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Strutturistica di Macromolecole Appunti scolastici Premium

Appunti di laboratorio biomolecolare sulla Strutturistica di Macromolecole basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof.ssa Di Nardo dell’università degli Studi di Torino - Unito, Facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Laboratorio biomolecolare docente Prof. G. Di Nardo

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rimangono filamento disorganizzato, che possono legare substrati diversi. Le catene laterali in un

foglietto β stanno al di sotto e al di sopra del piano del foglietto che in questo caso è la botte,

all’interno della botte ci sono diversi layer, quelli più interni sono formati da aa idrofobici, mentre

quelli più esterni devono iniziare ad interagire con il solvente, pertanto saranno polari e carichi.

I foglietti α/β sono diversi, in questi domini le α-eliche sono da entrambi i lati e la struttura non

tende a richiudersi, in questa topologia ci sono due elementi di struttura secondaria che portano

dei loop che vanno da parti opposte, è lo switching point ed è importante perché forma delle

fessure, questa fessura è importante perché normalmente alloggia qualcosa, un substrato, un

cofattore.

Domini tutti β:

Barrels Greek key Jelly rool

Struttura botte tutta β: i foglietti β sono antiparalleli

Botte a chiave greca: deriva dall’unione di due motivi a chiave greca

Jelly roll: ci sono dei loop che attraversano le vasi della struttura cilindrica, ricoprono le basi come

la gelatina sulle basi.

Proteine di membrana

Ci sono proteine che stanno sulla membrana della cellula, nucleare, del RE, dei mitocondri che

sono coinvolte in processi processi che permettono la sopravvivenza.

Per capire come sono fatte bisogna risolverne la struttura, usando cristallografia a raggi X o NMR

che richiedono un campione puro. Per avere un campione puro devo estrarre la proteina dalla

membrana, ma le sue regioni molto idrofobiche in acqua andrebbero incontro ad aggregazione

casuale. Per le proteine estrinseche (che attraversano solo una volta la membrana) è tutto molto

più semplice, mentre quelle intrinseche (che attraversano molte volte la membrana) sono più

difficili da purificare. Si utilizzano molecole che hanno le stesse caratteristiche dei fosfolipidi di

membrana, molecole antipatiche, ovvero i detergenti. Quando estraiamo delle proteine di

membrana con dei detergenti la zona idrofobica della proteina va ad interagire con le code apolari

dei detergenti, è come se i detergenti facessero da tramite tra le regioni idrofobiche della proteina

e l’acqua, così si può avere una soluzione cristallizabile, perché le proteine si aggregano seguendo

un ordine specifico che è quello che deve succedere per ottenere cristalli di proteina. +

Le proteine di membrane hanno diverse funzioni, per esempio il canale ionico per il K

ha una struttura tale perché solo il potassio possa passare,

è formato da 4 subunità, quando il canale + aperto lo ione

usa usa i loop e il legame C-O del backebone, allinea tutti

gli atomi con carica negativa per attrarre lo ione positivo, in

+

questo il K e non un altro perché l’ampiezza del canale è

+

ottimizzata per far passare solo K , uno ione più grande non

riuscirà a passare e uno troppo piccolo non verrà attratto

dalle parziali cariche negative. Quando il canale è chiuso c’è

un cambio di conformazione tale per cui i loop vengono

sposati e non attraggono più gli ioni potassio

struttura di uno ione potassio

Durante l’esercitazione costruiremo

un profilo di elettrofobicità degli aa e

utilizzeremo una scala che dà ad ogni

aa un valore di idrofobità, ad aa

molto idrofobici dà valori molto

positivi, a quelli carichi da i valori più

negativi. Costruiamo un plot in cui

sull’asse delle X è indicato il numero

dell’aa e sull’asse delle Y il valore di

idrofobicità. Discriminiamo dei picchi

che corrispondo a punti molto

idrofobici della sequenza, ovvero

regioni transmembrana.

CATH è la bancadati in cui i domini proteici vengono classificati.

Metodi che permettono di risolvere la struttura tridimensionale delle proteine.

