Mutazioni del DNA: Appunti di Biologia cellulare

BIOLOGIA  :  LO  STUDIO  DELLA  VITA  

1. ORGANISMO  INTERO  

2. ORGANI    

3. TESSUTI  

4. CELLULE  

5. ORGANULI  INTRACELLULARI  

6. COMPONENTI  CHIMICI  

COMPONENTI  CHIMICI  DELLA  VITA  

  1. CARBOIDRATI  

2. LIPIDI  

3. PROTEINE  

4. ACIDI  NUCLEICI:  

DNA  

• RNA  

•

ACIDI  NUCLEICI:  

MATERIALE  GENETICO  DI  TUTTI  GLI  ORGANISMI  CONOSCIUTI  

DNA:  Acido  deossiribonucleico    

• RNA:  acido  ribonucleico  (e.g.,  alcuni  virus)  

• Sequenza  di  NUCLEOTIDI  legati  covalentemente    

• Basi  azotate    

• Zucchero  a  5  atomi  di  C  (ribosio  per  l’RNA  o  deossribosio  per  il  DNA)  

• Gruppo  fosforico    

•

La  sequenza  di  basi  contiene  l’informazione  genetica    

•

  Un  acido  nucleico  è  costituito  da  4  tipi  di  basi  unite  da  uno  scheletro  composto  da  uno  zucchero  e  

• gruppi  fosforici  

I  nucleotidi  sono  le  unità  monomeriche  degli  acidi  nucleici  

• DNA  e  RNA  differiscono  per  lo  zucchero  ed  una  base  

•

  Un   nucleotide  è  un   nucleoside  esterificato  ad  1  o  più  gruppi  fosfato    

• Un   nucleoside  è  costituito  dalla  base  azotata  legata  allo  zucchero  

• I  nucleotidi  sono  i  monomeri  che  si  legano  per  formare  RNA  e  DNA  

•

  Due  catene  di  acidi  nucleici  con  sequenze  complementari  e  direzionalità  opposta  possono  formare  

• una  struttura  a  doppia  elica  

La  doppia  elica  è  stabilizzata  da  legami  idrogeno  e  da  interazioni  idrofobiche  

• Due  filamenti  di  DNA  a  doppia  elica  sono  antiparalleli  e  autocomplementari    

•

Nei  test  genetici  gli  aspetti  fondamentali  sono  2:  

-­‐ La  complementarietà  tra  le  basi,  xkè  molte  analisi  si  basano  sulla  PCR  usata  x  amplificare  il  DNA  e  

implica  l’uso  di  opportuni  primers  che  vengono  scelti  secondo  le  regole  della  complementarietà  

-­‐ L’antiparallelismo  dei  filamenti  

Questi  concetti  diventano  fondamentali  per  quando  si  effettuano  i  test  genetici  che  si  basano  

sull’ibridizzazione  di  sequenze  di  acidi  nucleici  usati  come  sonde  che  vanno  a  legare  il  DNA  del  paziente  

x  verificare  se  c’è  o  meno  una  perfetta  complementarietà.  

Se  si  tratta  di  DNA  la  sonda  si  può  costruire  su  entrambi  i  filamenti  data  la  doppia  elica  

Se  si  tratta  di  un  trascritto  la  nostra  sonda  dovrà  essere  complementare  al  filamento  senso  del  DNA.  

In  entrambi  i  casi  l’estremità  3’OH  del  primers  dovrà  essere  liberà  così  da  permettere  l’aggiunta  dei  

dNTPs.  

BASE-­‐PAIRING  

Tra  una  purina  e  una  pirimidina  di  due  filamenti  autocomplementari  si  possono  instaurere  legami  

• idrogeno    

I  legami  idrogeno  sono  più  deboli  dei  legami  covalenti    

• Regola  di  Watson-­‐Crick  sugli  appaiamenti  complementari    

• A    =    T      2  legami  a  H  

!

• G    =  C      3  legami  a  H  

!

•

Il  numero  di  legami  a  H  è  molto  importante  quando  si  analizza  il  DNA  ricco  di  GC  in  cui  la  T  di  

denaturazione  è  più  alta  xkè  ci  sono  3  legami  a  H.  

La  qunatità  di  AT  e  GC  nelle  sonde  è  cruciale  nella  scelta  delle  codizioni  dell’esperimeto.  

Es.  l’analisi  del  gene  trasmutasi  1  reduttasi  (incerta  sul  nome)  

È  un  gene  molto  lungo  ricco  di  GC,  noiosissimo  da  seguenziare.  

All’inizio  si  impiegava  molto  tempo  x  sequenziarlo  a  mano  anche  xkè  si  effettuava  a  37°C    e  le  sonde  

non  riuscivano  a  legarsi  xkè  la  doppia  elica  del  DNA  tendeva  a  riappaiarsi;  poi  fu  immesso  in  

commercio  il  kit  che  usava  la  polimerasi  termostabile  anke  x  sequenziamento  a  partire  dal  sangue,  

ciò  ha  consenito  di  lavorate  al  alte  temperature  così  da  rompere  i  3  legami  a  H  di  GC  e  facilitare  il  

lavoro;  inoltre  x  favorire  la  separazione  delle  eliche  si  aggiungono  degli  additivi.  

Il  DNA  deve  prima  denaturarsi  x  far  legare  la  sonda  e  grazie  alla  diminuzione  della  temperatura  si  

riappaia    per  complementarietà.  Molte  tecniche  x  identificare  mutazioni  si  basano  su  qst  capacità  

che  il  DNA  ha  in  vitro.  

Es.l’analisi    delle  sequnze  pit  nelle  malattie  da  espansione  da  triplette  

Nell’  X-­‐fragile,la  sequenza  GC  può  ripetersi  fino  a  150-­‐200  volte  nelle  amplificazioni  canoniche  e  

risulta  difficile  da  analizzare.  

