Molecular cellular and tissue engineering

CELLULE PRIMARIE DIFFERENZIATE

Cellule che derivano dal tessuto. Ognuna porterà quelle che sono le caratteristiche tipiche funzionali e morfologiche delle cellule del tessuto. Dopodiché passo alla subcoltura. Nel caso di colture neuronali non ho colture secondarie perché il neurone non si divide.

La coltura primaria ha il vantaggio che derivando direttamente dal tessuto ne può riprodurre in modo più fedele alcune attività. Ha una vita limitata. Attività più lunga e dispendiosa.

Nella subcoltura il fenotipo è fedele però è più invecchiata, può deviare da un comportamento in vivo. Il fatto di essere stata più tempo in laboratorio in realtà è più esposta a fattori esterni e può deviare dal comportamento corretto se non è tenuta nelle giuste condizioni.

EVOLUZIONE DI UNA COLTURA CELLULARE

Curva da tenere a mente: a seconda del fenotipo cellulare avrò una curva

La trasformazione può essere spontanea ma più spesso è indotta tramite infezione virale o agenti chimici, per cui la cellula diventa una cellula tumorale, che chiamiamo immortalizzata.

La trasformazione può avvenire tramite trattamento delle cellule (virale o agente mutageno). Le cellule tumorali sono una grande risorsa per la ricerca. Come le cellule HeLa si possono acquistare. Esistono linee cellulari di praticamente tutti i tessuti tumorali.

Le cellule tumorali perdono quella che viene chiamata inibizione da contatto. Non solo non invecchiano e sono immortali. Ad un certo punto non c'è più spazio, la cellula si stacca, si divide, le cellule figlie tornano giù non trovano spazio e muoiono. Invece, le cellule tumorali non muoiono, sono in grado di crescere in multistrato, sono quelle che in vivo sono masse tumorali. Hanno una mutazione genica che fa perdere loro l'inibizione da contatto.

LINERA

CELLULARE CONTINUA O IMMORTALIZZATA

Cellule tumorali. Facili da coltivare perché resistenti. Si comprano in sicurezza. Sono omogenee. Vengono vendute e viene fornito un protocollo per coltivarle, sono standardizzate. Possono essere utilizzate per studi su tumori, per studi di tossicità. Cellule ben diverse da una cellula sana. Non hanno applicabilità clinica.

REPERIBILITÀ DELLE LINEE CELLULARI

Esistono banche cellulari. Video ("jove - Passaging Cells | Protocollo") 11.05.2020

Quando parliamo di coltura cellulare teniamo a mente che abbiamo le varie possibilità, quali cellule possiamo mettere in coltura. Cellule primarie differenziate e cellule di linea. Abbiamo anche le cellule staminali che seguono protocolli particolari, un po' più complicati. Cellule staminali che non solo possono essere prelevate da un organismo nelle sue diverse fasi di sviluppo ma possono essere acquistate.

po' diversa: abbiamo bisogno di una co-coltura con delle cellule di supporto definite feeders, spesso sono fibroblasti ma dipende dal fenotipo cellulare verso cui le vogliamo differenziare, se ad esempio vogliamo differenziarle verso i neuroni le cellule feeders sono gli astrociti.

In un'applicazione più classica abbiamo cellule primarie differenziate cioè cellule che provengono direttamente dal tessuto e che sono già differenziate. Le cellule primarie differenziate, se replicanti, dopo tot tempo che dipenderà dal loro fenotipo cellulare andranno in contro a duplicazione e nel momento in cui giungono a confluenza vengono passate in altri contenitori e si parla di sub-coltura.

Anche le cellule primarie differenziate possono essere acquistate come le cellule di linea.

Purezza: nel tessuto neuronale non abbiamo soltanto la cellula funzionale del neurone ma abbiamo anche la glia. Sono eterogenee. Invece le cellule di linea sono cellule omogenee, un unico

TIPOLOGIE DI COLTURE CELLULARI

Primarie, secondarie, continue, in sospensione, monostrato.

