Che materia stai cercando?

Interazioni tra piante microrganismi e ambiente Appunti scolastici Premium

MODULO 1
Le interazioni nel mondo del vivente. Varietà e terminologia delle relazioni nutrizionali tra piante e microrganismi. Definizione di simbiosi: simbiosi permanenti e simbiosi cicliche. La simbiosi all’origine della cellula eucariote.
Le simbiosi azotofissatrici. Inquadramento generale e basi biochimiche e dell’azotofissazione. Descrizione delle più importanti... Vedi di più

Esame di Interazioni tra piante microrganismi e ambiente docente Prof. P. Bonfante

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

L’interfaccia batterio-cellula fungina è complessa: permane parte della parete cellulare.

Il cianobatterio viene catturato da particolari ife fungine e si moltiplica al loro interno. 111

G.p. forma simbiosi permanenti con batteri G+.

Tutti gli organismi formano simbiosi, molte delle quali hanno importanza ecologica. 112

Identificazione di un trasportatore per gli

zuccheri in Geosiphon 113

114

In conclusione:

 Le simbiosi coinvolgono, in misura maggiore o minore, tutti gli organismi viventi

 Importanza applicativa

 Importanza ecologica ed evolutiva → Fonte di INNOVAZIONE!

È una modalità di evoluzione « a salti » che generalmente comporta aumento della complessità (…..ma con la

possibilità di perdite secondarie) PIANTE E STRESS 115

Stress ambientali

Definizione: lo stress ambientale è una condizione (esterna) che influisce negativamente sulla crescita, sullo sviluppo

e sulla produttività della pianta

Le piante sotto stress ne risentono in termini di produttività, la direzione che prendono è l’adattamento alle

condizioni cambiate.

Le caratteristiche degli stress ambientali sono molteplici: gravità, durata (breve o duraturo), numero di esposizioni

(evento isolato o frequente), uno o combinazioni di stress; e l’effetto sulla pianta varia in base a molteplici fattori:

tipo di stress, organo complito, stadio di sviluppo della pianta (plantula più suscettibile rispetto all’adulto).

Stress ambientali possono derivare da fenomeni naturali o di origine antropica. 116

Ma non c’è una netta differenza tra morte e sopravvivenza, ci sono varie situazioni, di riduzione della crescita ad es.

Un aumento anche ridotto dello stress idrico porta a conseguenze gravi sulla produttività e sulla biodiversità:

Es. cambiamento globale del clima: riscaldamento e precipitazioni.

Le popolazioni microbiche aiutano la pianta a superare gli stress.

Risposte di piante e microrganismi a stress ambientali:

A causa della loro vita sedentaria, piante e microrganismi non possono fuggire di fronte agli stress ambientali →

spinte adattative molto forti.

Gli organismi possono sopravvivere all’esposizione a stress ambientali grazie a meccanismi che hanno una diversa

scala temporale (anche se le piante, con i semi, possono sopravvivere attraverso dormienza e migrazione) :

 Risposta

 Acclimatazione

 Adattamento 117

individuo

 Risposta: inducibile in seguito all’esposizione a stress, che può comportare

un declino del metabolismo e della crescita.

–e.g. chiusura degli stomi in risposta a stress idrico singolo

 Acclimatazione : risposte inducibili nella vita del singolo individuo, che

consentono all’organismo di tollerare cambiamenti sfavorevoli del loro di

ambiente (NON EREDITABILI). Livello

–e.g. risposta a stress termico

 Adattamento: cambiamenti evolutivi che permettono a una popolazione

di occupare un certo ambiente. Questi includono modificazioni di geni

esistenti, comparsa/perdita di geni, o cambiamenti epigenetici

(EREDITABILI), livello di popolazione.

–e.g. enzimi termostabili in organismi che tollerano temperature elevate

Come interviene l’interazione per aiutare le piante a sopravvivere allo

stress?

Nel valutare le risposte a stress ambientali delle piante, bisogna

considerare la presenza dei microrganismi ad esse associati.

 Risposte della pianta allo stress

 Risposte del microbiota allo stress

 Influenza reciproca di pianta e microbiota in presenza di stress 118

Risposte del microbiota a stress ambientali

Il microbiota ha delle risposte dirette e indirette allo stress.

