Biochimica - Appunti

Biochimica di Alberto Preda

Corso di biochimica completo per le facoltà di medicina, farmacia, CTF e biotecnologie. Utilissimo anche per tutti gli altri indirizzi scientifici, in particolare biologia, agraria e le lauree sanitarie. Università degli studi di Genova Facoltà di medicina e chirurgia.

Indice

• Struttura e funzione delle proteine
• Α amminoacidi
• Proteine
• Proteine fibrose
• Denaturazione delle proteine
• Ripiegamento o folding delle proteine
• Attività catalitica
• Cinetica enzimatica
• Inibizione enzimatica
• Emoglobina e mioglobina
• Vitamine
• Metabolismo
• Metabolismo del glucosio
• Via del glicogeno
• Glicolisi
• Metabolismo del fruttosio e del galattosio
• Gluconeogenesi
• Ciclo o shunt dei pentoso fosfati
• Radicali liberi
• Decarbossilazione ossidativa del piruvato
• Il ciclo di Krebs o ciclo dell’acido citrico
• Sistemi shuttle
• Bilirubina
• Ciclo dell’acido gliossilico
• Corpi chetonici
• Catena respiratoria e fosforilazione ossidativa
• Metabolismo lipidico
• Β ossidazione degli acidi grassi
• Biosintesi degli acidi grassi
• Biosintesi dei lipidi complessi
• Gliceroneogenesi
• Metabolismo del colesterolo
• Funzione endocrina degli adipociti
• Metabolismo degli amminoacidi (azotato)
• Ciclo dell’urea
• Biosintesi dei coenzimi NAD, FAD, CoA
• Biosintesi dei nucleotidi pirimidinici
• Sintesi dei 2’ desossiribonucleotidi
• Trasferimento di unità monocarboniose: il ciclo dei folati
• Biosintesi dei nucleotidi purinici
• +NAD
• Sirtuine
• Interazione metabolismo glucidico e lipidico
• Traduzione del segnale
• Insulina
• Recettori G proteins
• Recettore dell’insulina
• Esami del sangue

Struttura e funzione delle proteine

Tutte le proteine hanno una forma e occupano uno spazio nella tridimensionalità. Il loro ligando (piccolo substrato) è una molecola che si attacca alla proteina. Attraverso la microscopia atomica è possibile visualizzare delle molecole abbastanza grandi, ma non esiste alcuna tecnica per visualizzare delle proteine piccole. Si può utilizzare, però, la cristallografia a raggi X: si fa cristallizzare la proteina (gli atomi si dispongono in una struttura ordinata), si fa passare un fascio di raggi X che verrà deviato dagli atomi per formare uno spettro di diffrazione, uno specchio di rilevamento permette di rilevare come sono stati deviati gli atomi. Si ottiene una mappa di densità elettronica e si ricava il modello della proteina (talvolta si rappresenta solo la struttura secondaria, vedi emoglobina).

Le proteine non sono statiche, possono cambiare la loro conformazione (meccanismo alla base della funzione delle proteine), l’emoglobina è in forma “deossi” od “ossi” (quando, rispettivamente, non lega e lega l’ossigeno). La maggior parte degli antibiotici (eritromicina, tetraciclina o clindamicina) va ad inibire la funzione dei ribosomi batterici. Dopo un po’ che usiamo l’antibiotico, i batteri diventano resistenti, vi sono delle mutazioni nei batteri stessi. Conoscere la struttura del ribosoma può aiutare a sviluppare farmaci.

A causa di un'anomalia cromosomica, la leucemia mieloide cronica è causata da una traslocazione. Dalla traslocazione si forma una proteina di fusione Bcr-Abl, che è sempre attiva. L’imatinib si incastra nel sito attivo della molecola e ne inibisce l’attività. I pazienti, dopo il trattamento, sviluppavano resistenza alla terapia. Attraverso il rational drug design, sapendo qual è la struttura del sito attivo della proteina, si possono sviluppare delle molecole che sono in grado di inserirsi nel sito attivo dei mutanti (non più “inibiti” dall’imatinib).

Dallo studio delle proteine native è stato possibile costruire delle proteine nuove (chimeriche), che possono essere usate come (ad esempio) antinfiammatori (presentano dei vantaggi). Pertanto è anche possibile usare le proteine come farmaci. Un altro esempio di ingegneria proteica lo abbiamo con le insuline. La maggior parte delle malattie degenerative è causata da aggregati proteici (es. placche amiloidi del morbo di Alzheimer). In queste malattie “qualcosa” non ha funzionato nel folding. Se la proteina non è ripiegata correttamente, infatti, si possono formare degli aggregati che portano alla sua precipitazione. Oggi si sta studiando come impedire alle proteine di precipitare.