Le metodologie più utilizzate sono la cristallografia a raggi X e la Risonanza Magnetica Nucleare.

Esistono poi metodi bioinformatica di modelling molecolare, per omologia e ab initio.

Sia la cristallografia a raggi X che la NMR richiedono una alta concentrazione di proteine pure

(100s μl in pochi mM). Ci sono dei problemi:in campioni così concentrati possono avvenire

fenomeni di aggregazione e il sistema di espressione di proteine è eterologhe non è così efficiente.

Per ottenere delle proteine umane le faccio esprimere in un ospite, metto il gene in un plasmide,

introduco il vettore in un batterio e gli faccio esprimere la proteine, ma i batteri tendono a

degradare o compartimentalizzare la proteina estranea in corpi di inclusione, quindi si deve fare in

modo che la proteina venga espressa ma non troppa.

(I vettori di espressione possono essere batteri, lieviti o cellule animali)

Esiste inoltre la cryo electron microscopy, cioè microscopia elettronica a bassa temperatura, non

arriva al dettaglio atomico, il ribosoma ad esempio può essere visto con questa tecnica.

Sono tutti metodi indiretti che dall’osservazione di un fenomeno permettono di costruire dei

modelli che spieghino quel dato fenomeno.

Cristallografia a raggi X: sfrutta una radiazione elettromagnetica in una certa regione per riuscire a

vedere come sono fatte le molecole. I raggi X sono diffratti solo se le molecole biologiche sono in

forma cristallina, il cristallo proteico si comporta quindi come un reticolo di diffrazione.

Con la cristallografia a raggi X otteniamo delle mappe di densità elettronica.

Ada Yonath per la prima volta ha ipotizzato che si potessero cristallizzare i ribosomi osservando

che questi in condizioni di stress termico, come durante il letargo di alcuni animali, si dispongono

in maniera ordinata a contatto con la membrana cellulare, quindi è possibile ottenere delle

strutture ordinate di molecole molto grandi e questa è la base della cristallografia, quindi ha

selezionato ribosomi da animale che vivono in condizioni estreme, in particolare da batteri che

vivono nel Mar Morto. Per la cristallografia non ci sono limiti di taglia, ma ci si chiede se la

struttura non sia viziata dal packing cristallografico, mentre questo problema non c’è nell’NMR

perché la proteina in soluzione mantiene la sua dinamicità. Le strutture cristalline non sono in

realtà completamente fisse: in un cristallo ci sono ancora i moti vibrazionali degli atomi; ci sono

regioni loop che hanno ancora la possibilità di essere flessibili perché il packing cristallino lo lascia

fare, il packing potrebbe prevedere un alta percentuale di solvente per cui le molecole sono più

distanziate e questo loop può muoversi, quando andrò a risolvere la struttura non vedrò bene la

densità elettronica associata a questo loop perché, se continua a muoversi, i raggi X incontrano il

loop sempre in posizioni diverse e la sua densità elettronica non sarà fissa, ciò non è un problema

nell’NMR perché mi permette di vedere il loop in più conformazioni.

La biocristallografia negli anni 60 ha permesso di risolvere la struttura di alcune proteine.

-10

I raggi X hanno delle lunghezze d’onda che sono in dei range ,10 =amstrong, 1 o 2 amstrong sono

le lunghezze dei raggi X, noi dobbiamo avere dei raggi X compatibili con ciò che vogliamo vedere,

nel nostro caso le distanze interatomiche. La diffrazione è quel fenomeno per cui un’onda

elettromagnetica devia quando incontra una fenditura (o una apertura) avente dimensioni

paragonabili o minori rispetto alla lunghezza d'onda.

Per cristallizzare una proteina devo:

- innanzitutto far un espressione eterologa della proteina;

-purificala;

- cristallizzarla

- a questo punto devo testare il cristallo per vedere se dà una diffrazione di buona risoluzione

- poi fare una raccolta dei dati;

-devo poi fare un processamento dei dati che mi consente di avere mappe di densità di elettronica

sulla base delle quale vado a costruire un modello (dove c’è tanta densità piazzo un atomo), faccio

cioè un fitting.

