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Si è visto che delle mutazioni delle anomalie a carico delle lamìne sono responsabili di diverse patologie come:

­ Una rara forma di distrofia muscolare La distrofia muscolare non presenta un’unica tipologia, ma ne presenta diverse, che possono

insorgere da diverse cause. In questo caso le lamìne presentano un’anomalia strutturale, non riescono ad organizzarsi e a creare una corretta

lamina nucleare, e come risultato i nuclei di queste cellule sono estremamente fragili, hanno una morfologia completamente anomala, e quindi

consegue che le cellule muscolari sono altrettanto fragili; e questo da origine alla malattia.

­ Sindrome (se si parla di una sindrome vuol dire che alla base di questa patologia ci sono più anomalie o malformazione) della progeria o di

Hutchinson­Gilford (HGPS) I soggetti che presentano questa patologia vanno incontro ad un invecchiamento precoce: un ragazzino

presenta già le sembianze di una persona di una certa età; noi lo percepiamo a livello fenotipico, ma ciò significa che a livello degli organi c’è

un invecchiamento precoce, questo significa che questi individui muoiono, per invecchiamento, durante l’adolescenza, sono individui che non

arriveranno mai all’età di 20 anni, perché presentano un’anomalia a carico dei nuclei delle loro cellule.

La base strutturale dell’informazione cellulare: DNA e cromosomi

All’interno del nucleo ci sono le molecole di DNA, quindi nel nucleo è contenuta un’informazione sotto forma di molecole di DNA e cromosomi (i

cromosomi sono fatti da DNA e altre proteine; il DNA è la molecola più semplice nella sua conformazione, mentre il cromosoma è l’estremo della

compattazione), la quale è una sorta di messaggio che deve essere trasmesso. Questa trasmissione può essere intesa a 2 livelli: deve essere

trasmessa in modo identico a tutte le generazioni di cellula che deriveranno o deve essere trasmessa all’interno di ogni cellula. Ogni cellula, durante

la sua vita, percorre un ciclo cellulare, ovvero delle fasi, che sono: fase M, fase G , fase S, fase G ; la mitosi è

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il punto di partenza, in cui una cellula madre si divide dando origine a 2 cellule figlie, che contengono ognuna lo

stesso numero di cromosomi. I cromosomi omologhi sono dei cromosomi morfologicamente uguali,

che appartengono allo stesso paio e hanno le stesse dimensioni. Ognuna delle 2 cellule figlie intraprende il

suo ciclo cellulare, va incontro alla fase G , dove si accresce e conduce le sue attività metaboliche, poi arriva un

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segnale che ne induce la divisione, quindi lascia la fase G ed entra nella fase S, cioè nella fase di duplicazione

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del DNA, ogni molecola di DNA duplica se stessa, quindi ogni cromosoma sarà formato da 2 cromatidi

fratelli, ma il DNA non è ancora ben compattato, perché deve andare incontro alla fase G , in cui la cellula si

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accresce e comincia a creare tutte le strutture e le molecole che le serviranno poi per affrontare la mitosi. Prima di entrare nella prima fase della

mitosi, le molecole di DNA si compattano fino ad arrivare ad acquisire la struttura di cromosomi, ognuno dei quali formato da 2 cromatidi fratelli, che

si sono replicati durante la fase S del ciclo cellulare. La mitosi è composta da diverse tappe, ma in metafase, la cisterna perinucleare si è

completamente dissociata, si è formato il fuso mitotico, ogni cromosoma formato dai 2 cromatidi fratelli prende contatto con una fibra del fuso e la

divisione in anafase e in telofase permette la separazione di un cromatidio a un polo della cellula e del cromatidio fratello all’altro polo della cellula. il

risultato finale è un cromatidio fratello che viene ereditato da una cellula, e l’altro cromatidio fratello che viene ereditato dall’altra cellula. Si ritorna

quindi ad avere 2 cellule identiche alla cellula madre e il ciclo riparte. Perciò alla domanda “com’è fatto il cromosoma di una cellula eucariotica

animale?”, la risposta dipende, perché un cromosoma è fatto da una singola molecola di DNA nella fase G , ma alla fine della duplicazione il

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cromosoma ha duplicato se stesso e quindi è formato da 2 cromatidi fratelli, a fine mitosi poi si torna ad avere un cromosoma fatto solo da un

cromatidio.

L’altro livello attraverso il quale può essere intesa la trasmissione dell’informazione è quello per cui all’interno di ogni singola cellula la molecola di

DNA trasmette l’informazione affinché la cellula possa funzionare. Quindi la molecola di DNA è fatta da tanti geni, il gene è l’unità funzionale e

l’unità che viene trascritta, e la trascrizione dà origine agli RNA (tutti e 3 i tipi, però poi una volta trascritti, l’RNA messaggero viene trasportato nel

citoplasma, viene tradotto dai ribosomi, e grazie ai tRNA si ottiene una catena polipeptidica che si ripeterà dando origine ad una proteina).

Il corredo cromosomico

(Riferimento all’immagine) Vengono proposte la tipica mappa cromosomica di un organismo maschile e quella di un

organismo femminile. Ogni nostra cellula, in generale, contiene 23 coppie di cromosomi omologhi, ovvero 46

cromosomi, che si dividono in 22 coppie di autosomi più una coppia di cromosomi sessuali. Questa mappa

cromosomica, per come i cromosomi sono disegnati, è stata fatta durante la metafase del ciclo cellulare, qualsiasi

mappa cromosomica viene fatta su cellule i cui si trovano in metafase, cioè si stanno dividendo, perché i cromosomi

devono essere al massimo compattati per poterli marcare. La coppia di cromosomi sessuali dell’uomo è diversa

rispetto a quella della donna: è il cromosoma Y che identifica il sesso maschile. Nel nostro genoma, nei 46 cromosomi, ci sono 6,4 miliardi di coppie

di basi azotate, materiale genetico che se potesse essere messo linearmente occuperebbe una lunghezza pari a 2 m, ma deve trovarsi all’interno di

nuclei il cui diametro è di circa 10 nm. Il nostro patrimonio genetico è fatto da coppie di cromosomi omologhi, quindi le nostre cellule autosomiche

hanno un corredo 2n (n è il numero dei cromosomi, 2 è quante volte questi cromosomi sono presenti. Nel nostro caso, quindi, sono 23*2).

Quali sono i meccanismi che intervengono affinché 2m di DNA possano essere compattati e contenuti in un nucleo con dimensioni di 10 nm, per

poter stare in uno spazio ben ordinato, e per nulla caotico, e per poter essere accessibili agli enzimi regolativi? Il DNA deve compattarsi per poter

essere confinato in uno spazio così ordinato, ma le cellule devono poter ottenere degli RNA per poter condurre le proprie attività metaboliche, quindi

specifici geni del DNA, a seconda del tessuto che viene preso in considerazione, devono rimanere accessibili agli enzimi regolativi per una

trascrizione, mentre quei geni che sono stati silenziati possono compattarsi marcatamente perché non devono più essere trascritti; questa è

un’esigenza che deve essere rispettata affinché ogni molecola di DNA possa compattarsi dando origine alla classica struttura di un cromosoma in

metafase al momento della divisione cellulare. Quindi la tappa successiva è che il DNA deve compattarsi e questa compattazione avviene per

gradi.

