dimensione media di 2,5 Kb che non è tutto non codificante ma la dimensione codificante è 1,5-1,8 Kb.

Il genoma è un'entità dinamica che si modifica con l'evoluzione. Ciò però comporta anche la possibilità che si sviluppino delle patologie a carico del genoma stesso.

Vi sono molte varianti fisiologiche nel genoma

• Alleli varianti di un gene che possono essere presenti in un soggetto;
• Wild-type: singolo allele;
• Polimorfismo: 2 o più alleli, ciascuno > 1% nella popolazione (es. HLA);
• Varianti rare: < 1% nella popolazione che non danno nessuna malattia di per sé ma possono esporci a differenti malattie.

Un tempo si parlava di polimorfismo in funzione del fenotipo ma oggi si afferma un polimorfismo come una variante di sequenza del DNA. Possono trovarsi anche in regioni non codificanti quindi non implicano necessariamente differenze di fenotipo ma solo di genotipo.

Gli studi dei polimorfismi sono (utilizzabili anche contemporaneamente):

• RFLP: Restricted Fragment Length Polymorphism. Se usiamo questi polimorfismi dobbiamo sapere che il concetto di allele applicato ai polimorfismi acquista differenti significati. Sono enzimi batterici che tagliano il nostro DNA in posizioni particolari. Qui posso avere 2 alleli (o l'enzima ha tagliato o non ha tagliato con 10000 loci – che sono poche);
• VNTR: Variable Number of Tandem Repeats. Varianti di lunghezza dovute a numero variabile di sequenze ripetute. Comporta un elevato polimorfismo.
• SNP: Single Nucleotide Polymorphism. Oggi dominano la ricerca biomedica in quanto si studiano le differenti varianti nucleotidiche in relazione alla patologia. Comprende tutti i RFLP. Ha un ordine di grandezza >10⁶.

In definitiva, tutte le malattie hanno un substrato genico. Un singolo gene è causa di una malattia mendeliana, geni multipli danno malattie complesse, i polimorfismi danno luogo a suscettibilità a malattie non genetiche. La farmacogenetica studia la suscettibilità agli effetti dei farmaci in relazione alla genetica.

Le patologie mendeliane sono nel 90% dei casi pediatriche, <10% post-puberali e circa l'1% dopo il periodo riproduttivo. La prevalenza è lo 0,4% su nati vivi mentre rappresentano il 6-8% dei bambini ospedalizzati. Per le malattie complesse e multifattoriali c'è una prevalenza del 60% nella popolazione.

Effetti dei polimorfismi

L'isoniazide (battericida antitubercolare) è inattivata per acetilazione e nella popolazione ci sono due velocità di acetilazione, veloce e lenta; gli acetilatori veloci comportano una scarsa risposta all'isoniazide ed hanno rari effetti collaterali. Gli acetilatori lenti hanno buona risposta al farmaco ma hanno anche maggiori effetti collaterali. I geni coinvolti sono N-acetiltransferasi NAT1 e NAT2 e gli acetilatori lenti hanno livelli ridotti di enzima e vi sono differenze etniche: caucasici 50-90% slow, asiatici 5-20% slow.

Gli acetilatori lenti hanno alta incidenza di effetti collaterali da altri farmaci e sono più suscettibili a vari cancerogeni (es. fumo da tabacco). Secondo uno studio recente vi sono dei geni connessi al metabolismo dei cancerogeni ma questi polimorfismi sono espressi a livello cerebrale e condizionano il nostro comportamento in relazione al fumo da tabacco per esempio. Ogni volta che si trova un meccanismo si trova anche un target per una terapia.

Una curiosità: La caffeina aumenta il rischio di infarto del miocardio? Gli studi epidemiologici di popolazione su questa relazione hanno dato risultati contraddittori. La caffeina è catabolizzata dal citocromo P4501A2, codificato dal gene polimorfico CYP1A2; chi ha questo allele lento ha un aumento quasi del doppio del rischio di infarto del miocardio mentre non notiamo alcun cambiamento in chi ha l'enzima rapido.

