Domande esame Microbiologia

Resistenza antibiotici e antibiogramma

La resistenza agli antibiotici corrisponde alla mancata sensibilità di un microbo a uno o più agenti antimicrobici. Possiamo avere due tipologie di resistenza agli antibiotici:

• Resistenza naturale = è prevedibile in base alle caratteristiche del farmaco e del microbo. Ad esempio vediamo che cefalosporine e penicilline sono inattive sui micoplasmi.
• Resistenza acquisita = in questo caso si parte da un microrganismo che è sensibile a una determinata molecola, ma che in seguito a cambiamenti che possono avere diversa origine, diventa insensibile alla stessa molecola. La mancata sensibilità è legata a modificazioni del genoma batterico che si possono avere sia a livello del cromosoma che a livello dei plasmidi.

Questa resistenza può essere trasmessa alla progenie (trasferimento verticale) o da un batterio all’altro (trasferimento orizzontale: plasmidi). I geni di resistenza presenti nel cromosoma sono di più difficile diffusione, mentre quelli presenti sul plasmide possono essere diffusi più rapidamente.

I ceppi di resistenza sono generati tanto dall’uomo come dagli animali, e poi possono tornare all’uomo attraverso ingestione di materiale contaminato o attraverso alimenti.

La comparsa di ceppi resistenti è causata principalmente dall’enorme diffusione degli antibiotici e soprattutto dal loro uso indiscriminato e inappropriato, infatti è proprio l’antibiotico che porta alla selezione di microrganismi che possiedono il carattere di resistenza. I ceppi di resistenza sono la conseguenza dei fenomeni di plasticità genetica batterica. La resistenza può derivare da una modificazione spontanea e casuale del genoma o da un’acquisizione di geni codificanti sistemi di detossificazione.

Ci sono diversi meccanismi attraverso cui si esprime il carattere della resistenza:

• Sintesi di enzimi che inattivano la molecola del farmaco: abbiamo ad esempio a che fare con le beta-lattamasi, in particolare penicillinasi e cefalosporinasi, le quali rompono l’anello beta-lattamico delle penicilline e delle cefalosporine inattivandolo.
• Posso avere una modificazione della permeabilità di membrana, che impedisce al farmaco di entrare nella cellula.
• Sistemi di pompaggio che buttano fuori la molecola di farmaco non appena arriva dentro la cellula, in questo modo non si riesce a raggiungere la concentrazione efficace.
• Alterazione del sito sensibile (target) che non è più attaccabile dal farmaco.

L’antibiogramma è un test effettuato per determinare la suscettibilità di un ceppo batterico agli antibiotici; generalmente si isola un batterio da un paziente e si valuta la reazione con diversi antibiotici. Il pannello degli antibiotici è personalizzato in base al tipo di microbo e a dove è stato isolato.

L’antibiogramma classico, noto come test di Kirby Bauer, vede la disseminazione del batterio su una piastra, su cui poi vengono appoggiati dei dischi di carta impregnati con un antibiotico, si va quindi a valutare la misura degli aloni di inibizione. Questo test è stato soppiantato da E-TEST, in cui si usano delle strisce di carta impregnate di antibiotico, su queste strisce sono segnalati vari numeri che corrispondono alla concentrazione di antibiotico. Per misurare la MIC si guarda dove l’alone di inibizione interseca la striscia di carta. Questi test ci forniscono la MIC ovvero la concentrazione più bassa di antibiotico che risulta efficace per inibire la crescita di un batterio.

Che parte della struttura batterica viene attaccata dai farmaci antibatterici?

Un antibiotico o antimicrobico è una sostanza utilizzata per il trattamento di infezioni batteriche. Possiamo fare una distinzione di queste sostanze in base alla loro origine: possiamo infatti avere sostanze di origine naturale, estratte da funghi o batteri ed eventualmente modificate in vitro, che prendono il nome di antibiotici; oppure posso avere molecole sintetizzate da chimici farmaceutici che si chiamano chemioterapici.

Gli antimicrobici hanno un duplice effetto sui microrganismi:

• Batteriostatici = bloccano la crescita della colonia batterica per cui i microbi non sono più in grado di moltiplicarsi ma rimangono vitali. Per somministrare questi farmaci, il sistema immunitario del paziente deve essere perfettamente funzionante, perché è questo che andrà a uccidere i microbi.
• Battericidi = il trattamento vede l’uccisione di tutti i batteri, queste sostanze sono efficaci anche quando il sistema immunitario è compromesso.