Livelli di organizzazione della cromatina

Il punto di partenza è una molecola di DNA, una struttura coincidente con un cromatidio, quindi un

cromosoma costituito da una singola molecola di DNA. Man mano che viene richiesta una compattazione,

il primo passo è quello di prendere delle proteine istoniche che vanno a creare una sorta di struttura

sferica, attorno a questa sfera la molecola di DNA si avvolge 2 volte (in uno spazio limitato un bel pezzo

di molecola di DNA si avvolge e così via): questo è il primo livello di compattazione. Ma non è

sufficiente, perché deve continuare e passando attraverso ulteriori organizzazioni, dove la classica struttura a

filo di perle comincia a compattarsi, deve arrivare a dare origine alle fibre di cromatina, le quali hanno uno

spessore di 30 nm. Queste interazioni, aiutate anche dalle proteine della matrice, si compattano sempre più, fino ad arrivare a fibre di cromatina

con uno spessore di 300 nm; diventa poi sempre più compatta, fino ad arrivare a uno spessore di 700 nm. In questa fase si identificano tratti di

cromatina condensata, quindi disattivate, cioè l’eterocromatina, o, nella fase di passaggio tra 300 e 700 nm, ci sono regioni attive, perché la

cromatina è più distesa, e si parla di eucromatina. Se però ci si trova ad analizzare una cellula che ha ricevuto il segnale di duplicarsi, il DNA

raggiunge il massimo grado di compattazione, ad uno spessore di 1400 nm dove si ha la struttura del tipico cromosoma metafasico. La molecola di

DNA iniziale arriva a costituire solo un cromatidio, per costituire l’altro serve un’altra molecola di DNA che si compatta nello stesso modo.

La graduale compattazione del DNA ha lo scopo di ottenere una struttura estremamente compatta che si identifica come cromosoma e che nel ciclo

vitale di una cellula è visibile solo durante la mitosi. Per semplicità, quando si parla di molecole di DNA che diventano nucleosoma e via via

cromatina, o quando si vuole rappresentare un cromosoma, si identifica la struttura, nelle varie fasi del ciclo cellulare, con un’organizzazione

bastoncellare, quindi quella di un cromosoma. Alla fine della fase di sintesi ogni cromosoma è formato da 2 molecole di DNA, che sarebbero 2

cromatidi fratelli, ma non sono ancora compattate, quindi in questo punto del ciclo cellulare non si può vedere il materiale genetico compattato, ma

le molecole di DNA duplicate sono disperse, e raggiungeranno la situazione altamente compatta solo in profase, cioè nella prima tappa della mitosi.

Questo significa che durante la fase G , che è ancora di crescita per la cellula, essa va a completare tutti gli eventi di preparazione in vista della

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mitosi, così come in G la cellula si accresce. Una cellula non entra in duplicazione, quindi non duplica il proprio DNA, se sorgono dei problemi che

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apportano delle condizioni sfavorevoli: vengono attivati dei meccanismi di controllo, che vengono definiti checkpoint del ciclo cellulare, che si

trovano sia in fase G che in fase G , che controllano i processi che stanno avvenendo; se i checkpoint vendono superati la cellula può proseguire il

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suo ciclo cellulare.

­ L’organizzazione del DNA

L’organizzazione del DNA richiede il coinvolgimento di specifiche proteine affinché il cromosoma metafasico possa affrontare un processo di

divisone mitotica, ed è finalizzata a far sì che le 2 cellule figlie acquisiscano materiale genetico in quantità adeguate e specie­specifico. Se le

molecole di DNA fossero disordinate e ingarbugliate invece che compattate ed ordinate, nel momento in cui il fuso mitotico è preposto per la

separazione, potrebbero sorgere degli errori, quindi questo massimo grado di compattazione è finalizzato a garantire un’adeguata suddivisione del

patrimonio genetico delle 2 cellule figlie.

I cromatidi fratelli si uniscono a livello del centromero, questa regione è estremamente importante perché si associano delle proteine, chiamate

proteine del cinetocore, che servono ad agganciare un cromosoma metafasico alle fibre del fuso; quindi il centromero è una regione molto

importante, che viene ad evidenziarsi solo quando si pala di un cromosoma in metafase. Nella mappa cromosomica, i cromosomi sono raggruppati

a coppie (coppie di cromosomi omologhi, uno di origine paterna e uno di origine materna), ma le coppie di cromosomi omologhi sono

morfologicamente diverse le une dalle altre (sia nell’individuo maschile che in quello femminile), questo dimostra che i cromosomi omologhi

(all’interno di una coppia) sono uguali anche per forma, hanno la lunghezza delle braccia dei singoli cormatidi uguale e perfettamente

sovrapponibile.

Perché possa avvenire l’organizzazione, il DNA deve essere associato a delle proteine, e queste proteine portano gradualmente a raggiungere lo

stadio di cromatina, che presenta uno spessore via via sempre più marcato, e questo significa che il DNA si compatta. La componente proteica in

questa fase gioca quindi un ruolo molto importante, ma non solo questa componente, in quanto entra in gioco anche una matrice nucleare, le cui

proteine organizzano la molecola di DNA. Prima della divisione cellulare, perciò, la cellula deve condensare il proprio patrimonio genetico dando

origine ai cromosomi e le fibre di cromatina servono a far sì che il materiale genetico possa essere contenuto all’interno di uno spazio limitato come

quello del nucleo.

Le prime proteine che entrano in gioco per poter organizzare la struttura nucleosomica sono gli istoni: non esiste un’unica proteina istonica, ma ne

esistono 4 diverse tipologie, ovvero istone H , istone H , istone H , istone H , istone H ; queste proteine sono altamente conservate, cioè sono

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state mantenute nel corso dell’evoluzione, perciò non si trovano solo a livello dei mammiferi, ma anche di altre classi di Vertebrati o di organismi

ancora più antichi, esse sono state così altamente conservate perché interagiscono con i nucleotidi e i nucleotidi sono sempre costituiti da basi

azotate che sono state altrettanto altamente conservate. Ma ci sono delle eccezioni, alcune cellule, ovvero gli spermatozoi, devono compattare

ancora di più il loro DNA, e per farlo utilizzano delle proteine non istoniche che sono le protammine, sono molto più piccole e molto più leggere in

spermatozoo

quanto lo deve essere una cellula dotata di motilità e quindi alleggerisce tutto il carico rispetto a una comune cellula. (Lo

spermatozoo è una cellula dotata di un flagello, a livello del quale c’è la struttura assonemale e ci sono dei mitocondri, e alla base dei flagello c’è il

centro di nucleazione mitocondriale, ovvero i centrioli con il centrosoma; tutto il resto viene eliminato, salvaguarda solo alcune cisterne del Golgi per

formare la vescicola acrosomiale).

Nel lavoro di compattazione del DNA, le proteine istoniche sono supportate anche da proteine non istoniche, che sono proteine a funzione

enzimatica e regolativa.

­ Il nucleosoma

(Riferimento all’immagine) Ogni subunità viola rappresenta una proteina istonica, che si aggregano a formare una sorta di “granulo”,

attorno a quale la molecola di DNA si avvolge 2 volte impegnando un determinato numero di

nucleotidi. Il DNA, poi, rimane per un tratto libero, priva di avvolgersi altre 2 volte. Il tratto

di DNA libero (DNA linker) lega l’istone H , è un istone che si aggancia e mantiene il

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tratto lineare, andando a garantire una sorta di ponte tra un nucleosoma e quello

successivo. Tutti gli altri istoni, H , H , H , H , sono impiegati nella formazione

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del complesso istonico o ottamero istonico. Quindi il nucleosoma è una

primo livello di organizzazione

particolare unità del di una molecola di DNA ed è

formato da un tratto di DNA (146 paia di basi, quindi 146 paia di nucleotidi) superavvolto

attorno ad un ottamero istonico, i cui istoni si agganciano al DNA in un modo

abbastanza stabile, per dare origine alla struttura cosiddetta “a filo di perle”, tramite legami

non covalenti (ad es. Legami ionici). Entrano poi in gioco 2 istoni H , 2 istoni H , 2 istoni H , e 2 istoni H , in modo che alla fine si venga a creare

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una struttura ottamerica, cioè formata da 8 subunità, attorno alle quali il DNA si aggancia e grazie agli enzimi regolativi riesce ad associarsi a

questa componente proteica con funzione strutturale. L’ottamero è costituito da 2 dimeri H ­H e da 2 dimeri H ­H , mentre l’istone H non

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interviene nella formazione del nucleosoma ma si aggancia al DNA linker. Nel momento in cui, lungo tutta la molecola di DNA, gradualmente si

associano questi complessi ottamerici, si viene ad avere il primo livello di organizzazione della cromatina, quindi del materiale genetico all’interno di

una cellula. In qualsiasi cellula in vivo non si potrà mai vedere la struttura a nucleosoma, perché in natura non esiste, ma è stata osservata in

laboratorio per capire quale fosse il punto di partenza per questa organizzazione; e arrivare a questo punto ha anche permesso di isolare gli istoni e

di caratterizzarli.