Qualsiasi parametro venga considerato, si osserva sempre un cambiamento nella composizione della flora batterica

(azione diretta).

1. CO2 e temperatura danno una variazione non specifica, ma variazioni casuali, senza nessuna direzione

precisa. Altri casi: habitat adaptation = variazione verso una direzione precisa. Il cambiamento del micobiota

influisce sulla pianta.

2. Esperimento di stress idrico indotto (azione indiretta): le piante in queste condizioni diminuiscono gli

essudati radicali → si modifica la composizione del microbioma della pianta.

Molti esempi di adattamento a particolari stress ambientali da parte dei singoli organismi.

Ci sono indicazioni che componenti del microbiota siano in grado di facilitare la sopravvivenza/adattamento delle

piante a condizioni di stress? Risposta: sì.

Gli endofiti fungini sono comuni simbionti delle piante. Sono tutti vicini tra loro dal punto di vista tassonomico,

funzionale e nelle modalità di colonizzazione.

Endofiti fungini di Tipo I (Clavicipitales)

 Genere comune: Neotyphodium

 Trasmessi verticalmente attraverso i semi (es. sclerozi nelle spighe)

 Principalmente coinvolti nella resistenza a erbivori (vertebrati) attraverso la produzione di alcaloidi

Endofiti fungini di Tipo II

 Molti generi diversi 119

 Trasmessi orizzontalmente

 Coinvolti nella resistenza a stress ambientali diversi

Tolleranza a stress ambientali attraverso la simbiosi → termotolleranza

Piante erbacee da siti geotermali (Dichanthelium lanuginosum) ospitano

endofiti fungini (Curvularia protuberata) che le rendono termotolleranti (fino

a 60-70°C). Questo grazie ad un virus ad RNA. Sia la pianta che il fungo sono

termosensibili in condizioni aposimbionti (>40°C). La termotolleranza è conferita al fungo dalla

presenza di un virus a RNA.

Esperimento: Verifica del ruolo virale nella termotolleranza

Esperimento con fungo virus free (VF), fungo wild type e fungo An = che, tramite anastomosi (fusione ifale) ha

permesso al VF di riacquistare il virus.

Il virus può essere eliminato dal citoplasma del fungo → Ceppo virus-free (VF)

Il virus può essere trasferito attraverso anatomosi ifale → Ceppo An Risultato: solo il fungo contenente il

virus conferisce termotolleranza.

Esperimento: SYMBIOTIC TECHNOLOGY Virus introdotto nel pomodoro

(interesse agronomico) → Il fungo

contenente il virus conferisce

termotolleranza anche ad altre piante

(es. pomodoro), anche se la

colonizzazione fungina è ridotta. 120

Tolleranza a stress ambientali attraverso la simbiosi → salinità

Fusarium culmorum è un fungo endofita isolato da piante di Leymus mollis, una specie che cresce in zone costiere

con elevata salinità. Quando inoculato su piante axeniche di Leymus mollis, F. culmorum conferisce tolleranza a

stress salino, in vitro e in campo. Solo ceppi di F. culmorum da suoli soggetti a stress salino (es. FcRed1) conferiscono

tolleranza a questo tipo di stress. Tolleranza conferita solo verso stress salino, non stress idrico.

Esperimento in campo: sopravvivono solo quelle con il fungo proveniente da quel territorio.

Esperimento con riso (Symbiotic technology)

Si è cercato di trasferire lo stesso ceppo (brevettato e commercializzato) al riso (interesse agricolo).

Quando viene inoculato su piante di riso, anche in assenza di stress, SaltSym (un ceppo di F. culmorum) aumenta la

produttività in termini di biomassa vegetativa e di produzione di semi, anche senza stress salino.

Lo stress ambientale quindi ha un basso effetto sulla pianta grazie alla presenza del simbionte. 121

Patogeni

Alcuni endofiti fungini hanno un’attività di biocontrollo e possono difendere le piante da attacchi di altri patogeni

(es. Fusarium, Colletotrichum). Colletotrichum è genere

molto vario, comprende funghi con funzioni ecologiche

diverse.

Questi stessi endofiti fungini (Fusarium, Colletotrichum)

possono comportarsi come patogeni su alcune piante

ospiti.