Cristallizzare una proteina significa farla passare da stato solubito a stato solido.

Sull’asse delle X è riportata la

concentrazione dell’agente cristallizzante

(Sali, solventi, che scelgo io) che farà

precipitare la mia proteina, mentre sull’asse

delle Y c’è la concentrazione delle proteine.

Superata la curva di saturazione la proteina

non è più solubile e precipita, si supera la

curva di saturazione aumentando la

concentrazione dell’agente cristallizzante

diagramma di fase oppure aumentando la concentrazione

proteica o contemporaneamente entrambe,che è quello che si fa normalmente. Il problema è che

molto spesso la proteina precipita sottoforma di precipitato amorfo, per cui devo andare a

beccare qual è il punto della curva che consente che la proteina precipiti in maniera ordinata.

L’andamento della curva indica che la solubilità di una

certa proteina aumenta fino ad un certo punto per

poi diminuire, per cui ci sarà una concentrazione una

concentrazione di sale ottimale per avere una

o

s lubilità ottimale. I residui polari carichi esterni delle

proteine stanno bene se ci sono ioni che formano

ponti salini che fanno da mediatori tra i residui carichi

e le molecole d’acqua, inoltre intorno alle proteine ci

sono delle molecole d’acqua che vanno ad interagire

con la proteina attraverso interazioni polari, quando c’è troppo poco sale (es. NaCl) non tutte le

cariche superficiali della proteina sono mascherate, la situazione ottimale è quella in cui

concentrazione del sale sarà sufficiente per andare a mascherare le cariche superficiali della

proteina e l’acqua potrà formare un guscio di idratazione della proteina. Se il sale è troppo, c’è il

salting out, la proteina forma degli aggregati e precipita, perché il sale è troppo e l’acqua pensa

prima a sciogliere il sale anziché idratare la proteina.

Salting-in→ aumento della solubilità della proteina all’aumentare della concentrazione di sale

Salting-out→riduzione della solubità della proteina all’aumentare della concentrazione di sale

Ma nella maggior parte dei casi si

ottiene un precipitato amorfo.

Questo grafico della cinetica

(processo nel tempo) della

cristallizzazione mostra che c’è una

barriera energetica da oltrepassare

perché si formi il cristallo. Sull’asse

delle Y è inicato il Δg (l’energia) e

e sull’asse delle X il tempo. Si parte da una proteina in soluzione, in un primo momento questa

precipita in maniera causale, formano aggregati non specifici, ma ci può essere un altro caso in cui

si possono formare aggregati specifici e questi sono i nuclei cristallini,i primi nuclei aggregati

specifici, ovvero i critical nuclei e da questo momento in poi il processo dal punto di vista

energetico è favorito.

In un cristallo le molecole sono ordinate, ogni reticolo cristallino è formato dalla ripetizione per

traslazione nelle tre dimensioni dello spazio della cosiddetta cella elementare, che ha tre

dimensioni a, b e c e può avere diversi angoli tra a/b/c, pertanto per definire una cella elementare

ci servono sei parametri di cella: a,b, c, α, β e γ.

In ogni cella elementare può esserci una molecola oppure due molecole, che non sono messe a

caso l’una rispetto all’altra, ma sono simmetriche e in particolare sono relazione una all’atra per

effetto simmetria rotazionale di ordine 2 (ruotando di 90° trovo lo stesso elemento, questo è

l’elemento di simmetria più semplice.

Ci sono altri elementi di simmetria: come assi di rotazione di ordine 4 o 6.

Ci possono essere altri elementi di simmetria, i cosiddetti piani di riflessione: ovvero si possono

avere due immagini speculari che sono una l’immagine speculare dell’altra, ma gli aa in natura

soENTno L e lo speculare sarebbe D, che in natura non esiste.

Le celle elementari, descritte dai parametri di cella, possono essere di 7 e da qui nascono i 7

sistemi cristalli, che si distinguono in base alla geometria della cella.