Esistono però, e sono quelle che possiamo osservare, le fibre di cromatina, il cui primo livello di organizzazione è quello a 30 nm. Si è visto che per

arrivare a questa organizzazione, gli istoni di nucleosomi vicini cominciano ad interagire tra di loro, man mano che nucleosomi vicini (ma non

secondo livello di

successivi) interagiscono tra di loro, cominciano a formarsi delle anse il cui spessore è di 30 nm, tale per cui a questo

organizzazione è stato dato il nome di fibra di cromatina 30 nm.

Questo non è l’ultimo livello per poter accedere al cromosoma metafasico, ma ci sono delle tappe intermedie. La tappa successiva è quella per cui

aumentano sempre di più le interazioni tra i primi ripiegamenti che si vengono a creare e si arriva a fibre di cromatina più spesse, di circa 80­100

nm, che aumentano il grado di compattazione del DNA. Tutt’attorno c’è il nucleoplasma e si è visto che queste anse che diventano più spesse

riescono a raggiungere questo stato perché si agganciano alle proteine che sono costituenti della matrice nucleare, quindi la matrice nucleare serve

anche ad organizzare la cromatina, aggancia le molecole di DNA nella conformazione cromatina 30 nm in punti ben precisi, così da ottenere delle

terzo livello di organizzazione,

anse con uno spessore maggiore; inoltre, per poter raggiungere questo interviene un enzima, chiamato

topoisomerasi II. Ricordare che le proteine cominciano a conformarsi grazie anche alla presenza di enzimi che le aiutano nel loro ripiegamento.

passaggi successivi

Durante i le anse diventano sempre più compatte, si arriva a uno spessore di 300 nm e poi di 700 nm, fino ad arrivare nel

cromosoma metafasico ad avere uno spessore di 1400 nm.

Il cromosoma metafasico è l’ultimo livello di condensazione, è sempre presente la topoisomerasi­II e interviene

anche un’altra proteina, la condensina, con l’obiettivo di condensare al massimo grado la molecola di

DNA.

Affinché i cromosomi prendano contatto con le fibre del fuso a livello del centromero, un cromatidio deve andare

l polo di una delle 2 ipotetiche cellule figlie, e il cromatidio fratello migri al polo opposto (cioè vada a finire

nella seconda cellula figlia); per regolare questi processi ci sono delle proteine, che vengono chiamate coesine, che si uniscono tra un cromatidio

fratello e quello successivo e verranno degradate solo nel momento in cui ci sarà la separazione (questo è quindi un altro meccanismo che va a

regolare in modo raffinato la suddivisione del patrimonio genetico). A livello di una struttura in termini di cromatina ci sono delle regioni, definite

eucromatina,

attive, dove i geni sono agganciabili dai meccanismi di traduzione, che sono le zone in cui c’è e ci sono delle regioni, definite inattive,

in cui la cromatina è condensata ma non a livello del cromosoma metafasico e specifici geni vengono resi silenti, che sono le zone in cui c’è

eterocromatina.

­ Eucromatina ed eterocromatina

Eucromatina ed eterocromatina coesistono nella medesima molecola di DNA, sono soltanto 2 livelli diversi di compattazione. Durante l’interfase del

ciclo cellulare, ovvero l’intervallo che comprende G , S, e G , si può distinguere l’eucromatina dall’eterocromatina, ed è l’unico momento, perché

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durante la mitosi i cromosomi sono talmente compattati che non si possono più distinguere queste 2 regioni.

I ricercatori hanno scoperto che dell’eterocromatina, cioè della cromatina non trascrivibile, esistono 2 tipi:

­ Eterocromatina costitutiva Rimane condensata in tutti gli stadi del ciclo cellulare e rappresenta DNA silenziato. Nei mammiferi è

localizzata in prossimità del centromero, dove i 2 cromatidi fratelli si uniscono tra di loro, e a livello dei telomeri, che sono le regioni terminali

delle braccia dei cromosomi (i telomeri sono molto importanti perché fanno in modo che l’estremità di un cromosoma possa aderire

all’estremità di un cromosoma vicino. Nei soggetti in cui le regioni telomeriche sono alterate possono insorgere problemi patologici perché le

molecole di DNA non funzionano in modo corretto). Costitutiva significa di “di base”, in linea generale in queste zone è sempre presente.

­ Eterocromatina facoltativa Facoltativa significa che può essere presente oppure no. Essa corrisponde a porzioni che sono state inattivate

in momenti precisi della vita di un organismo, e in genere vengono disattivate durante lo sviluppo embrionale. I corpi di Barr, per esempio,

possono presentarsi solo nei soggetti femminili, gli organismi maschili ne sono esclusi; questo è in relazione alla coppia di cromosomi

sessuali, che nella donna è XX mentre nell’uomo è XY, i cromosomi XX hanno più geni in comune rispetto ai cromosomi XY; dei 2 cromosomi

XX solo uno è trascrizionalmente attivo, l’altro è sottoforma di eterocromatina detta corpo di Barr: uno dei 2 geni deve essere disattivato

perché nell’uomo uno è silente, quindi questo accade perché sia dalla cellula maschile che da quella femminile possa provenire la stessa

quantità di geni trascrivibili. La disattivazione avviene in una fase molto precoce del ciclo cellulare.

Il genoma

Prima di tutto bisogna tenere presente che all’interno di una cellula eucariotica animale si possono identificare molecole di DNA a livello del nucleo,

ma anche a livello dei mitocondri: si parla di DNA nucleare, costituito da copie di molecole di DNA associabili e identificabili come coppie di

cromosomi omologhi, che vanno a costituire il corredo diploide specie­specifico, e di DNA mitocondriale, formato da una singola molecola di DNA,

che è solo di origine materna e ha una morfologia circolare.

Cosa sa fare il DNA all’interno di una cellula? Quali sono i processi a cui può andare incontro? Il DNA all’interno di una cellula deve duplicarsi, deve

saper trascrivere specifici geni in momenti ben precisi della vita della cellula per la produzione di RNA messaggero e di altri tipi di RNA (che poi

vanno incontro a vari processi perché possano funzionare).

Gli RNA ribosomiali

Gli RNA ribosomiali rappresentano la forma più stabile (rispetto a RNA messaggero e RNA transfer) tra le tipologie di RNA conosciute, e

rappresentano il 70/80% di tutto l’RNA sintetizzato. La sua stabilità sta nei legami e nel fatto che specifiche molecole di RNA ribosomiale si

agganciano a delle proteine che lo stabilizzano. Quindi la stabilità è correlata anche alla funzione che questa molecola dovrà poi svolgere, cioè

quella di andare a costituire le subunità ribosomiali. Tutte le volte che si parla di RNA ribosomiale lo si associa ad una regione molto particolare del

nucleo, ossia i nucleoli, che all’interno del nucleo sono 1, massimo 2, e non sono circondati da strutture membranose, ma sono solo delle regioni

che ad un’analisi al microscopio elettronico risultano più elettrondense.