La capacità di endofiti patogeni di trasformarsi in agenti

di biocontrollo è controllata da singoli geni, come 122

dimostrano esperimenti di «gene-disruption» in

Colletotrichum magna.

Esperimento di mutagenesi di uno di questi patogeni

→ molti mutanti passano da essere patogeni ad essere

agenti di biocontrollo.

Risultato: si ottengono 4 ceppi non più patogeni

A: ceppo mutato, 100% di colonizzazione, che conferisce

alla pianta protezione da altri patogeni (+/+).

B: ceppo intermedio, 100% di colonizzazione ma meno

efficace come agente di biocontrollo.

C: ceppo non patogeno, non agente di biocontrollo, con

100% di colonizzazione (+/0)

D: ceppo non patogeno, non agente di biocontrollo, con

0% di colonizzazione.

L’adattamento è habitat/stress specifico → Habitat-Adapted (HA) symbiosis

La pianta acquisisce la capacità di far fronte a degli stress tramite l’interazione con microrganismi, ma non basta

avere nei tessuti il microrganismo: esso deve avere capacità specifiche che trasferisce alla pianta, senza avere un

effetto generalista contro gli stress (non dà resistenza a tutto, ma ad un particolare stress habitat-specifico).

La pianta può avere più endofiti o simbionti in generale, a patto che questi non siano antagonisti tra loro.

Esperimento:

Il fattore tempo nella Habitat-Adapted (HA) symbiosis:

La domanda: A fronte di un cambiamento globale del clima, le popolazioni naturali riescono ad adattarsi in modo

sufficientemente rapido da evitare la loro scomparsa? (es. siccità) → «understanding adaptation in a community

context». 123

Esperimento che ha affrontato il tema del tempo:

Piante della stessa specie, inoculate nello stesso momento, tenute per 3 generazioni (portate a seme e riseminate) in

condizioni wet o dry.

Nel terreno all’inizio era presente la medesima flora batterica, e poi mantenuta per entrambe le condizioni.

Nella seconda fase sono stati presi i semi di wet e di dry con i rispettivi microrganismi e poi si sono fatte le diverse

combinazioni.

Risultati: Per le piante la storia pregressa non ha alcuna influenza.

Dopo tre generazioni in cui la pianta è esposta a uno specifico

trattamento idrico (wet/dry), la pianta non mostra differenze

nel fenotipo → Non c’è risposta adattativa.

Per i microrganismi invece c’è una differenza statisticamente

significativa, soprattutto per la condizione wet.

L’inoculo con popolazioni microbiche selezionate da

un’esposizione a uno specifico trattamento idrico (wet/dry) 124

aumentano nella pianta alcuni parametri legati alla fitness a

seconda delle condizioni (wet/dry) → C’è risposta adattativa

del microbiota.

Le differenze osservate sono parametri della pianta!

La risposta a stress idrico della pianta dipende

dall’adattamento del microbiota, più che dal proprio

adattamento

Nel corso di tre sole generazioni in cui la pianta è esposta

a uno specifico trattamento idrico (wet/dry), la

composizione del microbiota cambia significativamente,

per quanto riguarda sia la componente batterica sia

quella fungina

La fitness della pianta dipende largamente dal microbiota

ad essa associato.

La risposta adattativa delle piante ai cambiamenti

ambientali può essere relativamente rapida, grazie alla

più rapida risposta delle comunità microbiche.

I tempi di adattamento sono lunghi per la pianta, ma può

sopravvivere grazie ai batteri associati (l’adattamento

non sappiamo se è avvenuto per i batteri).

Effetto diretto dei microrganismi sulle funzioni

dell’ecosistema, rispondono molto rapidamente alle

variazioni ambientali. 125

NUTRIENTI MINERALI

Risposta delle piante alla presenza di elementi minerali:

 Carenza (es. Macro- e Microelementi)

 Eccesso (es. Metalli pesanti)

Per capire quali elementi sono essenziali per le piante, si dimostra attraverso:

• la misurazione diretta degli elementi nell’organismo

• esperimenti di privazione (Legge di Liebig)

Composizione elementare delle piante: 126

Gli elementi si dividono in macronutrienti e micronutrienti, queste definizione sono unicamente basate sulle

concentrazioni presenti nella pianta, sulla quantità, e non sull’importanza.

Sia micro- che macroelementi sono tutti essenziali.