METODO SPERIMENTALE PER CRISTALLIZARE UNA PROTEINA

Metodo della diffusione di vapore:

è quello che si usa più comunemente. In un pozzetto abbiamo una soluzione cristallizzante, che

viene chiamata reservoir, nel setup Hanging Drop (uno dei tre possibili) questo pozzetto viene

sigillato con un vetrino da cui pende una goccia, nella goccia c’è la proteina più l’agente

cristallizzante (di solito 2μl di proteina di 2 μl di agente cristallizzante). all’interno del pozzetto si

forma un sistema che tende all’equilibrio: se la reservoir ha 2 M di NaCl, la concentrazione di

agente cristallizzante nella goccia deve essere di 1 M (è diluita di 1:1), quindi il sale sarà più

concentrato nel reservoir rispetto alla goccia, quando un sistema tende all’equilibrio tende ad

equilibrare le concentrazioni. quindi l’acqua tenderà ad evaporare dalla goccia nel pozzetto, quindi

proteina e sale nella goccia si concentrano e quindi “mi muovo” lungo la diagonale del diagramma

di fase e quindi la proteina precipita.

Questo metodo ha altri due possibili setup:

Sitting Drop: c’è un ponticello (microbridge) nel pozzetto in cui mettere la goccia e poi si chiude, è

più comodo si sigilla con lo scotch

Il Sandwich Drop è molto poco usato.

I pozzetti che si usano sono nelle piastre da 24 o 96 perché la cristallizzazione è un processo in cui

bisogna fare uno screening di più concentrazioni possibili.

Ci sono dei Robot di cristallizzazione si può impostare una goccia di 0,2 μl molto utili nel caso di

una proteina difficile da sintetizzare perché permettono, a parità di proteina di fare più prove.

I cristalli di proteina e di sale si distinguono perché al tatto i cristalli di proteina sono molto fragili

Dati due piani reticolari immaginari che contengono un certo numero di atomi vengono posti

aduna distanza D, vogliamo capire quando c’è diffrazione.

Ho diffrazione quando c’è interferenza costruttiva, quando ho interferenza costruttiva l’onda

risultata è più grande delle due che la compongono e io vedo interferenza costruttiva. Ho

interferenza costruttiva quando le due onde sono in fase, due onde sono in fase se compiono lo

stesso cammino alla stessa velocità nello stesso momento oppure quando la differenza del

cammino percorso è pari ad un numero intero di lunghezze d’onda.

La legge di Bragg definisce matematicamente quando due raggi escono in fase nλ = 2 d sinθ

Dati due raggi che battono su due piani reticolari voglio capire qual è la differenza di cammino che

i due raggi percorrono. ( nel fenomeno di riflessione l’angolo di incidenza θ è uguale all’angolo di

riflessione). La differenza di cammino tra i due raggi, secondo la legge di Bragg deve essere uguale

ad un numero intero di lunghezze d’onda, è la base di un triangolo rettangolo dove si può

dimostrare che questo angolo è θ, in un triangolo rettangolo un cateto è uguale all’ipotenusa per il

sen θ ( l = d sinθ).

Anche se considero una sola famiglia di piani reticolari e li metto con una orientazione del raggio X

per cui sia rispettata la legge di Bragg, tutti gli atomi che vedo su quei piani mi daranno

interferenza positiva, ma per ogni orientazione avrò anche degli atomi fuori dai piani che

interferiscono comunque con il raggio X, daranno un interferenza distruttiva.

Noi irradiamo il cristallo e abbiamo più spot, ogni spot di diffrazione rappresenta la riflessione del

raggio X di un certo set di piani di Bragg paralleli posti ad una certa distanza d, e quel set di piani di

Bragg è ad un θ tale per cui la legge di Bragg viene rispettata e si ha interferenza costruttiva e

pertanto vedo lo spot. Durante la racconta la raccolta dati devo ruotare il cristallo per cambiare il

piano di impatto dei raggi X così posso andare a vedere un interferenza costruttiva dove prima

non c’era, metto in condizione altri atomi di rispettare la legge di Bragg e dare interferenza

costruttiva. Non dimenticare che per ogni evento di diffrazione gli atomi che stanno sui piani di

Bragg danno interferenza costruttiva, ma gli altri danno interferenza distruttiva, quindi l’onda

risultante avrà un’ampiezza che dipende da quanti atomi stanno nel piano di Bragg e da quanto

stanno fuori gli altri atomi dal piano di Bragg.