Il nucleolo

Un nucleolo è una regione dove sono confinati i geni preposti per codificare l’RNA ribosomiale, sono regioni di DNA che vengono confinate in

quest’area ben precisa. L’osservazione al microscopio elettronico, però, ha permesso di vedere che, in realtà, non son regioni costituite solo da

RNA ribosomiale, ma presentano anche una componente fibrillare e una componente più aggregata. La componente fibrillare è data da molecole di

RNA, tratti rettilinei che sono il prodotto di una trascrizione, mentre la regione più granulosa è la componente risultante dall’associazione di RNA

ribosomiale e proteine, quindi sono le subunità ribosomiali (e sono la parte più abbondante). Il nucleolo è quindi una regione nel nucleo molto

importante, perché senza subunità ribosomiali non ci sarebbe traduzione, quindi sintesi delle proteine, e viene anche definito come “sito in cui

vengono fabbricate le subunità ribosomiali”. La sua struttura è pressoché sferica e ha un diametro di alcuni Durante la mitosi il nucleolo

μm.

scompare poiché la cromatina si compatta andando a formare i cromosomi, poi, alla fine della mitosi, il nucleolo si riorganizza.

I ribosomi

I ribosomi sono costituiti non da una sola molecola di RNA ribosomiale, ma da più molecole, e da proteine che si complessano. La differenza tra i

numero di molecole di RNA ribosomiale e le proteine definisce la dimensione della subunità, tale per cui si parla di subunità maggiore perché è più

voluminosa e di subunità minore perché è un po’ meno voluminosa. Le subunità hanno dimensioni diverse perché il loro compito nella sintesi

proteica è diverso, quindi la morfologia si adatta a questa funzione.

subunità maggiore

La è formata da 3 tipi di RNA ribosomiale, la cui differenza è stata identificata grazie al loro peso, sottoponendo i ribosomi a

centrifugazione e utilizzando unità svelver come unità discriminatoria, si identifica una molecola di RNA ribosomiale di 28 svelver, una molecola di

RNA ribosomiale di 5,8 svelver, e una molecola di RNA ribosomiale di 5 svelver.

subunità minore

La è, invece, formata da un’unica molecola di RNA di 18 svelver.

Ognuna di queste molecole di RNA è il risultato di 4 geni che vengono trascritti separatamente? La risposta è no, perché l’RNA28S, l’RNA18S e

l’RNA5,8S sono il risultato di un unico trascritto che poi, grazie alla presenza di un enzima nucleasi, viene tagliato nelle 3 molecole di rRNA, quindi

2 molecole di RNA della subunità maggiore e 1 molecola della subunità minore derivano dal medesimo trascritto. La molecola di RNA5S, invece,

sembra derivare da un precursore diverso, e sembra che la sua sintesi avvenga al di fuori del nucleolo e che poi la molecola venga portata nel

nucleolo in modo tale che possa associarsi con le altre 2 molecole per costituire la componente proteica della subunità maggiore. In questo modo si

ottiene quindi la quantità adeguata di molecole in termini di subunità ribosomiali, che appaiandosi o ripiegandosi in

alcuni punti creano la conformazione giusta affinché possano associarsi alle proteine per formare le subunità.

Tra tutti i tipi di RNA, l’mRNA è l’unico in cui non c’è un’interazione tra le basi che lo costituiscono, perché deve

rimanere una molecola lineare accessibile alle subunità ribosomiali perché possano leggere e trasferire le

informazioni in essa contenuta nella sintesi di una catena polipeptidica.

I ribosomi, nel momento in cui si associano le 2 subunità ribosomiali, rappresentano un vero e proprio supporto

per la sintesi proteica, in quanto catalizzano il legame tra 2 amminoacidi. Una delle 2 subunità, quella minore, si

aggancia all’RNA messaggero: appena l’mRNA arriva nel citoplasma della cellula una subunità minore si

aggancia ad esso e questo richiama la subunità maggiore, quindi l’mRNA tra queste 2 subunità comincerà ad essere letto e tradotto; perciò i

ribosomi sono il punto di partenza per una sintesi proteica, ma devono svolgere anche un altro compito. Al ribosoma così complessato con l’mRNA

arrivano i tRNA, ognuno dei quali porta un amminoacido deciso dalla sequenza di basi contenute nell’mRNA, a livello del ribosoma deve essere

catalizzato il legame peptidico tra i 2 amminoacidi, in modo tale che la catena proteica nascente possa formarsi. A livello del ribosoma devono

quindi esserci degli specifici siti attivi: delle particolari regioni del ribosoma che sanno svolgere delle particolari funzioni. La subunità minore ha un

unico sito attivo, che è quello che lega l’mRNA.

La 2 subunità vengono etichettate con dei pesi diversi rispetto agli RNA che le compongono: la subunità maggiore pesa 50 S, mentre la subunità

minore pesa 30 S, pesi che risultano dalle singole molecole di rRNA e dalle proteine.

I geni per l’RNA5S sono trascritti dalla RNA polimerasi III che si lega ad un sito promotore situato all'interno della parte di gene che viene trascritta.

Se il promotore interni di un gene per l'rRNA5S viene inserito in un'altra regione del genoma, il nuovo sito diventa uno stampo per la

trascrizione da parte dell'RNA polimerasi III.

TRASCRIZIONE E TRADUZIONE DELL’INFORMAZIONE GENICA

L’espressione genica

Esiste un intermediario tra un gene e il suo polipeptide ed è l'RNA messaggero (mRNA). È la copia complementare di uno dei due filamenti di DNA

che costituiscono un gene. La sintesi di un RNA da uno stampo di DNA e detta trascrizione e produce un mRNA che conserva le medesime

informazioni del gene stesso. Quando è nel citoplasma l'mRNA può fungere da stampo per l'incorporazione di amminoacidi in un ordine ben

preciso. Una molecola di DNA può servire da stampo per molte molecole di RNA, ognuna delle quali può essere usata per la traduzione di molti

polipeptidi. Fondamentale per la traduzione è la presenza dei ribosomi, costituiti da RNA ribosomali (rRNA) e proteine. Ogni rRNA e trascritto da

uno dei filamenti di DNA di un gene. Gli rRNA forniscono supporto strutturale e catalizzano reazioni chimiche in cui gli amminoacidi sono legati

covalentemente gli uni agli altri. C'è un altro tipo di RNA, il tRNA, o RNA transfer, che traduce le informazioni contenute nella sequenza

nucleotidica. Gli RNA si ripiegano in complesse forme tridimensionali che portano a molte funzioni. Il ripiegamento dipende dalla formazione di

regioni che hanno coppie di basi complementari. Se sono appaiate formano steli a doppio filamento, sesono singole formano anse ad un filamento.