Criteri per definire un elemento

essenziale:

1. È richiesto dalla pianta per

completare il suo ciclo vitale

(produrre semi vitali).

2. È parte di una molecola o di un

costituente della pianta essenziale

(es. Mg nella clorofilla o N nelle

proteine).

3. Se compaiono sintomi di deficienza

anche quando la pianta produce

semi vitali.

Esperimenti di privazione in colture idroponiche per verificare quali elementi sono essenziali

Vengono fatte due colture idroponiche, una con una soluzione contenente tutti i minerali, di controllo, l’altra con

tutti gli elementi meno uno. 127

Macronutrienti e Micronutrienti: sono tutti elementi essenziali

Alcune specie vegetali sono caratterizzate da quantità particolarmente alte o basse di specifici elementi:

ogni pianta ha le sue esigenze nutrizionali. Ad es. le monocotiledoni e le dicotiledoni hanno una composizione

diversa delle pareti cellulari; le Brassicacee sono ricche di S, che usano per la costruzione di metaboliti secondari

particolari.

Analisi utili in agricoltura: valutare la necessità di applicazione di fertilizzanti. 128

Il problema delle carenze nella nutrizione minerale

Se questi elementi non ci sono o sono poco presenti, causano dei fenomeni di carenza da

cui si riflette una perdita di produttività nell’ecosistema in generale, e carenze

nell’alimentazione umana e animale.

Salute delle piante Produttività in ambienti antropici e naturali

Crescita vegetativa

Produzione frutti/semi Alimentazione umana e animale

Contenuto in macro- e microelementi 129

Grosso problema di carenza di Fe nelle piante è causa di casi di anemia in tutto il mondo.

L’interesse è quello di aumentare i minerali nelle piante in funzione della dieta umana → BIOFORTIFIED FOOD.

Es. miglio, particolare cultivar ricca di Fe.

Increasing mineral content of foods → BIOFORTIFIED FOOD 130

Nutrizione minerale nelle piante

 Dove sono i nutrienti?

 Assorbimento da parte della pianta

 Ruolo dei microrganismi nella nutrizione minerale

Suolo = Sistema multifasico contenente nutrienti a vario grado di solubilità. I nutrienti originano da materiale

inorganico ed organico, ma solo una piccola parte si trova in soluzione. Le soluzioni del suolo costituiscono la fonte

immediata di nutrienti per le piante. Gli elementi in forma ionica sono legati alle particelle del suolo e possono

essere sostituiti da altri ioni diventando così disponibili per la crescita delle piante: scambio ionico.

Il suolo è come una resina a scambio cationico, ha una struttura complessa, multifasica (componente organica e

inorganica). La componente minerale per la maggior parte è complessata in fase solida, ma le piante assorbono solo

la componente in fase liquida → la pianta deve quindi prima staccarla dalla parte solida, e lo fa tramite un sistema di

SCAMBIO IONICO: le particelle del suolo sono cariche, soprattutto la componente organica, di solito negativamente

→ qui abbiamo un’interazione con i minerali, a carica positiva. Attraverso un fenomeno di competizione si ha uno

+

scambio ionico, tramite un eccesso di cariche positive (ioni abbondanti). Le piante usano H come cationi per

2+ 2+

scalzare Ca , Fe … Delle pompe protoniche ATPasi buttano all’esterno ioni idrogeno, abbondanti nelle radici. Gli

anioni invece non sono adsorbiti dalle particelle del suolo, ma subiscono dilavamento, tanto più piove tanto più

vengono portati in profondità e diventano inaccessibili per la pianta.

Il pH del suolo incide sensibilmente sulla disponibilità di nutrienti inorganici: 131

pH = concentrazione di protoni → influisce molto sulla disponibilità dei nutrienti inorganici.

Nei suoli acidi i metalli sono più solubili (fino ad essere un problema), mentre sono carenti nei suoli neutri e basici.

La maggior parte degli elementi minerali sono assorbiti come ioni inorganici dalle soluzioni del terreno.

Una volta che gli elementi vanno in

soluzione avviene l’assorbimento da

parte della pianta, che può

intervenire sotto due aspetti:

1. Sviluppo vegetale: la pianta può

rispondere a condizioni

specifiche modificando il proprio

sviluppo radicale;

2. Aspetto metabolico: tramite la

regolazione dell’espressione di 132

specifici trasportatori.