Il problema della fase: gli spot saranno più meno intensi in base a quanto sono concentrati atomi

sui piani di Bragg, l’onda risultante avrà una certa ampiezza e una certa fase sperimentalmente

posso misurare solo l’ampiezza dell’onda, che è proporziona all’ intensità dello spot, non c’è un

modo diretto per capire in che fase è l’onda diffratta, pertanto nelle proteine si usano due

strategie: la prima Molecular Replacement si basa sul fatto che nella Protein Databank sono state

depositate delle strutture omologhe, quindi conosco più o meno la posizione degli atomi nel

cristallo e da ciò riesco ad orientarmi e calcolare delle fasi; ci sono poi altri metodi che si basano

sull’introduzione di atomi pesanti che hanno un numero atomico più elevato rispetto a quelli che

ho nella proteina, il contributo alla diffrazione degli atomi pesanti sarà consistente, se io ho una

raccolta dati di un cristallo nativo e di uno derivato (quello con atomi pensati) dalla differenza io

risalgo alla posizione degli atomi pesanti . Per introdurre gli atomi pensanti si fanno delle

incubazioni del cristallo con questi atomi che si vanno a legare a residui specifici della proteina,

quello che si fa molto è aggiungere delle Selenio-Metionine, nella catena laterale al posto dello

zolfo introduco il selenio che è un atomo pesante, il selenio si inserisce durante la fase di

espressione, usando un terreno di coltura povero in cui l’unico aa da incorporare è la Selenio-

Metionina. La funzione Trasformata di Furiè inversa che riesce dall’analisi degli spot di diffrazione

a ricavare la funzione densità elettronica, otteniamo le mappe di densità elettroniche da cui

costruiamo il modello,facciamo un fitting, il chè è molto difficile se si ha una risoluzione bassa .

Å)

(buona risoluzione è 1

Risonanza magnetica nucleare (NMR)

Il campione da analizzare è in soluzione, la proteina non deve cristallizzata e questo comporta un

vantaggio sperimentale perché spesso è difficile cristallizzare alcune proteine e inoltre riusciamo a

cogliere meglio la flessibilità della proteina. È una tecnica che si basa sul segnale dato dai nuclei

atomici, ogni nucleo atomico dà un segnale, ma un grosso limite è dato dalla taglia molecolare

della proteina ( il limito massimo è 60 kDa). Anche questa è una tecnica spettroscopica, in questo

caso parliamo di assorbimento di radiazione elettromagnetica (nella cristallografia si parla di

scattering). La spettroscopia NMR misura l'assorbimento di radiazione elettromagnetica in

molecole immerse in un forte campo magnetico. Questo assorbimento avviene ad opera dei nuclei

di particolari atomi (tipicamente 1H o 13C). Quindi con l'NMR si esaminano direttamente inuclei

atomici e non gli elettroni. Ogni informazione sull'intorno chimico viene dedotto osservando il

comportamento dei nuclei atomici.

Anche i nuclei atomici hanno uno spin nuclare, ruotano e noi analizziamo gli spin.

Con l’ NMR in realtà si osservano solo i nuclei atomi che hanno un momento magnetico nucleare

di spin (m), lo spin nucleare viene prodotto dalle particelle che costituiscono il nucleo, ovvero

protoni e neutroni. m= gIh/2p [g=rapporto giro magnetico; costante di Plank

I= n° quantico di spin nucleari]

In molti atomi (come nel 12C) gli spin sono tutti appaiati, uno in opposizione all'altro e quindi si

annullano reciprocamente e il nucleo atomico ha uno spin risultante I uguale a zero. In alcuni

atomi, però, (come in 1H e in 13C) il nucleo possiede uno spin risultante I diverso da zero. Le

regole per determinare lo spin nucleare si possono così riassumere:

1) Se i protoni e i neutroni sono entrambi pari, allora il nucleo ha spin zero.