La trascrizione necessita di enzimi detti RNA­polimerasi­DNA­dipendenti, o RNA polimerasi. Sono in grado di assemblare i nucleotidi in una

catena lineare di RNA la cui sequenza e complementare al filamento di DNA stampo. Il sito al quale si lega l'RNA polimerasi prima di iniziare

la trascrizione è detto promotore e contiene te le informazioni che determinano quale dei due filamenti di DNA è il sito nel quale inizierà la

trascrizione. Per riconoscere il promotore l'RNA necessita di proteine dette fattori di trascrizione (fattore sigma nei procarioti, grande varietà negli

eucarioti). L'RNA polimerasi si muove lungo il filamento stampo di DNA verso la sua estremità 5'. Mano a mano che avanza il filamento si srotola e

la polimerasi assembla il filamento complementare che cresce dal terminale 5' verso il 3'. La polimerasi inserisce i nucleotidi complementari che

vengono inseriti solo se sono in grado di formare un appaiamento stereochimico appropriato con quelli del DNA. Appena la polimerasi supera

una zona del DNA, la doppia elica si riforma. Le RNA polimerasi sono in grado di formare anche RNA molto lunghi quindi l'enzima deve rimanere

attaccato al DNA per tratti molto lunghi ma deve anche essere sufficientemente debole per potersi muovere da un nucleotidi all'altro. Le polimerasi

tuttavia possono arrestarsi in certi siti lungo lo stampo, per esempio quando il nucleotide incorporato è sbagliato e allora la polimerasi deve

digerire l'estremità 3' del trascritto neosintetizzato e risintetizzare la porzione mancante prima di riprendere il movimento. I tre tipi di RNA, mRNA,

rRNA, tRNA, derivano da molecole di RNA precursore detto trascritto primario o pre­RNA, che però ha una vita effimera perché non appena

sintetizzato viene processato in RNA più piccoli e funzionali.

La trascrizione dell’RNA messaggero

L’mRNA presenta specifiche caratteristiche: contiene una sequenza continua di nucleotidi

codificanti per uno specifico polipeptide, si trova nel citoplasma, è associato a ribosomi

quando viene tradotto, la maggior parte contiene un tratto non codificante ad entrambe le

estremità e sequenze con importanti ruoli regolatori.

Gli mRNA eucariotici presentano modificazioni particolari alle loro estremità 5' e 3',

assenti negli altri RNA. L'estremità 3' presenta una stringa di adenosine, da 50 a 250

residui, l'estremità 5' presenta un cappuccio di guanosina metilata. La loro sintesi è effettuata dalle polimerasi II che assembla un trascritto

primario complementare al DNA dell'intera unità di trascrizione è che viene poi elaborato nel nucleo per formare l'rRNA maturo trasportato poi nel

citoplasma. Gli RNA trascritti si associano con proteine e con particelle più grandi quando è ancora in atto il processo di sintesi. Tali particelle sono

dette ribonucleoproteine e comprendono gli agenti responsabili della conversione del trascritto primario nell'mRNA maturo. Questo richiede:

­ L'aggiunta del cappuccio all'estremità 5' e della coda poli(A) all'estremità 3': le estremità 5' di tutti gli mRNA possiedono inizialmente un

trifosfato derivati dal primo nucleoside trifosfato incorporato. Una volta che l'estremità 5' è stata sintetizzata, diversi enzimi vi agiscono

trasformando il trifosfato in difosfato. Viene poi aggiungo un GMP con orientamento invertito così che l'estremità 5' di una guanosina venga ad

essere di fronte a quella della catena di RNA. I primi due nucleosidi sono dunque uniti da un ponte trifosfato 5'­5'. La guanosina è metilata

nella posizione 7 della sua base guanina, il nucleotide è metilata nella posizione 2' del ribosio. L'estremità 5' dell'mRNA contiene ora un

cappuccio (cap) di metilguanosina che impedisce che l'estremità sia digerita da esonucleasi, favorisce il trasporto elimina fuori dal nucleo e

ha un ruolo importante all'inizio della traduzione dell'mRNA. L'estremità 3' contiene una successione di residui di adenosina che forma una

coda di poli (A) che si forma invariabilmente circa 20 nucleotidi a valle, quindi dopo, una sequenza AAUAAA.

­ La rimozione degli introni interposti: è chiamata splicing dell'RNA. Affinché possa avvenire devono essere introdotte delle rotture nel filamento

di RNA a livello delle estremità 5'e 3' di ciascun introne (siti di splicing) e gli esami situati a ciascun lato dei siti devono essere uniti

covalentemente. È un processo che richiede una elevata precisione poiché l'aggiunta o la perdita di un solo nucleotide causerebbe una

traduzione errata dell'mRNA ottenuto. La cellula necessita di segnali addizionali per distinguere esoni e introni e sembra che vengano forniti

da sequenze specifiche, dette enhancer esonici per lo splicing o ESE, localizzate all'interno degli esoni. Gli ESE sono il sito di legame per le

proteine SR, caratterizzate da un alto numero di serina (S) e arginina (R) che si ritiene formino reti di interazioni che circondano i confini

esone/introne e favoriscono il reclutamento delle snRNP al sito di splicing. Sono cariche positivamente quindi possono anche legare

elettrostaticamente i gruppi fosfato carichi negativamente che vengono aggiunti.

Un RNA messaggero viene definito come una molecola complementare del gene che l’ha trascritta, l’mRNA comunque non sarà una molecola

identica a quella che l’ha tradotta, ci saranno regioni che vengono tagliate in modo tale da partire da una molecola immatura per arrivare ad una

molecola matura, che sarà poi quella che porta l’informazione definitiva. L’RNA messaggero permette quindi alla cellula di amplificare la sua sintesi,

perché: un gene può essere trascritto n volte, ogni gene è lo stampo per trascrivere numerose molecole. L’RNA messaggero può subire

meccanismi di splicing, quindi di rimozione di porzioni e tratti che vengono poi uniti.

Un messaggio di questo tipo, a livello del citoplasma, come viene letto dai ribosomi? Viene letto a triplette, ogni 3 basi azotate corrisponde un

amminoacido. Se avessimo un mRNA lungo 666 basi azotate, quanto sarà lunga la sua catena polipeptidica? Il concetto è 666:3, quindi sarebbero

222 amminoacidi, ma in realtà sono 221 perché il primo viene tagliato: in generale tutte le catene polipeptidiche che si formano hanno la tripletta di

inizio AUG, il tRNA che riconosce questo codone inserisce la metionina, la quale verrà poi tagliata dall’estremità ammino­terminale (tutte le catene

polipeptidiche iniziano ad essere sintetizzate dall’estremità ammino­terminale).

La struttura dell’RNA transfer

RNA messaggero e subunità ribosomiali non sono sufficienti per garantire una corretta trascrizione, quindi deve

intervenire l’RNA transfer, questo perché traduzione proteica significa partire da un messaggio nucleotidico e arrivare ad un

messaggio amminoacidico; quindi se i ribosomi sono il macchinario per leggere l’mRNA, il tRNA si occupa poi di

trasportare il messaggio che viene via via letto.

Studi istologici e studi di biochimica hanno permesso di ipotizzare la struttura del tRNA e la sua organizzazione

tridimensionale è stata paragonata a quella di un foglio perché, oltre alle 2 porzioni rettilinee, si identificano delle regioni ad anse che caratterizzano

questa molecola. Si può notare che alcuni tratti della molecola costituente l’RNA transfer si appaiano con altri tratti della medesima molecola, e

questi legami, nei punti in cui si localizzano, servono per stabilizzare la molecola. Visto che questi sono legami a idrogeno tra le basi azotate che si

affacciano e si appaiano, i ricercatori si sono chiesti in che modo possano stabilizzare la molecola: la risposta è stata correlata soprattutto a livello

delle anse, le anse sono molto importanti soprattutto a livello della traduzione e in particolar modo l’ansa dell’anti­codone, dove una sequenza di

nucleotidi (una tripletta di basi chiamata anti­codone) è quella che trova una corrispondenza sull’RNA messaggero. Quindi queste basi devono

essere libere e disponibili per poter interagire con l’RNA messaggero; perciò la motivazione sta nel fatto che a livello delle anse avvengono specifici

processi indispensabili per la traduzione. traduzione.