Sviluppo della pianta: La pianta può aumentare la ramificazione delle radici (tramite

regolazione del periciclo → primordi indotti da un gradiente di

auxina) nelle zone ricche di elementi disponibili.

La pianta percepisce le zone ricche di elementi nutritivi e lì

concentra le proprie risorse per sviluppare l’apparato radicale.

Formazione delle radici laterali:

La formazione delle radici laterali è indotta (insieme ad altri

fattori) dall’auxina.

Esperimento: Risposte a stimoli ambientali: presenza di nutrienti Per alcuni minerali (non tutti) c’è un effetto

evidente dovuto alla concentrazione dei

metalli. 133

→ zona meglio ossigenata Bisogna considerare la disponibilità di O2 per

evitare effetti di crescita dovuti alla presenza di

O2 e non di elevate concentrazioni di elementi.

→ zona peggio

ossigenata

Capacità di “sentire” le diverse concentrazioni degli

elementi → Concetto di Trascettori = Trasportatori e

Recettori, contemporaneamente.

Esempi: Trasportatore dell’Ammonio (AMT1),

Trasportatore del Nitrato (NRT1).

Attraverso la regolazione dei livelli di auxina, viene

regolata la produzione di radici laterali. All’aumentare

della concentrazione di nitrato aumenta anche la

trascrizione di un secondo trasportatore del nitrato

(NRT2).

La parte recettore di queste proteine percepisce le

variazioni all’esterno e induce delle regolazioni.

Ruolo dei microrganismi

I microrganismi che si associano alle piante possono agire in modi diversi:

-Alcuni endofiti fungini inducono un aumento della ramificazione radicale attraverso molecole diffusibili (→

aumento della superficie di scambio). 134

-Il ruolo dei licheni nella erosione e degradazione delle rocce, portano alla produzione dei suoli.

-Funghi ectomicorrizici «Rock eating» fungi: degradano e rompono la componente minerale nelle rocce.

-batteri coinvolti nella mineralizzazione degli elementi nel suolo 135

Associazioni pianta-microrganismi nella rizosfera

 La rizosfera è il volume di suolo che circonda le radici e ne è direttamente influenzato (es. essudati radicali)

 E’ una nicchia ecologica con elevata densità e diversità microbica

 Tra questi, sono noti diversi batteri azotofissatori

Generi più noti di azotofissatori rizosferici: Azotobacter, Azospirillum, Azoarcus, Burkholderi.

Le piante beneficiano anche dell’azione di microrganismi non simbionti nell’acquisizione di macronutrienti

Batteri responsabili della mineralizzazione dell’azoto organico: 136

Ci sono moltissimi altri microrganismi che rendono disponibili gli elementi nel

suolo, ad es. P. Ci sono tante altre componenti che influiscono sulla disponibilità

di P.

Tramite screening si è scoperto che una delle capacità più ricorrenti è quella di

liberare e solubilizzare il P.

La capacità di solubilizzare un elemento è molto facile da individuare: si fanno

delle piastre con colture di batteri e terreni arricchiti di quell’elemento in forma

non solubile.

Phosphate solubilizing microorganisms (PSM) 137

Several soil bacteria and fungi secrete organic acids and lower the pH in their

vicinity to bring about dissolution of bound phosphates in soil.

Bacteria: e.g. Pseudomonas, Bacillus, etc

Fungi: e.g. Penicillium, Aspergillus etc

Increased plant yields were

demonstrated due to inoculation

of peat based cultures of Bacillus

polymyxa and Pseudomonas

striata.

La simbiosi classica aumenta la

capacità delle piante ad accedere

alle risorse, ma accanto a queste

interazioni classiche ci sono

moltissime interazioni che

avvengono nel suolo, anche in maniera indiretta (N-fissatori liberi…).

Vengono anche usati come ammendanti.

ECCESSO DI METALLI

Molti metalli sono essenziali, hanno un ruolo metabolico (cofattori, ecc.)

La carenza porta a malattie e l’eccesso a tossicità, ogni pianta

ha una soglia di tossicità per ogni metallo, compresi quelli

essenziali.

