Ciclo di Krebs

L’enzima che guida questa reazione è l’isocitrato deidrogenasi (cl.1): è la prima reazione redox del ciclo e

• coinvolge il coenzima NAD.

La reazione necessita della presenza di uno ione Mn (presente nel sito attivo dell’enzima) che crei legami per

2+

• stabilizzare l’enolo che si viene a formare transitoriamente: si lega al gruppo carbonilico dell’intermedio

ossalosuccinato. L’ossalosuccinato non lascia il sito di legame fino alla conversione in mediante

α-chetoglutarato

decarbossilazione. L’ si presenta in forma chetonica.

α-chetoglutarato

Ci sono due tipi di enzima che catabolizzano la stessa reazione, ma con un uso differente del coenzima:

•

1. Isoenzima isocitrato deidrogenasi NAD-dipendente: presente nella matrice mitocondriale e opera all’interno

del ciclo di Krebs.

2. Isoenzima isocitrato deidrogenasi NADP-indipendente: presente sia nei mitocondri che nel citosol. Produce

NADPH che interviene nelle reazioni anaboliche riduttive. La sua mutazione causa tumori.

L’isocitrato si ossida ad e perde un C come CO , mentre NAD si riduce a NADH, il quale alimenterà

α–chetoglutarato

• 2

la catena di trasporto di e .

-

È una reazione fortemente esoergonica e irreversibile.

•

Tappa 4: Ossidazione dell’ α-

chetoglutarato

Anche questa reazione è una decarbossilazione ossidativa. L’enzima che interviene è l’α-chetoglutarato

• deidrogenasi (cl.1)

È la seconda redox che coinvolge un coenzima piridinico, che (in forma ridotta) alimenta il trasporto di e .

-

• La struttura dell’enzima è molto simile a quella del PDH e funziona in modo simile. L’E derivata dall’ossidazione dell’

• viene conservata mediante la formazione del legame tioestere del succinil-CoA.

α-chetoglutarato

Anche se i due enzimi sono simili (paraloghi), la specificità per il substrato data da E1 è fondamentale nella

• distinzione tra i due enzimi: le sequenze amminoacidiche non sono uguali in E1/E2, solo E3 è identica. Il

funzionamento invece è identico.

Il C ossidato è quello chetonico, che diventa carbossilico nel succinil-CoA, dove lo stesso C si complessa con il CoA

• tramite un legame tioestere (alta E).

ΔG= -33,5 KJ/mol

• A questo punto del ciclo siamo arrivati alla completa ossidazione dell’acetile in quanto sono state prodotte due

• molecole di CO . NAD è l’accettore finale di elettroni e CoA è il trasportatore del gruppo succinile.

+

2

Succinil-CoA ha 4C.

•

Tappa 5: Conversione del succinil-CoA a

succinato

Reazione catalizzata da succinilCoA sintetasi o succinico tiochinasi (cl.6). Essendo una sintetasi vuol dire che utilizza ATP nella formazione dei legami, essendo qui la reazione

• reversibile si osserva la produzione di ATP perché va al contrario.

In questa reazione che conserva E vi è una fase intermedia in cui la mol dell’enzima diventa fosforilata a lv del residuo di His nel sito attivo. Il gruppo fosforico, con elevato

• potenziale di trasferimento di gruppo, viene trasferito all’ADP o GDP per formare ATP o GTP.

L’enzima succinil CoA sintetasi ha due subunità: la subunità possiede il residuo di His fosforilato e il sito di legame per CoA, la subunità conferisce specificità per ATP o

α β

• GTP. Il sito attivo è tra le due subunità. La cristallografia ha rivelato due eliche nell’enzima poste in modo tale da orientare le cariche positive parziali dei loro dipoli elettrici in

stretta vicinanza al residuo di His fosforilato e quindi carico negativamente, stabilizzando così l’intermedio fosfoenzima.

L’E libera di idrolisi del legame tioestere è molto alta (ΔG= -36 KJ/mol), dunque può essere utilizzata per produrre E: viene incanalata in modo da dar luogo alla formazione di

• ATP o GTP a seconda della cellula.

Dal succinil-CoA si passa al succinato, viene liberata E con una mol di ATP.

• Nel sito attivo dell’enzima c’è un residuo di His esposto. A lv del sito entrano il succinil-CoA e Pi. Pi sostituisce CoA legandosi al succinato, sostituendo il legame tioestere con

• un fosfomonoestere. Il succinato poi si stacca e Pi si unisce a His. Quando ADP entra nel sito, Pi di lega a essa, formando ATP e lasciando l’enzima libero.

Nel sito attivo si sistema un gruppo fosfato, il succinil-CoA e il gruppo fosfato riesce a rimpiazzare il gruppo SH del CoA e a legarsi come intermedio, il CoA va via e poi una

• volta che il gruppo fosfato si è legato all’acido succinico, si forma il succinil fosfato, prende il sopravvento l’istidina che attrae su di se il fosfato che viene ceduto all’ADP.

La formazione dell’ATP a spese dell’E rilasciata dalla decarbossilazione dell’ è una fosforilazione a lv del substrato.

α-chetoglutarato

• N.B.: nel cuore e nei muscoli si libera ATP, nel fegato GTP.

• Seguono 3 step per ossidare un CH del succinato, così da ottenere ossalacetato. Il mitocondrio non ha deidrogenasi per passare da CH a C=O in un unico passaggio,

• 2 2

perché C=O è più reattivo di CH .