SISTEMI DI CRESCITA

Se ho cellule che crescono in adesione: bottiglie o piastre dove le cellule crescono adese ad una superficie del contenitore, sono immerse nel terreno di coltura. Le piastre possono essere funzionalizzate sulla superficie per presentare delle molecole adesive oppure no. Critico per alcuni fenotipi cellulari (neurone, cardiomiocita, necessitano di trovare sulla superficie il giusto messaggio per aderire).

Sospensione: fiasche rotanti, le cellule vengono mantenute sospese immerse nel terreno di coltura. Ci concentriamo sulle cellule che crescono in adesione.

COLTURE ADESE

Piastre di Petri, bottiglia con buchino sul tappo. Le cellule devono respirare. Piastre multipozzetto (utili per tanti test in parallelo). Sistemi di plastica (polistirene), monouso e sterili. Siamo in una situazione che non è favorevole solo alla crescita delle cellule eucariotiche ma anche procariotiche (batteri).

muffe, lieviti). Sistemi tenutiad una temperatura come quella corporea. Trasparenti per essere osservati al microscopio ottico(osserviamo le cellule vive, per le immagini in fluorescenza le cellule devono essere fissate quindisono morte a meno che non vada ad inserire una proteina fluorescente nel genoma della cellula checomincia ad esprimerla e che quindi posso visualizzarla anche durante lo sviluppo).Funzionalizzate vuol dire che inserisco molecole adesive che la cellula può riconoscere, possonoessere o proteine adesive (la minima) oppure polipeptidi di sintesi.

MEZZO (TERRENO) DI COLTURA

Cellule immerse in un liquido che è il terreno di coltura. Il terreno di coltura ha il compito dimantenere le cellule in un ambiente che dal punto di vista biochimico sia il più possibile simile aquello naturale. Le cellule hanno bisogno di essere nutrite, il mezzo deve contenere i nutrientiessenziali per la crescita, la proliferazione, il loro differenziamento.

Ricette complesse

Il rosso fenolo vira verso il viola, questo indica che le cellule non sono metabolicamente attive.

IL SIERO

Il siero fetale bovino è una frazione del plasma sanguigno dopo la coagulazione del sangue di provenienza bovina. C'è tanta albumina, vitamine, colesterolo, acidi grassi, fattori di crescita e di adesione, sostanze indispensabili per il metabolismo cellulare. È una sostanza talmente complessa che è difficile riprodurne la composizione in modo artificiale. Si preferisce fetale perché ha meno anticorpi rispetto a quello proveniente dall'animale adulto. Alcuni laboratori non utilizzano il siero fetale bovino: se sono cellule che vanno reimpiantate nel paziente sappiamo che non possiamo utilizzare nessun derivato animale per il problema di poter trasferire patogeni; laboratori animal-free che non utilizzano il siero. Normalmente viene utilizzato. Ha diverse funzioni: protegge la membrana, introduce fattori di crescita, favorisce l'interazione.

cellula substrato perché contiene fattori adesivi e contiene gli inibitori della tripsina che è l'enzima proteolitico che utilizzo per andare a staccare le cellule.

LABORATORIO DI COLTURE CELLULARI

La coltura cellulare deve essere mantenuta in un ambiente che riproduca le condizioni in vivo.

Strumentazione che vada a riprodurre queste condizioni. Da sinistra: cappa dove vengono manipulate le cellule che deve garantire la sterilità durante tutte le fasi, un incubatore che mantiene la temperatura costante a 37°C, viene mantenuta la giusta umidità e la concentrazione corretta dei gas.

STERILITÀ

Uno dei principali problemi e aspetti che va tenuto sotto controllo quando si lavora con colture cellulari è quello della sterilità. Per sterilità si intende la totale assenza di microorganismi che possono crescere insieme alle cellule in questo ambiente ricco di nutrienti, ambiente favorevole non soltanto alla crescita delle cellule eucariotiche.