I tRNA sono fondamentali per la sintesi proteica, anche detta Nel 1965 R.Holley scoprì la sequenza di basi del tRNA di lievito specifico

per l’amminoacido alanina, poi, dopo diversi studi, si è giunti alla conclusione che tutti i tRNA presentano caratteristiche simili: hanno tutti una

lunghezza che va da 73 a 93 nucleotidi (93 se la molecola è matura); hanno una percentuale significativa di basi insolite che risultano da

modificazioni enzimatiche di una delle 4 basi standard dopo che una di esse era stata incorporata nella catena di RNA, quindi si parla di

modificazione port­traduzionale; in una parte della molecola ci sono sequenze di nucleotidi complementari a sequenza situate in altre parti della

molecola, questo favorisce la struttura a trifoglio per via dei ripiegamenti che ne seguono; in altre parti della molecola non ci sono sequenza

nucleotidiche complementari, dunque si formano delle anse, dove sono presenti basi insolite che non permettono la formazione di legami a

idrogeno, dunque ripiegamenti, ma sono potenziali siti di riconoscimento per varie proteine.

Il tRNA, solo quando è maturo, evidenzia alla sua estremità 3’ la sequenza nucleotidica formata dalle basi azotate ACC, che può essere codificata

nel gene per il tRNA (nei procarioti) oppure aggiunta enzimaticamente (negli eucarioti) da un singolo enzima che addiziona tutti e 3 i nucleotidi

nell’ordine appropriato senza l’ausilio di un filamento stampo di DNA o RNA; in una cellula si può arrivare massimo a 20 tipi di tRNA diversi, in

quanto nel citoplasma di una cellula ci sono 20 diversi amminoacidi. La struttura terziaria dei tRNA presenta 2 doppie eliche organizzate a formare

una struttura a L rovesciata, per la quale sono molto importanti le basi invarianti; hanno caratteristiche uniche che permettono ad un amminoacido

di essere legato enzimaticamente al corretto tRNA; hanno un sito di legame con il codone dell’mRNA detto anticodone, che si trova dell’ansa

centrale, essa è invariabilmente costituita da 7 nucleotidi, la tripletta centrale è appunto l’anticodone ed è situato ad un’estremità della molecola di

tRNA a forma di L, dalla parte opposta a quella dove è attaccato l’amminoacido.

I codoni che legano gli amminoacidi presentano la massima variabilità nel terzo nucleotide: l’ipotesi del vacillamento (wobble), proposta da Crick,

suggerì che i requisiti sterici tra l’anticodone del tRNA ed il codone dell’mRNA sono molto forti per le basi nelle prime 2 posizioni, mentre sono più

flessibili per la terza posizione, dunque 2 codoni che specificano lo stesso amminoacido e che sono diversi solamente a livello della terza base

azotata possono usare lo stesso tRNA nella sintesi proteica. Perché gli amminoacidi si leghino covalentemente all’estremità 3’ del loro tRNA serve

amminoacil­tRNA­sintetasi

un enzima chiamato (ce ne sono circa 20 diversi). Qualora la sintetasi fissi un amminoacido sbagliato si attiva un

meccanismo di correzione di bozze (proofreading) dell’enzima in modo tale che il legame tra l’amminoacido e il tRNA venga reciso. Non tutte le

amminoacil­tRNA­sintetasi però possiedono questo meccanismo, alcuni rimuovono l’amminoacido sbagliato idrolizzando il legame amminoacil­

AMP dopo la prima tappa della reazione.

I t­RNA sono sintetizzati da geni che si trovano in piccoli gruppi, detti cluster, sparsi nel genoma. Un cluster contiene copie di geni diversi e una

sequenza di DNA è contenuta in diversi cluster. I tRNA sono trascritti da RNA polimerasi III e la sequenza promotrice è presente all’interno della

parte codificante del gene.

Le principali funzioni del tRNA sono: l’enzima amminoacil­tRNA­sintetasi lega gli amminoacidi al tRNA corrispondente; il riconoscimento tra codone

e anticodone permette l’inserimento dell’amminoacido nella catena polipeptidica; il tRNA si lega al su amminoacido mediante legame esterico; il

tRNA media il riconoscimento tra amminoacidi e sequenza nucleotidica dell’mRNA.

Il codice genetico

Il codice genetico NON è l’insieme delle molecole di DNA

contenute in una cellula, perché quello è il genoma. Il

codice genetico è la modalità con cui le nostre cellule

leggono l’informazione contenuta nell’RNA messaggero,

e consiste in un sistema di basi che serve per spedire il

messaggio dal genoma ai ribosomi. La sfida dei

ricercatori è stata quella decodificare questo messaggio,

ovvero di identificare delle regole universali, che si sono

viste essere, nella maggior parte dei casi, uguali per tutti

gli organismi viventi; questa universalità sta nel fatto che

le basi azotate sono sempre quelle, non c’è una

variabilità.

Si parte dalla sequenza nucleotidica di un gene che

codifica, o trascrive, una sequenza di nucleotidi (RNA

messaggero) che traduce il suo messaggio in una catena

polipeptidica, quindi in una sequenza di amminoacidi.

Non tutti i geni servono a trascrivere RNA messaggero,

ma ci sono anche dei geni deputati a trascrivere tRNA ed

rRNA. Oggi sappiamo che il codice genetico è a triplette, questo significa che le

basi vengono lette a gruppi di 3, ma a questa informazione si è arrivati attraverso specifici studi.

modelli

Si parte da una sequenza di 4 basi e dai 20 diversi amminoacidi. Uno dei primi del codice genetico fu proposto da G.Gamow, il quale

ipotizzò che ciascun amminoacido in un polipeptide fosse codificato da una sequenza di tre nucleotidi, chiamata codone, quindi triplette di

nucleotidi. La spiegazione è data dal fatto che essendoci 20 differenti amminoacidi che devono essere specificati, i codoni devono contenere

almeno 3 nucleotidi in sequenza. Propose inoltre che si trattasse di un codice sovrapposto, in realtà non lo è, quindi ogni nucleotide è parte di

un unico codone. La terza caratteristica del codice genetico, ipotizzata da F.Crick è quella di essere ridondante o degenerato, dal momento che

quasi tutti i 64 possibili codoni specificano amminoacidi e quelli che non lo fanno sono riconosciuti dal ribosoma come codoni di terminazione e

causano la fine della lettura del messaggio. Si capì dunque che gli stessi amminoacidi potevano esserecodificati da differenti sequenze di basi.

A partire dal 1961 molti genetisti iniziarono a cercare di decodificare il codice: il primo messaggio sperimentato fu un poliribonucleotide composto

esclusivamente da uridina e fu chiamato poli (U). Si scoprì che, aggiunto ad una provetta contenente tutti gli amminoacidi e i componenti necessari

per la sintesi proteica, il sistema produceva la polifenilalanina, e fu dunque dimostrato che il codone UUU specificava la polifenilalanina. Fu

dunque creata una tavola di decifrazione del codice genetico che elenca le sequenze nucleotidiche dei possibili 64 codoni di un mRNA. I significati

assegnati a ciascun codone sono essenzialmente universali, eccetto qualche particolarità negli mRNA mitocondriali: 1) UGA è letta come

triptofano e non come tripletta di stop 2) AUA è letta come metionina invece che isoleucina 3) AGA e AGG sono lette come triplette di stop e non

come arginina. Tuttavia le somiglianze tra i codici sono molto più abbondanti delle differenze e questo sta a significare che le deviazioni si

siano evolute come cambiamenti secondari del codice genetico tipico. Tali cambiamenti possono essere di due tipi: sinonimi, quindi non

alterare la sequenza amminoacidica, o non sinonimi, dunque causare una sostituzione amminoacidica. La relazione tra codoni e amminoacidi

è tale che amminoacidi simili tendono ad essere specificati da codoni simili.