Perciò  i  legami  GC  possono  costituire  un  ostacolo  nell’effettuare  un  test  genetico.  

Nel  DNA  a  doppia  elica,  le  purine  e  le  pirimidine  sono  una  di  fronte  all’altra    

• Le  due  catene  polinucleotidiche  vengono  mantenute  nella  struttura  a  doppia  elica  da  legami  

• idrogeno  tra  le  basi    

Secondo  la  regola  di  Watson-­‐Crick    

• A  =  T  

• G  =  C  

•

Gli  appaiamenti  GC  (bps)  sono  energeticamente  più  stabili  di  quelli  AT    

• Poichè  un’elica  di  DNA  è  complementare  all’altra,  il  materiale  genetico  può  essere  facilmente  

• replicato;  ogni  elica  serve  da  stampo  per  la  sintesi  dell’altra    

La  doppia  elica  si  può  fondere,  denaturare,  in  maniera  reversibile  

• La  doppia  elica  facilita  un’accurata  trasmissione  dell’informazione  genetica  

•  

REPLICAZIONE  DEL  DNA  

Il  DNA  viene  replicato  da   polimerasi  che  traggono  le  istruzioni  dagli  stampi  

• La   DNA  polimerasi  catalizza  la  formazione  di  legami  fosfodiestere  

• Le  polimerasi  sono  usate  anke  nelle  analisi  genetiche:  se  si  deve  sintetizzare  DNA  a  partire  da  DNA  

si  usano  DNApolimerasi  DNAdipendenti;  se  si  deve  sintetizzare  RNA  da  DNA  si  usa  un  RNA  

polimerasi  DNAdipendente;  x  effettuare  la  retrotrascrizione  userò  un  RNA  polimerasi  

DNAdipendente.  

Per  iniziare  la  sintesi,  ha  bisogno  di  un  innesco  (primer)  con  il  3’-­‐OH  libero  

• La  direzione  della  sintesi  è  5’!  3’    

• Possiede  attività  esonucleasica  3’!  5’  per  correggere  gli  appaiamenti  errati,  dal  momento  che  gli  

• appaiamenti  sono  casuali  se  si  iserisce  un  nt  sbagliato  esso  viene  eliminato.  La  taq  polmerasi  usta  

nella  PCR  è  priva  di  qst  attività;  ma  sono  state  create  delle  taq  ricombinanti  capaci  di  correggere  gli  

errori  x  cui  essere  risultano  più  efficaci  in  vitro  (bisogna  ricreare  le  stesse  condizioni  che  in  vivo)  

La  replicazione  avviene  su  entrambe  le  catene  

•

Un  gene  è  un’unità  ereditabile  .  Esso  porta  l’informazione  per  la  sintesi  di:  

  -­‐  proteine    

  -­‐  molecole  di  RNA                        

5   3

’    

Al    5’  del  DNA  c’è  una  squenza  UTR  che  vengono  trascitte  ma  non  tradotte  cioè  sono  trascritte  in  RNA  ma  

non  tradotte  in  proteine.  Esse  sono  sequenze  importanti  x  la  trascrizione  ma  sono  prive  di  significato  in  

termini  di  codice  genetico.  

Ci  sono  poi  i  promotori    (costitutivi  o  finemente  regolati)  che  regalano  l’espressione  del  gene;  esistono  

mutazioni  a  carico  dei  promotori  stessi  che  alterano  la  sequenza  consesus  riconosciuta  da  fattori  di  

trascizione  specifici  e  impediscono  la  traduzione  del  gene;  ad  es.  l’X-­‐fragile  può  essere  causata  da  una  

mutazione  nel  promotore  che  spenge  la  funzione  del  gene  e  la  proteina  non  è  tradotta.  

X-­‐fragile!  il  95%  dei  casi  è  dovuta  a  mutazione  nel  promotore  

                                         Il  5%  dei  casi  dovuti  a  mutazioni  inattivanti  all’interno  del  gene  

Esistono  mutazioni  diverse  che  causano  lo  stesso  fenotipo  

Aldolasi  B  :  anni  fa  la  prof.  e  altri  cercarono  di  individuare  la  mutazione  che  causava  l’intolleranza  al  

fruttosio,  ma  nello  stesso  periodo  pubblicarono  su  una  rivista  scientifica  la  mutazione  scoperta.  In  un  

secondo  momento  se  ne  scoprirono  altre,  a  confermare  la  tesi  che  mutazioni  diverse  causano  lo  stesso  

fenotipo.  

Le  sequenze  UTR  esistono  anke  all’estremità  3’,  mutazioni  in  qst  sequenza  causano  la  malattie  di  Steiner  o  

distrofia  miotonica,  che  è  una  malattia  da  espansione  da  triplette.  

Molti  geni  con  3’UTR  molto  lungo  hannno  in  esso  sequenze  che  contengono  microRNA  

ESPRESSIONE  GENICA  

Consiste  nella  trasformazione  dell’informazione  nel  DNA  in  molecole  funzionali  

• L’informazione  diviene  accessibile  quando  è  trascritta  in  RNA  

• L’mRNA  è  uno  stampo  per  la  sintesi  proteica  o  traduzione  

• I  tRNA  trasportano  gli  amminoacidi  sui  ribosomi  per  la  formazione  dei  legami  peptidici,  in  una  

• sequenza  determinata  dallo  stampo  di  mRNA  

L’rRNA  dei  ribosomi  svolge  un  ruolo  strutturale  e  catalitico  nella  sintesi  proteica  

•

RNA   Tutto  l’RNA  cellulare  è  sintetizzato  dall’RNA  p