Amminoacidi Α

Unità fondamentale della proteina. Il gruppo carbossilico e il gruppo amminico sono legati al carbonio α. Gli amminoacidi sono composti chirali. Nelle proteine troviamo solo amminoacidi con configurazione L. Sono state sintetizzate proteine con amminoacidi D e funzionano ugualmente (devono essere tutti amminoacidi nella stessa configurazione). I carboni successivi all’α sono indicati da lettere greche.

Gli amminoacidi possono comportarsi o da acidi o da basi. Per esempio, prendendo l’acido acetico (CH₃COOH), se siamo in ambiente acido (disponibilità di H⁺), esso sarà in forma indissociata; a pH basico in forma dissociata. Esiste un punto di equilibrio. La stessa cosa accade agli amminoacidi, bisogna, però, considerare sia il gruppo carbossilico, sia quello amminico. Il fatto che gli amminoacidi possano essere caricati positivamente o negativamente è influenzato dal pH (più H⁺ ci sono, più l’amminoacido avrà una carica positiva, se diminuiscono gli H⁺ avremo una carica negativa).

Se consideriamo un piccolo peptide, abbiamo solo un gruppo amminico e un gruppo carbossilico libero, gli altri sono impegnati nel legame peptidico. Esistono degli amminoacidi che hanno nelle catene laterali sia dei gruppi amminici che carbossilici. A pH acido prevalgono gli H⁺, la carica netta della proteina è positiva; se aumenta il pH, la carica netta della proteina sarà negativa. Esisterà un punto di pH in cui avremo un equilibrio di cariche positive e cariche negative: punto isoelettrico (caratteristica di ciascuna proteina, importante per l’elettroforesi). La funzione delle proteine è strettamente legata al pH, che influenza tantissimo la capacità (per es.) dell’emoglobina di legare e rilasciare ossigeno.

Possiamo avere:

• Amminoacidi idrofobici (alanina), NB la prolina (amminoacido con gruppo amminico secondario: N legato a 2 –R) è un imminoacido perché il gruppo amminico prende parte alla ciclizzazione. Quando è presente, la catena polipeptidica perde un certo grado di movimento.
• Amminoacidi idrofilici (serina, treonina e tirosina contengono un gruppo –OH, che può essere sito di fosforilazione).
• Catene laterali acide (acido glutammico, acido aspartico).
• Catene laterali basiche (lisina, arginina).

NB gli amminoacidi vengono indicati o abbreviati con tre lettere (es. Gly) o con una lettera sola (G). Gli amminoacidi sono rappresentati nelle proteine in maniera differente, più frequente (glicina, alanina) e meno frequente (triptofano).

Ruolo delle catene laterali degli amminoacidi

• Determinano la struttura delle proteine.
• Alcuni con catene laterali polari (neutre o cariche) sono coinvolti nel meccanismo catalitico degli enzimi (istidina, cisteina, tirosina, serina, acido glutammico catalisi acido-base, catalisi covalente).
• Catene laterali con gruppi ossidrilici possono essere fosforilate o modificate in altro modo.
• Catene laterali di lisina possono essere modificate con gruppi metilici, acetilici, ubiquitina, coenzimi.
• Serina, treonina e asparagina sono possibili siti di glicosilazione.
• La cisteina ha un gruppo SH che può essere ossidato a dare un ponte disolfuro S-S. Il gruppo che si forma è uno dei sistemi più importanti per stabilizzare la struttura terziaria delle proteine (soprattutto le proteine destinate al di fuori della cellula, devono essere più resistenti). Il gruppo SH può trasportare elettroni (nella formazione dei deossiribonucleotidi).

Amminoacidi essenziali e non essenziali

Gli amminoacidi si dividono in essenziali (non sintetizzabili, introdotti con la dieta) e non essenziali (sintetizzabili). Gli amminoacidi standard sono venti, dopo che è avvenuta la sintesi proteica alcuni possono essere modificati, es. delle lisine e proline presenti nel collagene possono essere idrossilate (questo permette al collagene di fare dei legami incrociati, rendendolo molto più resistente). Il glutammato viene modificato a livello del carbonio γ (in cui, alla fine, avremo un gruppo carbossilico), questo processo è importante nella coagulazione ed è favorito dalla vitamina K (il coumadin, anticoagulante, impedisce questo processo).