Importanza dei metalli essenziali a livello cellulare e

molecolare:

 Presenti in molte molecole biologiche

 30% degli enzimi contiene uno ione metallico

 Formano gradienti di carica e di concentrazione

 Stabilizzano strutture cellulari e/o molecolari 138

 Catalizzano reazioni di ossidoriduzione

Metallomica = studio delle componenti cellulari che

contengono metalli.

Essenziali

Metalli Non essenziali

Metalli NON Essenziali:

 Non sono note funzioni biologiche

 Sono tossici a qualsiasi concentrazione

Alluminio (Al)

Arsenico (As)

Cadmio (Cd)

Cobalto (Co)

Piombo (Pb)

Mercurio – Inorganico (Hg)

Mercurio – Organico (Hg-CH3)

Nickel (Ni)

Stagno (Sn)

Es. nell’uomo

Eccesso di arsenico, nickel, cadmio → Tumori e/o

malfunzionamento sistema immunitario.

Eccesso di mercurio → Malformazioni e disordini neurologici.

Alcune piante usano metalli particolari per funzioni particolati, ad es. alcune alghe marine usano il Cd al posto dello

Zn per la formazione di una proteina. I metalli non essenziali sono tossici a qualsiasi

concentrazione → possono competere con quelli essenziali

(stessa carica ma proprietà chimico-fisiche diverse).

Gli inquinanti elementari (es. metalli pesanti) non possono

essere degradati chimicamente e danno origine a fenomeni

di BIOACCUMULO lungo la catena trofica.

OMEOSTASI cellulare

La cellula deve distinguere tra metalli essenziali e metalli non essenziali e mantenere le giuste concentrazioni.

 Metalli essenziali:

o Aumento della biodisponibilità nel suolo

o Sistemi di trasporto attraverso la membrana cellulare

o Mantenimento ottimale delle concentrazioni intracellulari

 Metalli non essenziali:

o Riduzione della biodisponibilità nel suolo 139

o Blocco del trasporto attraverso la membrana cellulare Meccanismi di Tolleranza/Resistenza

o Meccanismi di detossificazione cellulare

Tolleranza: l’organismo è intrinsecamente in grado di sopravvivere ad elevate concentrazioni di metalli pesanti, ad

es. batterio con parete molto spessa (comparto che può assorbire i metalli).

Resistenza: l’organismo mette in atto meccanismi di difesa per poter sopravvivere ad elevate concentrazioni di

metalli pesanti (meccanismo attivo).

Nell’immagine sopra il batterio può essere sostituito con un fungo o una pianta. Stessi meccanismi.

Legame organo-metallici = legame covalente tra molecola organica e metallo.

Chelanti extracellulari: ad es. siderofori, che aumentano la biodisponibilità degli elementi.

Bioprecipitazione : diminuisce la biodisponibilità degli elementi, oppure adsorbimento sulla parete cellulare, che

sequestra i metalli. 140

Alcuni trasportatori sono più specialisti, altri più generalisti, che possono essere sfruttati da metalli non essenziali.

I metalli non essenziali entrano nella cellula

utilizzando sistemi di trasporto per altri elementi:

Cadmio: utilizza i sistemi di trasporto del calcio o

di altri metalli essenziali

Arsenico: utilizza il sistema di trasporto del

fosfato

Cromo VI e Selenato: utilizzano il sistema di

trasporto del solfato, vengono inserite nelle

molecole organiche, che poi non funzionano. 141

Trasportatori :

 di uptake

 di efflusso

si trovano sia sulle membrane esterne che quelle

interne, ad es. sul tonoplasto (sistema di

compartimentazione).

Tutti gli organismi, inclusi gli organismi vegetali, hanno meccanismi di risposta/acclimatazione a variazioni nella

concentrazione intracellulare di metalli:

 Regolazione Up-take/Efflusso

 Chelazione

 Compartimentazione

Meccanismi intracellulari:

 Trasportatori sulla membrana che attivano l’efflusso, l’intensità della risposta dipende da quanti

trasportatori l’organismo ha, quanto sono specifici, ecc.

 Chelazione → non permette ai metalli di interagire con le altre molecole. Sono molecole organiche che

sequestrano i metalli.

o Acidi organici: i loro gruppi carbossili dissociati sono carichi negativamente, legano il metallo. Es. ac.

citrico. È un sistema di base, ce ne sono di più specifici.

o Metallotioneine (MT) Sono più efficienti

o Fitochelatine

Chelanti intracellulari

Cys → gruppo SH in grado di legare i cationi. MT contiene molte Cys, è un ottimo chelante dei metalli.