Patologia molecolare 4 marzo Lollini - Dal gene alla proteina

Una mutazione è qualsiasi alterazione del DNA. I principali tipi di mutazioni sono:

• Sostituzioni di basi
• Inserzioni
• Delezioni

Dimensioni:

• Geniche (Puntiformi, parti di geni)
• Cromosomiche (Parti di cromosomi)
• Genomiche (Interi cromosomi)

Sequenze interessate possono essere:

• Singola sequenza
• Scambi tra 2 o più sequenze indipendenti

Le cause di queste mutazioni possono essere:

• Spontanee, casuali;
• Indotte da mutageni, cancerogeni.

Nomenclatura delle mutazioni (non c'è mai 0 ma si parte da 1):

• Sostituzione: c.G1444>A
• Delezione: 1524-1527del
• Inserzione: c.1277-1278insTATC

La variabilità dinamica del DNA è la base delle patologie ma anche dell'evoluzione. Avremo due classi di mutazione:

• Che colpiscono le cellule della linea germinale che sarà ereditata dalla progenie. O (raramente) dà un vantaggio evolutivo che viene ereditato. L'evento più frequente di queste mutazioni è l'aborto spontaneo. In alcuni la mutazione è dannosa ma non letale e darà origine alla patologia ereditaria.
• Che colpiscono le cellule somatiche. Il vantaggio evolutivo si presenta con il cancro, con proliferazione incontrollata di una linea differenziativa. Qualche mutazione ha quindi dato un vantaggio evolutivo a una cellula che è diventata cancerogena. In altri casi si può avere la morte cellulare. Se la patologia si manifesta presto si può avere una patologia congenita.

Il DNA polimerasi si può sbagliare e la fedeltà della polimerasi è incompleta:

• Una persona adulta è formata da 10¹⁴ cellule
• Occorrono 10¹⁶ - 10¹⁷ divisioni cellulari (includendo embriogenesi e ricambio cellulare)
• Genoma umano = 3x10⁹ paia di basi
• Ogni replicazione del DNA richiede l'incorporazione di 6x10⁹ nuove basi
• 6x10⁹ x10¹⁶ = 6x10²⁵ nuove basi nell'intera vita
• Fedeltà delle DNA polimerasi: 1 errore ogni 10⁹ - 10¹¹ basi incorporate
• Quindi ogni persona nella sua vita accumula più di mille miliardi di mutazioni

Quindi le mutazioni sono fenomeni spontanei che originano fin dalla replicazione cellulare. La replicazione cellulare comporta rischio di mutazione ed il numero di mutazioni è maggiore dove si ha maggiore replicazione. Nelle malattie genetiche le mutazioni de novo sono più frequentemente di origine maschile. Nelle mutazioni de novo nel retinoblastoma l'88% deriva dal padre (ciò è connesso anche all'età del padre al momento del concepimento) mentre solo il 12% dalla madre.

• Zigote → Gamete ♀ ~30 divisioni cellulari
• Zigote → Gamete ♂ 30-900 divisioni a seconda dell'età

Le mutazioni hanno quindi sia a mutageni esogeni (radiazioni ionizzanti, radiazioni eccitanti, farmaci, cancerogeni chimici che possono essere ridotti nell'ambiente) che endogeni che danno dentro di noi già delle mutazioni (Elementi trasponibili, Differenziamento dei linfociti T e B (nel quali c'è il riarrangiamento del TCR e del recettore delle Ig e quando le cose vanno storte arriva un gene che causa il cancro), Prodotti del metabolismo cellulare, Infiammazione (i fagociti producono intermedi reattivi dell'ossigeno che sono a loro volta mutageni)).

Molte mutazioni non hanno conseguenze a livello di proteina perché abbiamo visto che la parte che codifica per le proteine è molto piccola e la maggior parte delle mutazioni cadono in zone non codificanti (97%). In generale questo attenua l'effetto di tutto il carico mutazionale. Poi dato che il codice genetico è degenerato si possono manifestare delle mutazioni silenti.

