Domande esame Strumentazione biomedica

Tipi di immunosensori e principi di trasduzione

Gli immunosensori sono un particolare tipo di biosensori basati sulla capacità degli anticorpi di riconoscere e legare a sé gli antigeni.

Tramite tecniche di ibridazione e clonazione è possibile produrre anticorpi monoclonali capaci di legarsi a qualsiasi tipo di molecola.

Il recettore (anticorpo) viene immobilizzato su un supporto e messo a contatto con la soluzione contenente l’analita da misurare.

L’anticorpo reagisce con gli antigeni in soluzione, quindi maggiore è la concentrazione di Ag più alto sarà il numero di Ac legato.

Gli immunosensori si classificano in diretti, se l’evento e la formazione del legame vengono rilevati direttamente tramite un sistema di trasduzione, e indiretti se introducono una marcatura (labelling) di Ag e Ac, quindi richiedono più passaggi, ma sfruttano metodi di trasduzione più efficienti.

I metodi di trasduzione principali sono di tipo elettrochimico, ottico, elettrico e gravimetrico; in generale quelli più utilizzati sono quelli ottici: fluorescenza indotta da un'onda evanescente (TIRF) e risonanza di plasmoni superficiali (SPR).

Un’ulteriore tipologia è quella a quarzo risonante, in cui un sensore gravimetrico a quarzo risonante modifica la sua frequenza di risonanza rispetto a un quarzo di riferimento, inseriti in un circuito oscillante, in funzione della variazione di massa dovuta alla presenza di antigene sul sensore.

Configurazioni e metodi di trasduzione degli immunosensori

Configurazione diretta

Diretta: 2 passi (immobilizzazione Ac su un supporto, esposizione all’analita Ag e misura dell’interazione Ac-Ag).

Configurazione competitiva

Competitiva: metodo indiretto, 4 passi (l'anticorpo viene immobilizzato su una superficie solida. La misura viene effettuata facendo interagire il campione, che contiene l'antigene in concentrazione incognita, con una concentrazione nota di antigene preventivamente marcato tipicamente con una particella fluorescente, fluoroforo).

L'antigene marcato compete con il campione da analizzare nell'occupazione dei siti anticorpali e il segnale così ottenuto è inversamente proporzionale alla concentrazione incognita.

Questa tecnica viene utilizzata in casi in cui l'antigene è troppo piccolo per essere rivelato con metodi diretti.

Configurazione a sandwich

A sandwich: indiretto, 4 passi (una volta che l'antigene ha reagito con l'anticorpo immobilizzato, viene introdotto un secondo anticorpo marcato che si lega con l'antigene già attaccato all'anticorpo sulla superficie, creando appunto una sorta di sandwich di cui l'antigene occupa lo strato centrale).

Il sistema a sandwich richiede due anticorpi monoclonali in grado di riconoscere due epitopi su due zone diverse dell'antigene.

Metodi di trasduzione

La percentuale di antigeni può essere rivelata con tecniche elettrochimiche, ottiche, elettriche (variazione di resistenza o di capacità), o gravimetriche (variazione di peso).

Tra i metodi rimanenti quelli più utilizzati sono quelli ottici: fluorescenza indotta da un'onda evanescente (TIRF) e risonanza di plasmoni superficiali (SPR).

Sensori al vetro per gli ioni sodio e potassio

Si utilizzano gli elettrodi al vetro con una composizione specifica tale che, cambiando le condizioni d’impiego, possa essere utilizzato per misurare l’attività dello ione sodio o potassio.

Non lo utilizziamo dove la concentrazione del potassio sia centinaia di volte maggiore di quella del sodio.

Per il vetro selettivo al potassio la misura nel liquido extracellulare è fortemente influenzata dalle variazioni dell’attività dello ione sodio.

Per le misurazioni intracellulari, invece, il potassio è più di dieci volte del sodio, quindi l’interferenza può essere trascurata.

E = E0 + RT/F ln (aK+ + 10aNa+) (vetro selettivo al potassio)

E = E0 + RT/F ln (aNa+ + 10aH+ + 0.005aK+) (vetro selettivo al sodio)

Elettrodo Ag/AgCl

L’elettrodo Ag/AgCl è uno degli elettrodi più utilizzati a causa della sua facile realizzabilità.

Questo elettrodo è composto da puro argento ricoperto da uno strato poroso di cloruro d’argento.

L’equilibrio è rappresentato dall’equazione Ag+ + Cl− ⇄ AgCl (solido).

Dall’anodo, gli ioni Cl− si combinano con gli ioni Ag+ per formare il prodotto; dal catodo, invece, gli ioni Cl− passano in soluzione sottraendo AgCl all’elettrodo.

Ag/AgCl è il più riproducibile, assieme all’elettrodo a idrogeno, affidabile e conveniente elettrodo di riferimento.