Sono presenti in quasi tutti gli organismi. Probabilmente sono coinvolti nei meccanismi di omeostasi cellulare più che

di detossificazione.

La loro espressione è regolata dalla concentrazione di alcuni metalli (es.Cu2+) → ecco perché si pensa che siano un

sistema di base dell’omeostasi. 142

Regolazione nell’espressione delle METALLOTIONEINE:

Fitochelatine

Sistema molto efficiente, presente in alcune piante, funghi e in Caenorabditis

elegans. È l’ultimo prodotto della via del glutatione (GSH).

Il GSH è un peptide di 3 aa, di cui uno è una Cys (riducente). È un peptide ma non

una proteina, poiché non è sintetizzato sul ribosoma ma da enzimi (ribosoma-

indipendente).

γ-glutamil-peptide è il termine più corretto, chiamato così per il suo legame

anomalo, in posizione γ.

Glutatione: tripeptide presente in tutti gli organismi

Fitochelatine: comuni nel regno vegetale, si trovano anche in alcuni funghi e animali. 143

Formula generale: (γGlu-Cys)n-Gly (n = 2-11)

GSH ha proprietà chelanti e riducenti. A partire da questa molecola alcuni organismi

sintetizzano peptidi più lunghi: le fitochelatine.

Questa condensazione, con eliminazione della Gly finale, avviene ad opera della

fitochelatina sintasi, che unisce 4-6 molecole di GSH.

Il vantaggio delle fitochelatine è che hano molte Cys che chelano i metalli in modo

più efficiente rispetto al GSH. 144

La regolazione della fitochelatina sintasi è di tipo allosterico: l’enzima ha un sito allosterico per il Cd (principalmente,

maggiore affinità), che quando è presente, si lega a questo sito e attiva l’enzima. Una volta che le concentrazioni del

Cd sono molto basse, per meccanismi di equilibrio chimico il Cd si slega e l’enzima si disattiva. Quando invece non è

presente, il sito è vuoto e l’enzima non è attivo.

Il Cd è un mutagenico indiretto: impedisce i sistemi di riparazione del DNA.

I γ-glutamilpeptidi sono essenziali per la tolleranza ai metalli

Nei funghi non sono molto presenti questi chelanti.

Esperimento con S. pombe mutante per le fitochelatine:

Questo sistema è stato usato anche per dimostrare l’importanza di questo meccanismo nelle piante: esperimento di

complementazione con geni vegetali: 145

Risultato: il gene è indispensabile per la crescita.

Chelazioni = equilibrio tra forma libera e forma legata, è comunque un rischio tenere nella cellula dei metalli.

Il metallo chelato non rimane nel citoplasma, ma viene trasportato nel vacuolo sul tonoplasto ci sono

trasportatori che fano passare i complessi GSH-METALLO e FITOCHELATINA/METALLO: sono trasportatori ABC (ATP

binding cassepte), con consumo di ATP.

Nel vacuolo avvengono processi di precipitazione che rendono insolubili e mobilizzano i metalli in una forma non

tossica per lunghi periodi, anche per sempre.

I metalli pesanti producono direttamente e non le ROS: 146

La risposta a molti metalli pesanti coinvolge direttamente o indirettamente il sistema antiossidante della cellula:

Adattamento a stress

Popolazioni che sviluppano meccanismi di resistenza ai metalli pesanti sono un buon esempio di adattamento per

selezione “naturale”.

Adattamento = processo evolutivo ereditabile.

Sono noti ecotipi sia per piante che per microrganismi in grado di sopravvivere in condizioni di inquinamento da

metalli pesanti. Ci sono anche casi di animali adattati ma non ci sono studi a tal proposito.

Esistono zone naturalmente arricchite di metalli pesanti e altre che lo sono artificialmente. 147

Nonostante l’ampia variabilità nella risposta, è stato chiaramente dimostrato il ruolo protettivo svolto dai funghi

simbionti nei confronti dei metalli tossici, in primis dall’interazione on funghi micorrizici.

Per le AM ci sono dati contrastanti.