2

Tappa 6: Ossidazione del succinato a

fumarato -

Si ossida il succinato per ottenere il fumarato grazie al FAD, che diventa FADH (entra nella catena di trasporto degli e e li cede a

• 2

CoQ). L’enzima coinvolto è la succinato deidrogenasi (cl. 1)

La tappa 6 determina la riconversione che porta alla formazione dell’ossalacetato.

• Siccome una reazione di ossidazione diretta di uno dei due CH del succinato non esiste occorre che questo passaggio venga fatto a

• 2

tappe.

La riossidazione del CH a C=O è necessaria in quanto questo gruppo è molto più reattivo e dunque necessario nelle reazioni. Si cerca

• 2

di riformare un α-chetoacido.

La reazione che osserviamo è una redox e l’accettore di elettroni è il FAD che diventa FADH .

• 2

La formazione dell’insaturazione risulta essere fondamentale perché inizia ad aumentare la reattività della molecola.

• -

La succinato deidrogenasi (ubichinone) è anche il secondo enzima della catena di trasporto degli e . È posizionato a lv della

• membrana mitocondriale interna mentre tutti gli altri enzimi del ciclo si trovano dispersi nella matrice.

-

L’enzima contiene 3 diversi centri Fe-S e una mol di FAD legata covalentemente. Gli e estratti dal succinato passano attraverso il FAD e

• -

i centri Fe-S prima di entrare nella catena di trasporto. Il flusso di e dal succinato viene trasportato all’accettore finale, ovvero

-

l’ossigeno, è accoppiato alla sintesi di 1,5 mol di ATP per coppia di e .

Il malonato, un analogo del succinato normalmente assente nelle cell,è un forte inibitore competitivo della succinato deidrogenasi e

• quindi, se aggiunto nei mitocondri, blocca il CAC.

Tappa 7: Da fumarato a L-malato

Tramite l’H O, la fumarasi (liasi, cl.4) introduce un OH e fa sparire il doppio

• 2

legame C che riceve OH, che diventa alcolico. Si ottiene il malato.

È una reazione di idratazione reversibile. Lo stato di transizione è un

• carbanione. L’enzima è altamente stereospecifico e catalizza l’idratazione del

doppio legame trans del fumarato, ma non agisce sul doppio legame in cis del

malato, l’isomero cis del fumarato.

Il doppio legame presente nel fumarato viene attaccato dall’OH. Alla fine della

• reazione si ha la formazione di un carbonio alcolico.

Il fatto chela fumarasi sia altamente stereospecifica permette di riconoscere il

• fumarato in conformazione trans e produce L-malato. Lo stesso principio di

riconoscimento vale nelle reazione inversa.

ΔG= -3,5 KJ/mol

•

Tappa 8: Ossidazione del malato ad

ossalacetato

La L-malato deidrogenasi NAD-dipendente mitocondriale (cl.1)

• catalizza il passaggio redox che porta all’ossalacetato e un ulteriore

NADH.

In condizioni standard non è molto favorita la formazione

• dell’ossalacetato ma, essendo che nella cellula viene

costantemente sottratto (dalla reazione esoergonica della citrato

sintasi), la sua [] è mantenuta sotto 10 mol e dunque la reazione

-6

diventa favorita.

La reazione è favorita anche dalla reazione fortemente esoergonica

• della citrato sintasi.

Schema di reazione

E delle ossidazioni che avvengono nel

ciclo

Acetile: 2C entrano nel ciclo e si vengono a formare 2 CO . Si ha la

• 2

completa ossidazione dell’acetile, anche se i C ossidati non sono quelli

propri dell’acetile. L’E rilasciata dalle redox viene conservata: 3 mol di

NADH, 1 mol di FADH , 1 mol di ATP o GTP vengono prodotte per

2

essere utilizzate durante la fosforilazione ossidativa.

2 e ricavati da NADH: 2,5 mol di ATP; 2 e ricavati da FADH2: 1,5 mol di

- -

• ATP. In totale, 10 mol di ATP vengono ricavate dal ciclo di Krebs.

Contando anche le mol di glucosio (glicolisi, le mol di piruvato che

entrano nel CAC sono 2): 32 ATP, che equivalgono a E= 976 KJ/mol.

La completa ossidazione del glucosio da 2840 KJ/mol. In condizioni

• ideali viene conservata al 34%, ma in condizioni reali viene conservata al

65% (valore di ΔG necessario a formare ATP nella cell)

Perché l’ossidazione dell’acetato è

complicata

L’ossidazione di una mol di acetato a 2C a 8 step può sembrare

• una complicazione inutile e non in linea con il principio di massima

economia della cellula.

La funzione del CAC non è solo quella di ossidare l’acetato, ma è il

• cuore del metabolismo intermedio. I prodotti finali di molti

processi entrano nel ciclo e servono come nutrienti. Ad esempio

l’ossalacetato e l’ derivano da aspartato e

α-chetoglutarato

glutammato quando vengono degradate le proteine: dal ciclo

possono essere prelevati intermedi da usare come precursori in

varie vie metaboliche.

Anfibolismo del CAC

Il CAC è una via anfiblolica: ha significato sia catabolico che anabolico

• (gli intermedi sono il punto di partenza per le vie di biosintesi, e.g.: da α-

chetoglutarato a glutammato, quindi poi sintesi di AA e purine; e da

ossalacetato a aspartato, quindi asparagina e pirimidine. L’ossalacetato

può essere riconvertito in glucosio tramite gluconeogenesi. Succinil CoA

è un intermedio fondamentale nella sintesi dell’anello porfirinico

dell’eme. Nella cell vegetale è la partenza per costruire la clorofilla).

La via che va dal piruvato all’ossalacetato è una via anaplerotica, che si

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