Due di questi elettrodi hanno potenziali che differiscono di meno di 50 μV, e questa differenza varia di meno di 10 μV dopo un lungo intervallo di tempo.

I microelettrodi per la misurazione intracellulare dell’attività dello ione cloro sono spesso costituiti da elettrodi Ag/AgCl.

Nei tessuti biologici, certe reazioni possono consumare lo strato di cloruro di argento fino a rendere l’elettrodo inservibile.

Possibili stati per una misura di temperatura tra un corpo X e un sensore S

• Caso 1: Sensore e corpo isolati dall'ambiente: Se il sensore e il corpo X sono termicamente isolati dall'ambiente, si ha una buona approssimazione della temperatura reale, ma serve un certo tempo per raggiungere l'equilibrio.
• Caso 2: Corpo con temperatura imposta da meccanismi esterni: Se Tx è determinata da fattori esterni e il sensore non perturba la temperatura, l'errore a regime è nullo.
• Caso 3: Sensore con auto-riscaldamento: Se il sensore genera calore, si introduce un errore di misura.
• Caso 4: Sensore non isolato dall'ambiente: Se il sensore scambia calore con l'esterno, bisogna minimizzare la resistenza termica tra sensore e corpo e massimizzare quella tra sensore e ambiente.

Esempio di biosensore a elettrodi interdigitali

Struttura ad elettrodi interdigitati ricoperta da un ossido sul quale vengono immobilizzati gli Ac di interesse (esempio anti-CRP, anti-TnPI/T).

Si forma un condensatore piano la cui capacità varia con il numero di anticorpi.

Strato anticorpale legato.

Varia la costante dielettrica relativa (ε_r) del mezzo contenuto tra le due facce del condensatore (C = ε0ε_rS/d).

Caratteristiche: no labelling, veloce nella risposta, economico, integrabile su silicio.

Elettrodo standard a idrogeno

L’elettrodo standard a idrogeno (SHE) è considerato un elettrodo di riferimento perché il suo potenziale di equilibrio a temperatura pari a 25°C, concentrazione 1M e pressione a 1 atm, chiamato potenziale elettrodico standard, è uguale a 0 V.

Questo elettrodo è costituito da una lamina di platino platinato immersa in una soluzione di ioni H+ nella quale è presente idrogeno allo stato gassoso.

La reazione redox alla base di questo elettrodo è 2H+(aq) + 2e− ⇄ H2(g).

L’elettrodo a idrogeno è uno dei più utilizzati perché è realizzabile molto facilmente.

Biosensori catalitici

I biosensori catalitici utilizzano la seguente relazione: E + S ⇄ ES → E + P, dove la prima reazione è catalizzata dalla costante di dissociazione K1 e vede enzima e substrato reagire per formare il complesso enzima-substrato, mentre la seconda reazione vede il complesso enzima-substrato formare il prodotto con costante di dissociazione K2.

Vengono chiamati catalitici per la funzione di catalizzazione degli enzimi, ovvero la capacità che hanno di accelerare le reazioni chimiche.

L’enzima che si adopera funge da biorecettore, il substrato fa da analita.

Il complesso enzima-substrato che si crea dopo la reazione tra enzima e substrato è il prodotto, che viene poi “letto” dal trasduttore.

I biosensori catalitici hanno una cinetica basata sulla cinetica di Michaelis-Menten.

v = Vmax[S]/(KM + [S]) dove KM è la costante di Michaelis-Menten, che indica la concentrazione di substrato per la quale la velocità della reazione corrisponde a metà della velocità massima possibile.

Caratteristiche dei preamplificatori dei segnali biomedicali

La preamplificazione è il primo stadio della catena di acquisizione ed è un passaggio importante in quanto è imputato al disaccoppiamento del segnale e alla reiezione dei disturbi comuni.

Ci sono diversi tipi di amplificatori operazionali utilizzati nel passaggio di preamplificazione e tutti hanno delle caratteristiche comuni da rispettare.

L’impedenza in ingresso all’amplificatore deve essere idealmente infinita.

Questo significa che il circuito, e quindi la strumentazione, preleva corrente nulla o quasi nulla dalla sorgente, facendo restare inalterato il segnale sorgente e senza rischiare di degradare.

Il CMRR deve tendere ad infinito, idealmente; quindi concretizzando, deve essere più alto possibile, soprattutto nel caso di pre-amplificatori differenziali.

Un alto CMRR (Rapporto di reiezione del modo comune) indica che il filtro è di ottima qualità e reietta molto bene il modo comune, tensione in ingresso uguale ad entrambi i morsetti dell’amplificatore operazionale.

Per rendere il CMRR tendente a infinito, bisogna che il guadagno di modo comune A sia nullo o almeno tendente a 0.

L’impedenza in uscita deve tendere a 0.

La banda passante deve tendere ad infinito, o essere il più