Gli antibiotici sono divisi in svariate categorie in base al loro meccanismo d’azione, o meglio al bersaglio che hanno:

• Un grande gruppo di questi farmaci agisce sull’inibizione della sintesi della parete batterica: cefalosporine, penicilline e carbapenemi. Questi sono farmaci beta-lattamici, l’anello beta-lattamico che le caratterizza è omologo del dimero D-Ala-D-Ala, che viene legato normalmente dalla transpeptidasi (PBP), un enzima che crea ponti tra residui di catene adiacenti che funzionalizzano i NAM. La molecola di beta-lattamico si lega irreversibilmente a PBP impedendone l’azione, in questo modo il peptidoglicano non si irrigidisce e la parete batterica risulta essere fragile, si ha la lisi del batterio. Le beta-lattamasi sono enzimi idrolitici che tagliano l’anello beta-lattamico, in questo modo l’antibiotico non è più in grado di esplicare la sua funzione.
• Ci sono altre molecole antibatteriche che agiscono a livello dei ribosomi impedendo la sintesi proteica. Ci sono diversi gruppi che appartengono alla stessa classe e si differenziano nel target: alcuni legano la subunità 30S dei ribosomi (caratteristica dei batteri e dei mitocondri = bassa tossicità); altri legano la subunità 50S del ribosoma e infine alcuni legano il fattore di elongazione G che consente lo spostamento della catena peptidica da una parte all’altra durante la sintesi proteica. A questa classe appartengono macrolidi, tetracicline e cloramfenicolo.
• Alcuni farmaci antibatterici agiscono sull’inibizione della sintesi degli acidi nucleici: ci sono i chinoloni che inibiscono la sintesi del DNA e la rifampicina che inibisce la sintesi dell’RNA.
• Un’ulteriore classe sono gli antimetaboliti che inibiscono la sintesi dell’acido folico, troviamo i sulfamidici e il trimetoprim.

Cosa sono le endotossine batteriche, quali sono gli effetti biologici causati, qual è la modalità attualmente utilizzata nella farmacopea (saggi) per il dosaggio dei prodotti da somministrare per via endovenosa?

Le endotossine rappresentano una delle modalità che i batteri hanno per provocare danno e innescare un processo infiammatorio nell’ospite. Queste endotossine sono componenti della parete batterica, come LPS, peptidoglicano e acidi lipoteicoici, che vengono riconosciuti dai recettori dell’immunità innata e che inducono il rilascio di citochine.

La più potente endotossina batterica è il LPS, componente della membrana dei Gram-. Questo viene rilasciato nell’ambiente quando i batteri si lisano o quando vengono dispersi nell’ambiente dei frammenti di membrana esterna. LPS si lega a dei recettori solubili dell’ospite, il legame porta all’attivazione di una cascata di segnali all’interno della cellula che porta alla trascrizione di geni che collaborano allo sviluppo della reazione infiammatoria, con lo scopo di neutralizzare il microrganismo.

Se la quantità di citochine rilasciata è limitata, l’effetto sarà circoscritto, invece se le citochine vengono rilasciate in quantità esagerata, e se si verifica nel torrente circolatorio, si ha un effetto sistemico. Le citochine impattano sulla permeabilità dei vasi e sul tono della muscolatura vasale; causano un crollo della pressione arteriosa e una riduzione del volume circolante come conseguenza di una permeabilità aumentata (perfusione alterata). Le endotossine vengono anche chiamate pirogeni in quanto, se vengono inoculate possono causare un aumento della temperatura corporea.

Tra i saggi per il dosaggio delle endotossine, l’unico approvato dall’FDA è il LAL test, di cui esistono diverse varianti: una gelificazione e due cinetiche, una cromogena e una turbidimetrica. Tutti questi test si basano sulla presenza all’interno della linfa del Limulus di un pro-enzima, che quando entra a contatto con le endotossine, si trasforma nella forma attiva dell’enzima, la cui azione è quella di indurre la coagulazione.