Troviamo amminoacidi con funzione di intermedi metabolici (citrullina, ornitina) o amminoacidi dai quali possiamo ricavare neurotrasmettitori: dalla tiroxina Dopa, dal glutammato Gaba, dall’istidina Istamina (mediatore dei fenomeni allergici), dal triptofano Serotonina.

Proteine e legame peptidico

Il legame peptidico (ammidico) è l'unione del gruppo carbossilico di un amminoacido con il gruppo amminico dell’amminoacido successivo, con eliminazione di una molecola d’acqua. L’ossigeno e l’idrogeno stanno da due parti diverse (configurazione trans). Se andiamo a misurare la distanza tra C e N, notiamo che essa è a metà fra il legame singolo e il legame doppio (risonanza del doppio legame ruota). Nel doppio legame gli atomi non possono ruotare, la molecola diventa rigida e planare, abbiamo una maggiore densità di carica negativa sull’ossigeno e una parziale carica positiva sull’idrogeno (aumento polarità). Il legame idrogeno è un legame debole, si ha tra un atomo di H legato ad Ossigeno, Azoto o Fluoro: elementi molto più elettronegativi.

Classificazione delle proteine

• Peptide: un insieme di amminoacidi tenuti insieme da legami peptidici, molecola composta da un numero abbastanza basso di amminoacidi.
• Polipeptide: una catena formata da tanti amminoacidi.
• Proteina: un polipeptide che ha una specifica funzione (è possibile sintetizzare ogni polipeptide in laboratorio).
• Semplice: contiene solo amminoacidi.
• Coniugata: per funzionare ha bisogno di altre strutture (es. emoglobina ha bisogno del gruppo EME).
• Lipoproteine, Glicoproteine, Emeproteine, Flavoproteine, Metalloproteine, Globulare: ha una forma compatta, quasi rotonda. La sequenza amminoacidica non è ripetitiva.
• Fibrosa: allungata, tende ad associarsi in fasci. Sequenza amminoacidica ripetitiva. Molto con funzione strutturale.

Struttura e funzione delle proteine

La struttura e la funzione delle proteine sono strettamente correlate. L'organizzazione spaziale degli atomi di una proteina è detta conformazione o struttura. La conformazione finale di una proteina è determinata dalla formazione di interazioni deboli (ad eccezione del ponte disolfuro) tra atomi coinvolti nel legame peptidico o tra le catene laterali degli amminoacidi. La struttura finale di una proteina dipende dalla sequenza amminoacidica (sequenza del gene). La funzione delle proteine dipende dalla struttura.

Livelli di struttura delle proteine

1. Struttura primaria
2. Struttura secondaria
3. Struttura terziaria: struttura finale
4. Struttura quaternaria: più subunità polipeptidiche si associano tra di loro

Struttura primaria

La struttura primaria è la sequenza degli amminoacidi N terminale C terminale. (NH₃–aa-aa-aa-aa-COOH). Per un polipeptide di 100 amminoacidi possiamo avere 20¹⁰⁰ possibili sequenze diverse. Paradosso di Levinthal: negli anni '60 questo scienziato si chiese come una proteina di 100 amminoacidi possa assumere una forma tridimensionale corretta. All’inizio si pensava che lo facesse a caso, per tentativi, ma un polipeptide di 100 amminoacidi potrebbe assumere 5¹⁰⁴⁷ combinazioni diverse e ci metterebbe 10²⁷ anni. Il ripiegamento delle proteine non è un fenomeno casuale, ed è energeticamente favorito (il ripiegamento si ha in pochi secondi). Si passa da uno stato di alta entropia a uno stato di bassa entropia.

Struttura secondaria

La struttura secondaria comprende diverse configurazioni:

• Struttura ad elica α-elica
• Altre strutture ad elica
• Foglietto β parallelo
• Foglietto β antiparallelo

La struttura ad elica e il foglietto β nascono grazie alla formazione del legame idrogeno tra i vari legami peptidici. Possiamo poi avere:

• Ripiegamento β di glicina e prolina
• Ansa omega
• Strutture non ripetitive (coil, loop): mioglobina: 78% α-elica o β-foglietto, 22% loop
• Strutture secondarie delle proteine fibrose
• Elica del collagene
• Coiled coil

Grazie ad alcuni legami presenti nella proteina che creano gli angoli phi o psi, si permette alla proteina stessa di ruotare ed essere abbastanza flessibile (la flessibilità non è illimitata, la catena laterale determina come sarà fatta la struttura della proteina). Si forma una struttura elicoidale, un’elica destrorsa, in cui si ha la formazione di legami a idrogeno tra l’ossigeno (di un legame peptidico) e un H coinvolto nel 4° legame peptidico successivo. Le catene laterali R si dispongono tutte verso l’esterno. La prolina (imminoacido) impedisce la formazione dell’α elica.