Mutazioni in DNA codificante

Sinonima (silente) = stesso aminoacido in quanto il DNA è degenerato (più triplette corrispondono allo stesso AA);

• Nonsenso = codone stop. La gravità delle conseguenze dipendono dalla zona che viene troncata, se alla fine o all'inizio della regione codificante.
• Di senso (missense) conservativa = aminoacido funzionalmente simile, per esempio un aminoacido lipofilo transmembrana lipofilo che può diventare un altro lipofilo senza grosse differenze funzionali.
• Non conservativa = aminoacido funzionalmente diverso, per esempio un amminoacido lipofilo transmembrana lipofilo che può diventare un non lipofilo con grosse differenze funzionali. In molti casi questa alterazione può essere patologica.

Alcune mutazioni di una zona non codificante possono alterare una proteina. Possono esservi alterazioni nel promotore o nell'enhancer del gene può essere modificata la trascrizione delle alterazioni della trascrizione. Possono esserci delle mutazioni del sito di splicing e quindi lo splicing può non essere corretto. Le zone di confine della zona di splicing sono dette SO (Splice Omor) e SA (splice Acceptor); può verificarsi una ritenzione di introni (perché gli enzimi credono che l'introne sia un pezzo di esone) oppure emissione di esoni (si salta un esone e spesso la proteina non funziona). Altre volte all'interno dell'introne ci può essere la formazione di un sito nuovo, definito sito criptico di splicing.

Lo spettro mutazionale ci fa vedere tutte le possibili mutazioni. Nella beta globina abbiamo tre regioni rosse codificanti. La forma clinica può essere causata da una di tutte le mutazioni indicate. Ogni barra rappresenta un allele patologico della beta globina. Ci sono differenti manifestazioni cliniche a seconda dell'allele mutato ereditato.

Inserzioni, delezioni, inversioni

• Dimensioni variabili da 1 base a parti di cromosoma (>1 Mb).
• Spesso si verificano in sequenze dove sono presenti ripetizioni. Le sequenze ripetute sono rischiose perché le ripetizioni possono dare luogo a perdita o acquisto di moduli di triplette.
• Le sequenze ripetitive implicano il rischio di appaiamenti disallineati nel corso della replicazione del DNA e del crossing over.

Le short tandem repeats, le piccole ripetizioni, possono dare luogo anch'esse a mutazioni. Anche le ripetizioni invertite e l'accoppiamento di sequenze omologhe possono causare delle delezioni. Si possono appaiare delle sequenze che in realtà non sono omologhe e le sequenze si appaiono in maniera rovesciata con conseguente inversione cromosomica. Si possono quindi formare degli appaiamenti errati anche con le sequenze in tandem mentre si ha la meiosi e si può avere l'inserzione da una parte e l'omissione dall'altra.

L'effetto patogeno di piccole inserzioni e delezioni dipende dal mantenimento o meno del modulo di lettura:

• Perdita/acquisto di 1 o 2 basi altera il modulo di lettura e spesso causa la produzione di una proteina molto alterata o troncata;
• Perdita/acquisto di triplette o multipli di tre (mutazione frameshift) basi comporta la perdita/acquisto di 1 o pochi aminoacidi e mantenimento della sequenza aminoacidica a valle; ciò comporta la formazione di una proteina con parziale mantenimento della funzione (delezioni di 1,2,4 nucleotidi sono più gravi di una delezione di 3 nucleotidi).

Nel nostro corredo di proteine ce ne sono alcune codificate in quantità abbondante, maggiore di quella necessaria per espletare la funzione. Ciò dipende dalla funzione che deve espletare la molecola; per esempio gli enzimi sono maggiori quindi se viene a mancare un enzima spesso la sua attività è compiuta da un altro enzima. In alcuni casi si ha una delezione del 90% di un enzima ma non vi è una espressione fenotipica, mentre la mancanza del 50% di proteine costitutive dà già luogo a patologie molto gravi. Nei sistemi biologici, soprattutto negli organismi superiori, il livello di funzione normale comprende un ampio margine di sicurezza. Quindi si assiste alla ridondanza del prodotto enzimatico.

Vi possono essere delle patologie legate all'espansione delle triplette nucleotidiche; il segmento ripetuto n volte a causa di problemi enzimatici vi possono essere inserzioni e delezioni. Queste danno delle patologie da triplette ripetute.