• LAL test gel-clot: alla linfa preriscaldata si aggiunge una quantità prestabilita di campione da testare, questi vengono incubati a 37°C per 20-60 minuti. Se ci sono endotossine, il proenzima si attiva e si forma il coagulo, se non ci sono endotossine, la soluzione rimane liquida e non si forma coagulo. Se la quantità di endotossine è bassa, si può avere una situazione in cui si forma un gel semisolido. Il test non dà una risposta quantitativa.
• LAL test-kinetic → turbidimetrico: in questa variante del test si va a misurare l’intorbidimento della sospensione legata all’azione dell’enzima sulle proteine che portano alla formazione del coagulo. Queste letture allo spettrofotometro possono essere ripetute nel tempo oppure si può fare un’unica lettura al punto finale della reazione enzimatica.
• LAL test-kinetic → cromogenico: in questo caso viene introdotto un substrato su cui può agire l’enzima attivo che, trasformandolo, può generare colore. In questo caso se ho conversione da proenzima ad enzima si genera una sostanza cromogenica, altrimenti no. La conversione da proenzima ad enzima è proporzionale alla quantità di endotossine presenti e di conseguenza anche la quantità di sostanza cromogenica prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di endotossine. Si va quindi a misurare l’assorbanza del campione.

I test turbidimetrici o cromogenici danno delle risposte quantitative per cui si può determinare la concentrazione precisa di endotossine nel campione.

Esotossine?

Le esotossine sono proteine che vengono rilasciate dai batteri nell’ambiente extracellulare, che possono andare a danneggiare le cellule dell’ospite innescando un processo patologico. Alcune esotossine sono degli enzimi specifici che possono anche risultare letali per il soggetto. Queste possono essere secrete direttamente dal batterio attraverso sistemi di secrezione oppure possono essere rilasciate in seguito alla lisi della cellula. Sia Gram+ che Gram- possono produrre tossine.

Le esotossine non sono indispensabili, ma possono favorire la crescita batterica e la diffusione in determinati ambienti. I geni che codificano la produzione di queste tossine possono trovarsi in tre siti differenti: il gene può essere presente sul cromosoma batterico (tutti i ceppi di una specie batterica contengono quel gene); i geni codificanti sono presenti in plasmidi mobili (si hanno ceppi tossigenici e non tossigenici di un determinato batterio); e infine possono trovarsi in batteriofagi che infettano i batteri (il ceppo tossigenico è soltanto quello infettato dal fago).

Possiamo distinguere le esotossine in due gruppi in base al bersaglio d’azione: ci sono tossine che agiscono sulla matrice extracellulare e altre che hanno come target delle strutture cellulari, a loro volta possiamo distinguere alcuni sottogruppi.

• Le tossine che agiscono sulla matrice extracellulare vanno a danneggiare tutte quelle proteine che costituiscono e sostengono le cellule epiteliali o che servono a mantenere l’integrità e l’adesione di queste cellule.
• Rispetto alle tossine che hanno bersaglio cellulare, posso distinguere:
  • Tossine che agiscono a livello della membrana citoplasmatica senza modificare la struttura e senza penetrare all’interno della cellula.
  • Tossine che danneggiano in modo selettivo l’integrità della membrana citoplasmatica, ad esempio formando pori o degradando componenti di membrana.
  • Tossine che hanno target intracellulare: in questo caso c’è un recettore a livello della membrana, ma il target si trova all’interno della cellula. Sono generalmente composte di tre subunità: una serve a legare il recettore, una corrisponde alla componente enzimatica e quindi serve a modificare il substrato cellulare, e infine c’è un dominio di traslocazione che consente alla tossina di trasferirsi nel citoplasma.
  • Tossine che vengono inoculate dai batteri direttamente all’interno della cellula.

Le esotossine sono state utilizzate per lo studio di meccanismi della biologia cellulare, infatti permettono di attivare o disattivare determinate vie metaboliche; un’altra applicazione sono i vaccini e lo sviluppo di farmaci con attività citotossica.

Saggi di sterilità?

Con i saggi di sterilità si vuole dimostrare che il preparato non contenga nessun contaminante microbico. Tutte le procedure per eseguire il test devono essere svolte in ambiente sterile o in condizioni che non permettono la contaminazione ambientale.

Per svolgere i test, bisogna usare cappe a flusso laminare di classe B. Inoltre è necessario campionare in maniera adeguata il lotto da testare: bisogna ottenere una quantità idonea di recipienti in cui è presente il campione che devono essere sigillati e disinfettati.