Foglietto β

Il legame che unisce i diversi residui amminoacidici è sempre un legame a H che si viene a formare tra i legami peptidici che possono essere molto lontani; si forma una struttura pieghettata. Il foglietto β viene rappresentato come una freccia; le catene laterali R sono sempre verso l’esterno. Esiste il foglietto β parallelo e il foglietto β antiparallelo. In un foglietto antiparallelo si avvicinano due porzioni della catena polipeptidica che hanno un andamento contrario, se invece l’andamento delle porzioni della catena polipeptidica hanno lo stesso andamento si parla di foglietto parallelo. Il foglietto parallelo si pensa che sia più stabile.

Esistono dei ripiegamenti repentini (a livello per esempio della glicina), la prolina può essere modificata a seconda delle esigenze da alcuni enzimi. Dipende dalle proteine la presenza di α eliche e foglietti β. Ad es. nel citocromo C non si hanno foglietti β ma solo α eliche.

Esistono strutture supersecondarie e domini tra la struttura secondaria e terziaria. Permettono di fare delle strutture molto complesse.

• Raggruppamenti di elementi di struttura secondaria (si ritrovano frequentemente nelle proteine)
• Unità β αβ
• Greca
• Meandro β
• β barile (foglietti β messi vicini che formano una sorta di “barile”), spesso nelle proteine della via glicolitica.

I motivi possono permettere la classificazione strutturale delle proteine in famiglie e superfamiglie. Dominio: unità strutturalmente indipendente (anche nel ripiegamento) che in genere svolge funzioni specifiche (es. Nad sembra essere composto di due domini). Ci sono delle proteine (es. fibronectina) costituite da una serie di domini (oggi identificati da simboli). Questi domini sono presenti in diverse proteine, ovviamente con diversa disposizione.

Strutture secondarie e supersecondarie

Le strutture secondarie sono determinate da legami a H, supersecondarie le strutture sono stabilizzate da interazioni fra le catene laterali R degli amminoacidi che possono formare diversi tipi di legame (dipende dalle caratteristiche chimiche dell'amminoacido).

• Interazioni idrofobiche: tra catene laterali idrofobiche
• Legami a idrogeno fra amminoacidi polari
• Legami ionici fra amminoacidi carichi negativamente e amminoacidi carichi positivamente. Fortemente influenzati dal pH
• Legami (ponti) disolfuro fra cisteine se i due gruppi –SH vengono ossidati (sottratti di 2 elettroni e 2 protoni). È un legame covalente (forte), soltanto una sostanza riducente può rompere il ponte disolfuro (riportando il residuo di cistina a cisteina). Non esistono ponti disolfuro nelle proteine citosoliche, ma soltanto nelle proteine della membrana o del plasma (questi legami sono presenti nella cheratina che caratterizza capelli, unghie, corna; i ponti disolfuro vengono formati nell’apparato di Golgi).

Struttura terziaria

È la conformazione finale che una singola catena polipeptidica assume nello spazio.

• Proteine solubili e di membrana
• Proteine solubili: (es. globulari) citosoliche, plasmatiche all’esterno della proteina si dispongono residui idrofilici, tutte le catene idrofobiche tenderanno a mettersi all’interno della proteina. Se dovesse comparire un residuo idrofobico all’esterno della molecola: il residuo cerca di entrare all’interno la proteina non acquisisce una struttura corretta.
• Proteine di membrana: all’esterno troviamo dei residui idrofobici per interagire con i fosfolipidi, all’interno dei residui idrofilici (es. canali ionici).

La sostituzione anche solo di un singolo amminoacido può cambiare radicalmente la struttura di una proteina. L’indice di idropatia può permetterci di prevedere se la proteina è solubile o di membrana. Es. proteine solubili: gli amminoacidi idrofilici e idrofobici sono mescolati, non si vede una regione fortemente idrofobica.

Struttura quaternaria

Deriva dall’associazione di più catene polipeptidiche.

• Le subunità polipeptidiche si possono associare in maniera geometricamente specifica
• Monomero o subunità: unità fondamentale della proteina
• Protomero: unità identica (1 o più polipeptidi) ripetuta di una proteina. Distinti da lettere greche. (es. in emoglobina le due catene α formano un protomero)
• Oligomeri (dimeri, trimeri, tetrametri): poche subunità
• Multimeri: tante subunità
• Omodimero o omotetramero: subunità identiche
• Eterodimero