La traduzione o sintesi proteica

La traduzione, o sintesi proteica, necessita di tutti i vari tRNA con i vari amminoacidi legati, i ribosomi, l’mRNA, proteine, cationi e GTP. Si divide in

tre fasi: inizio, allungamento, terminazione.

1) Inizio: un ribosoma legato ad un mRNA si muove lungo tale RNA in blocchi consecutivi di tre nucleotidi. Si

attacca in un sito specifico chiamato codone di inizio, AUG e che pone il ribosoma nell’appropriato modulo di

lettura (reading frame) in modo da poter leggere l’intero messaggio. Inizialmente il ribosoma si lega

all’mRNA dalla subunità minore e il codone è riconosciuto per sequenze complementari. L’inizio della sintesi

richiede fattori di inizio, designati IF nei procarioti e eIF negli eucarioti. AUG è inoltre l’unico codone che

specifica la metionina, che infatti è sempre il primo aa incorporato all’estremità N­terminale di una

catena polipeptidica nascente, generalmente poi viene rimossa enzimaticamente. I fattori di iniziofavoriscono la preparazione della subunità

minore del ribosoma per legare mRNA al codone AUG, il legame del filamento di mRNA alla subunità minore del ribosoma, il

legame della metionil­tRMA alla subunità minore nel sito P. Le cellule possiedono due distinti metionil­tRNA, uno usato per iniziare la

sintesi proteica, l’altro per incorporare i residui di metionina all’interno di un polipeptide. Mentre le cellule procariotiche richiedono tre fattori di

inizio IF1 che promuove l’accatto della subunità 30S all’mRNA, IF2 che lega GTP, IF3 che impedisce che la subunità 50S si leghi

prematuramente alla 30S e facilita l’entrata dell’aa­tRNA iniziale, le cellule procariotiche ne richiedono almeno. Il tRNA iniziatore, legato

alla metionina, si attacca alla subunità 40S prima di interagire con l’mRNA, si inserisce nel sito P della subunità minore in

associazione con eIF2­GTP così da rendere la subunità pronta per cercare l’estremità 50 dell’mRNA, che porta il cappuccio di

metilguanosina. Tale complesso quindi (subunità 40S, tRNA, metionina, eIF1A/2­GTP/3), detto 43S, è indirizzato verso l’mRNA da fattori

di inizio. eIF4E si lega al cappuccio dell’estremità 5’ dell’mRNA, eIF4A si muove lungo l’estremità 5’ rimuovendo le regioni a doppio

filamento che interferirebbero con lo scorrimento, eIF4G collega l’estremità 5’ incappucciata a quella 3’ poliadenilata dell’mRNA. A questo

punto il complesso scorre lungo il messaggio finché raggiunge una sequenza riconoscibile di nucleotidi che contiene il codone di inizio, una

ribosomi

volta raggiunto eIF2­GTP viene idrolizzato, eIF2­GDP viene rilasciato e la subunità maggiore si aggiunge al complesso. I sono

fondamentali per la sintesi proteica per vari motivi: sono macchine molecolari che vanno incontro ad un ciclo ripetitivo di cambiamenti

meccanici guidati dall’energia rilasciata dall’idrolisi di GTP durante la traduzione. Gli RNA ribosomiali svolgono numerosi ruoli importanti,

quali la selezione del tRNA, il controllo della traduzione, il legame di fattori proteici, e la polimerizzazione degli aa. Ogni ribosoma ha tre

siti di associazione per le molecole di tRNA. Un sito A(amminoacidico), un sito P(peptidico), un sito E(exit). I tRNA si legano a questi siti e

riempiono lo spazio tra le due subunità ribosomiali. L’estremità dell’anticodone del tRNA legato contatta la subunità minore che svolge un

ruolo chiave nella decodificazione delle informazioni contenute nell’mRNA. Inoltre l’interfaccia tra subunità minore e maggiore forma una

cavità relativamente spaziosa e le superfici delle due subunità rivolte l’una verso l’altra, costituite da RNA, contengono i siti di legame per

mRNA e tRNA. Il sito attivo dove vengono legati gli aa è costituito da RNA e giace in una profonda fenditura che protegge il legame peptidico

appena formato dall’idrolisi da parte del solvente acquoso. L’mRNA è situato in uno stretto canale che scorre lungo il collo della subunità

maggiore, passando attraverso i vari siti, prima di entrare nel sito A è privato di qualsiasi struttura secondaria. Inoltre vi è una galleria che

scorre attraverso la subunità maggiore per consentire il passaggio del polipeptide in allungamento altraverso il ribosoma.

2) Allungamento: quando il tRNA iniziatore è localizzato nel sito P, il ribosoma è pronto per accettare il secondo aa­tRNA nel sito A vuoto, ma

prima l’aa­tRNA deve combinarsi con un fattore di allungamento proteico legato a GTP. Solo il complesso che ha l’anticodone complementare

a quello dell’mRNA situato nel sito A sarà intrappolato dal ribosoma. I due aa legati ai rispettivi tRNA instaurano un legame peptidico che

viene a formarsi tra il gruppo amminico dell’aa­tRNA situato nel sito A e il gruppo carbonile dell’aa­tRNA situato sul sito P. tale legame avviene

spontaneamente e la reazione è catalizzata dalla peptidil­transferasi, una componente della subunità maggiore del ribosoma, dunque è un

ribozima. Il tRNA nel sito P è quindi privo dell’amminoacido, questo consente la traslocazione. Il ribosoma si sposta di tre nucleotidi lungo

l’mRNA in direzione 5’­3’ ed avviene anche lo spostamento del dipeptidil­tRNA dal sito A al sito P, oltre a quello del tRNA deacilato dal sito

P al sito E. la traslocazione è guidata da modifiche conformazionali in un altro fattore di allungamento dovute all’idrolisi del GTP

legato ad esso. Il tRNA deacilato viene dunque rilasciato e libera il sito E. per ciascun ciclo di allungamento vengono idrolizzate almeno due

molecole di GTP: una durante la selezione dell’ aa­tRNA e una durante la traslocazione. A questo punto dunque il sito A è libero, dunque un

terzo tRNA interviene e si lega al sito A in modo da indurre la formazione di un secondo legame peptidico tra il dipeptide del tRNA situato sul

sito P e l’aa sul tRNA del sito A. possono tuttavia avvenire delle mutazioni: ad esempio le mutazioni frameshift, mutazioni puntiformi che

possono verificarsi con l’inserimento di una base azotata dopo una tripletta, con il mancato inserimento di una base azotata, che fanno

comunque slittare il messaggio.

3) Terminazione: avviene grazie alla presenza di tre codoni di stp, UAA, UAG, UGA. Ci sono eccezioni in cui tali codoni non vengono

riconosciuti come stop.Il ventunesimo aa, per esempio, chiamato S­elenocisteina, molto raro e incorporato in pochissimi polipeptidi,

Sec

possiede un tRNA specifico, chiamato tRNA , ma non una aa tRNA sintetasi. Questo tRNA viene quindi riconosciuto dalla seril­tRNA

Sec

sintetasi che lega una serina all’estermità 3’ del tRNA convertendo la serina in selenocisteina, codificata da UGA. Anche il

ventiduesimo aa, la pirrolisina, è codificata da un codone stop (UAG). La terminazione necessita di fattori di rilascio, chiamati RF, distinti in RF

di classe I, che riconoscono i codoni di stop nel sito A del ribosoma, e RF di classe II, proteine G. Le cellule eucariotiche hanno uno

RF di classe I, denominato eRF1, che entra nel sito A dove un tripeptide conservato ad una estremità del fattori di rilascio interagisce

direttamente con il codone di stop presente nel sito. Il legame estereo che lega la catena polipetidica nascente al tRNA viene

idrolizzato e il polipeptide completo è rilasciato dal ribosoma. L’idrolisi porta al rilascio dell’RF di classe I dal sito A, al rilascio del tRNA

deacilato dal sito P, alla dissociazione del mRNA dal ribosoma e al disassemblaggio del ribosoma nelle due subunità. Questi

passaggi finali richiedono una serie di fattori proteici (ribosome recycling factor).