2) Se i protoni e i neutroni sono gli uni pari e gli altri dispari, allora il nucleo ha spin semiintero

(1/2, 3/2, 5/2, ...).

3) Se i protoni e i neutroni sono entrambi dispari, allora il nucleo ha spin intero (1, 2,3, ...).

Quando un nucleo dotato di spin viene immerso in un campo magnetico, il nucleo, come l'ago di

una bussola, è sottoposto ad una coppia di forze che lo fanno ruotare per allinearlo col campo

magnetico esterno.

Il vettore che gira descrive il momento magnetico nucleare di spin, questo può puntare verso

l’altro (+½), ma anche verso il basse se avesse il valore di spin completamente invertito (-½).

Questi due spin da un punto di vista energetico stanno su due livelli diversi, per variare lo spin da

+½ a -½ bisogna dare energia al nucleo atomico.

In assenza di campo magnetico gli spin sono distribuiti

in maniera random, quando applico un campo

magnetico il momento magnetico di spin è allineato

con il vettore del campo magnetico applicato B 0,

pertanto ho atomi che presentano tutti spin allineati, si

distingue un atomo dall’altro in base alla frequenza con

cui esso gira. La frequenza o moto di precessione dei

momenti magnetici nucleari avviene con una frequenza

proporzionale alla differenza di energia tra i due livelli

detta frequenza di Larmor, che sarà diversa per ogni

atomo

All'aumentare del campo applicato Bo, aumenta la frequenza di Larmor e quindi la differenza di

energia tra i livelli. Per fare avvenire una transizione nucleare da uno spin all’altro devo applicare

degli impulsi di radiazione elettromagnetica, quando do un impulso con energia tale da far passare

il nucleo da spin +½ a –½, ottengo un segnale e la differenza tra i due stadi è proporzionare alla

frequenza di Larmor che è la velocità con cui lo spin nucleare gira, che è diverso per ogni atomo,

quindi dovrò dare per ogni atomo un pacchetto di energia diverso per ottenere la transizione. La

frequenza di Larmor dipende dall’intorno chimico quindi due atomi di C che si trovano in punti

diversi in una proteina avranno bisogno di un pacchetto di energia leggermento diverso per fate

una transizione di spin nucleare quando la proteina è immersa in un campo magnetico.

Se il campione viene irradiato con una radiazione elettromagnetica di frequenza uguale alla

frequenza di Larmor (impulsi di radiofrequanza, RF), ci sarà una interazione della componente

magnetica della radiazione con i momenti magnetici nucleari (anche questi oscillanti alla

frequenza di Larmor). L'energia della radiazione potrà così essere trasferita ai nuclei. Ogni

assorbimento di radiazione comporta un cambiamento di orientazione dello spin nucleare che

ruoterà da allineato con il campo ad opposto al campo. Quando si verifica questa transizione di

spin, si dice che i nuclei sono in risonanza con la radiazione applicata, da qui il nome di Risonanza

Magnetica Nucleare, NMR. Il segnale NMR negli strumenti più moderni viene generato con il

metodo ad impulso. Con questa tecnica tutti i nuclei di una specie vengono eccitati

contemporaneamente da un impulso di radiofrequenza che contiene tutto l'intervallo di frequenze

necessario. Quando i nuclei tornano al loro stato di equilibrio, essi emettono una radiazione RF

che può essere misurata. La frequenza della radiazione emessa dipende dall’ambiente molecolare

intorno al nucleo ed è diversa per ciascun atomo. Le diverse frequenze generate dagli atomi

vengono rapportare ad un segnale di

riferimento (tetrametilsilano) e sono chiamate

chemical shift. Nell’NMR si misura il chemical

shift. I 6 atomi di H in questa molecola si

trovano in ambienti diversi e danno segnali

diversi, per cui possiamo risolvere la struttura

dell’etanolo grazie al fatto che abbiamo

segnali diversi. Questo è uno spettro NMR

monodimensionale, sto vedendo il chemical

shit di un certo tipo di atomi (qui H)


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher vanessa.falvo di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Laboratorio biomolecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Di Nardo Giovanna.

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