La modalità con cui viene svolto il test dipende dal materiale da analizzare: se il materiale è liquido si utilizza la filtrazione su membrana, mentre se il materiale è solido può essere inoculato direttamente in un terreno di coltura. In questo modo si rilevano microbi vivi e quindi potenzialmente dannosi.

• Materiale liquido → filtrazione: vengono utilizzate specifiche membrane che intrappolano tutti i batteri e funghi. La membrana su cui si è filtrato il materiale, si posiziona poi su una piastra contenente del terreno di coltura appropriato per batteri e funghi e si verifica se crescono colonie sulla superficie del filtro.
• Materiale solido → inoculazione su terreno: il materiale viene inoculato sul terreno di coltura, sia liquido che solido. Se ci sono microrganismi e il terreno è liquido, si verifica torbidità; mentre nel caso di terreno solido avrò crescita di colonie.

In entrambi i casi, devo incubare il materiale per 14 gg a una temperatura di 30-35°C nel caso in cui si ricerchino batteri; mentre a 20-25°C se cerco funghi. Al termine dei 14 gg se non si osserva crescita microbica, significa che il campione è sterile; se invece si osserva la presenza di colonie in caso di terreno solido, o di intorbidimento nel terreno liquido, il materiale non è sterile.

Parallelamente al saggio di sterilità, va effettuato il saggio di fertilità, che conferma che il terreno utilizzato sia adatto a supportare la crescita microbica: vengono inoculate nel terreno delle specie microbiche standard e dopo 3 gg di incubazione si verifica la comparsa di colonie; se queste compaiono, il terreno è fertile.

Valutazione della contaminazione microbica

Alcuni farmaci, somministrati per via orale o topica, non necessitano del requisito della sterilità, in ogni caso ci sono dei limiti legati a quanti e quali microbi sono presenti. La quantità di microbi accettata è limitata e soprattutto è necessario che non vi siano presenti microbi patogeni. I saggi sono quindi diretti alla determinazione quantitativa della carica microbica, che qualitativa di alcuni microrganismi per i quali sono fissati determinati limiti.

Per la determinazione quantitativa si parte da una quantità precisa di campione che viene diluito in una soluzione acquosa o in una soluzione tampone a pH 7. Si possono poi usare due tipi di semina:

• Semina superficiale = si semina il materiale sulla superficie della piastra.
• Semina indiretta per inclusione = il materiale semisolido può essere posizionato sul fondo della piastra, dove poi si aggiunge il terreno.

In entrambi i casi si va a contare il numero di colonie che si sono formate. La conta totale è data dalla componente batterica e da quella funginea; esistono poi delle tabelle nella farmacopea per vedere se il prodotto con cui si sta lavorando rientra nei limiti massimi di contaminazione accettati.

Vaccini non replicativi: tipologie, composizione, vantaggi e svantaggi?

I vaccini non replicanti sono costituiti da una parte di un microrganismo o da un microrganismo in toto ucciso. I microrganismi possono essere uccisi attraverso varie strategie, ad esempio con il calore, con i raggi UV, oppure grazie all’utilizzo di fattori chimici. Proprio a causa di questa loro caratteristica sono considerati i meno pericolosi, infatti non c’è la possibilità che diano un’infezione causata dalla reversione del microbo; al massimo possono dare reazioni allergiche a una delle sue componenti.

Abbiamo però degli svantaggi associati a questi vaccini, in primo luogo bisogna utilizzare adiuvanti per far sì che la risposta immunitaria sia abbastanza efficace; in secondo luogo, dato che la risposta generata è di breve durata, sono necessarie più dosi di richiamo. Un altro problema di questi vaccini è che i microrganismi vengono coltivati in vitro, in questo ambiente non c’è competizione, quindi può portare alla selezione di microrganismi che dal punto di vista antigenico sono molto diversi da quelli in vivo.

• Virus con microrganismi uccisi: ad esempio abbiamo il vaccino anti-influenzale → inizialmente si isolano i ceppi influenzali, il virus viene espanso all’interno di uova di pollo embrionate; successivamente il virus viene isolato e il vaccino viene allestito con un mix di ceppi virali differenti, che saranno disattivati con il calore o con altri agenti.
• Virus a subunità: si prende una porzione del bat