Il controllo post­traduzionale: regolazione della stabilità delle proteine

La degradazione delle proteine cellulari è svolta dai proteasomi, presenti sia nel nucleo che nel citoplasma. Essi sono costituiti da 4 subunità

polipeptidiche a forma di anello, impilate e con un cappuccio su ciascuna estremità. I due anelli centrali, ciascuno costituito da 7 subunità β,

agiscono come enzimi proteolitici, mentre gli altri due anelli, costituiti da 7 subunità sono enzimaticamente inattive. I proteasomi

α,

digeriscono proteine marcate per essere eliminate: nel caso

di proteine anormali esse vengono selezionate perché mal ripiegate o associate in modo scorretto ad altre proteine, nel caso di proteine normali

invece il principio è quello della longevità caratteristica di ogni proteina. Alcune proteine, come per esempio gli enzimi della glicolisi o le

molecole di globina di un eritrocita, permangono per giorni o settimane, altre, come le proteine regolative che iniziano la replicazione del DNA o

la divisione cellulare, possono sopravvivere solo pochi minuti. Uno dei fattori cruciali nel riconoscimento delle proteine da digerire è lo specifico

amminoacido presente all’estremità N­terminale della catena polipeptidica: se presente arginina o lisina, per esempio, la proteina ha generalmente

emivita breve. Esistono proteine che presentano una sequenza amminoacidica interna, chiamata degron, che garantisce che le proteine non

sopravvivano a lungo nella cellula. Fondamentale per il processo di degradazione è l’ubiquitina, una piccola proteina altamente conservata. Quando

una singola molecola di ubiquitina è legata alle proteine esse vengono incorporate in vescicole endocitiche, quando invece sono di più e si viene a

formare una catena di poliubiquitina 1) essa viene trasferita su un residuo di lisina della proteina da eliminare grazie a particolari enzimi E1, E2, E3

2) la proteina si lega al cappuccio del proteosoma che rimuove la cateina e denatura la proteina usando l’energia proveniente dall’idrolisi dell’ATP 3)

il polipeptide lineare viene quindi infilato nel canale dell’anello della subunità e portato nella camera centrale del proteosoma 4) dove viene

α

digerito in piccoli peptidi che vengono poi rilasciati nel citosol dove vengono degradati nelle loro unità amminoacidiche.

La replicazione semiconservativa del DNA

Prima di giungere alla conclusione che la duplicazione del DNA fosse semiconservativa, dunque che ciascuna delle doppie eliche figlie risulti

composta da un filamento intero derivato dalla coppia elica parentale e da un filamento completo di nuova sintesi, furono vagliate altre due

ipotesi. Si pensò potesse essere conservativa dunque i due filamenti originali rimarrebbero insieme così come i due filamenti neosintetizzati e di

conseguenza una delle cellule figlie conterrebbe solamente la doppia elica originaria interamente conservata mentre l’altra conterrebbe solo DNA di

nuova sintesi. La seconda ipotesi era che si trattasse di replicazione dispersiva, nella quale andrebbe persa l’integrità di ognuno dei due filamenti

parentali di DNA. In entrambi i casi non si conserverebbero né i singoli filamenti né la doppia elica. La replicazione ha inizio in un punto specifico

detto origine, una sequenza alla quale si legano numerose proteine (proteine SSB, che legano selettivamente il DNA a singolo filamento

mantenendolo in uno stato disteso ed impedendogli di riavvolgersi) per dare inizio alla replicazione. Essa dunque procede a partire dall’origine in

entrambe le direzioni ed è dunque bidirezionale. I punti in cui i due filamenti si separano, ad opera dell’enzima elicasi vengono detti forcelle di

replicazione e sono i punti dai quali vengono incorporati i nucleotidi nei filamenti complementari neosintetizzati. Le elicasi srotolano il duplex

attraverso una reazione che richiede entergia fornita dall’idrolisi dell’ATP per muoversi lungo uno dei filamenti di DNA e che consente di rompere i

legami idrogeno tra le basi. Oltre al processo di separazione dei filamenti vi è un processo di srotolamento ad opera della DNA girasi, una

topoisomerasi di tipo II in grado di cambiare lo stato di superavvolto eliminando lo stress torsionale che si genere nella separazione dei filamenti ed

i superavvolgimenti positivi. La DNA polimerasi III, responsabile della sintesi dei nuovi filamenti, può solo aggiungere nucleotidi all’estremità

3’ ossidrilica di un filamento già esistente detto primer (o innesco). La DNA polimerasi è però in grado di sintetizzare solo in direzione 5’­3’. Il

gruppo OH all’estremità 3’ del primer effettua l’attacco nucleofilico sul 5’α­fosfato del nucleoside trifosfato che deve essere inserito. L’apparato di

replicazione è associato alla componente citoscheletrica (lamina e matrice) quindi immobile. Entrambe le DNA polimerasi, collocata ciascuna su

uno dei due filamenti, assembla un filamento che si allunga a partire dall’estremità 5’­P. di conseguenza uno dei filamenti neosintetizzati

cresce in direzione della forcella e l’altro nella direzione opposta. Il primo viene sintetizzato in modo continuo ed è detto filamento guida,

l’altro sintetizzato in modo discontinuo è detto filamento in ritardo.

Quest’ultimo è costituito da frammenti, detti di Okazaki, ognuno dei quali cresce allontanandosi dalla forcella verso l’estremità 5’ di un frammento

formato in precedenza. È detto in ritardo perché l’inizio della sintesi di ogni frammento deve aspettare che i filamenti parentali si separino ed

espongano aggiuntive porzioni di stampo. In realtà è probabile che la sintesi dei due filamenti avvenga contemporaneamente. Il filamento in ritardo

viene ripiegato ad occhiello (ansa) in modo da fargli assumere lo stesso orientamento dello stampo del filamento guida. Quando la polimerasi

che forma il filamento in ritardo raggiunge l’estremità 5’ del frammento di Okazaki sintetizzato durante il ciclo precedente, lo stampo del

filamento in ritardo viene abbandonato e la polimerasi inizia a lavorare sull’estremità 3’ del successivo RNA primer in direzione della forcella. Dal

momento che un filamento viene sintetizzato in modo continuo e l’altro in modo discontinuo, la replicazione è detta semidiscontinua. I frammenti

di Okazaki hanno però origine da un particolare tipo di RNA, detto primasi, che costruisce un

piccolo primer composto da RNA, appunto, e non da DNA, che la polimerasi non è in grado di

copiare. Tali porzioni vengono poi rimosse dalla polimerasi I e la DNA­ligasi unisce i nucleotidi.

LA RIPRODUZIONE CELLULARE

Il ciclo cellulare fase

Ogni cellula in divisione effettua il cosiddetto ciclo cellulare, costituito da 2 fasi principali: la

M, che include il processo di mitosi e quello di citocinesi, e l’interfase.


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Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher lauramacrinss di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Citologia e istologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano Bicocca - Unimib o del prof Colombo Anita.

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