Importanza nel recupero e nella rivegetazione di siti contaminati. 

Comparsa di funghi micorrizici metallo-tolleranti in ambienti inquinati Funghi ectomicorrizici, Funghi micorrizici

ericoidi: per entrambi la tolleranza della pianta dipende dal fungo, con meccanismi non sempre chiari, ma

dimostrati.

Esperimento

In laboratorio si sono create condizioni di pressione selettiva su popolazioni microbiche (elevato numero di cicli 148

vitali).

Risultato: mutazioni e selezione dei mutanti adattati.

Anche in tempi brevi si può riscontrare la compara di ecotipi (nel corso di decenni), e a volte di endemismi veri e

propri.

In un terreno inquinato la sopravvivenza può essere mediata da microrganismi presenti nella rizosfera, a patto che

questi funghi stessi siano adattati agli inquinanti.

Esperimento in zone di miniera attiva tra il 1900 e il 1960 (metallo inquinante portato in superficie)

Inquinamento da Zn e Cd, zona vicino ad una foresta (dominanza funghi ECM). Campioni di micelio prelevati da

questa zona crescono bene su terreno inquinato, invece campioni prelevati da zone lontane non crescono bene → Si

sono riscontrati alcuni ecotipi tolleranti, anche se portati via dal loro ambiente → non si tratta di plasticità fenotipica

ma di caratteristiche genetiche.

Identificato un cline nella concentrazione di inquinante, sia nel suolo che nelle piante, con l’aumentare della distanza

dal sito di origine dell’inquinamento: 149

Questo gradiente riflette la contaminazione dell’ambiente.

I campioni prelevati nelle zone più inquinate (<5 km) non crescono a concentrazioni bassissime di Zn → c’è stato uno

shifting nelle esigenze di Zn.

Di questo esperimento ne sono stati studiati anche i meccanismi cellulari:

Meccanismi di resistenza/tolleranza di Suillus luteus all’eccesso di zinco

Nei ceppi tolleranti c’è un contenuto molto minore di Zn nella cellula → tra i meccanismi di detossificazione non c’è

compartimentalizzazione vacuolare né adsorbimento, ma ci sono meccanismi di efflusso che mantengono il metallo

all’esterno. 150

Si è anche andati a cercare nel genoma i sistemi di efflusso: si è trovato che sono presenti molte copie geniche di

geni codificanti per i trasportatori, da 1 copia a 5-7 nei ceppi tolleranti → hanno un numero più elevato di

trasportatori. Non si sa se questi trasportatori siano anche modificati.

Esperimento con funghi ericoidi: Ecotipi metallo-tolleranti di funghi micorrizici ericoidi

Zone minerarie ricche di As, si è visto come crescevano i vari ceppi isolati da queste zone.

Risultato: i ceppi si comportano in modo leggermente diverso da ceppo a ceppo, ma con un andamento chiaro:

il ceppo di controllo non cresce in presenza di As, mentre gli altri due ceppi sì → c’è stato un adattamento

all’inquinamento, in tempi brevi.

Esperimento Polonia – S. Francesco al campo 151

Si sono fatti lotti sperimentali in Polonia, le prime piante a ricolonizzare il lotto: ericacee, che mantengono

l’adattamento, stabile.

Esperimento sui meccanismi di esclusione dei ceppi polacchi e quelli italiani

Risultato: i meccanismi di esclusione sono diversi nei due ceppi: nel ceppo unpolluted è visibile un alone di

solubilizzazione → il fungo produce degli acidi organici o dei chelanti che solubilizzano il metallo, mentre nell’altro

l’alone è molto ridotto → ridotta capacità di solubilizzazione, ma che è un vantaggio in questi terreni inquinati, dove

troppo Zn solubile da gestire è un problema.

Tra il ceppo polluted ce n’è uno con alone di solubilizzazione analogo ai ceppi unpolluted: qui però il ceppo è in

grado di formare dei cristalli → ac. ossalico con Zn precipitato (bioprecipitazione).

Adattamento a livello di meccanismi extracellulari 152

Meccanismo di detossificazione delle ROS: complesso Cu/Zn SOD → presente nei funghi:

Cu/Zn SOD è un’isoforma particolare con doppia funzione: detossifica dalle ROS e dai metalli, è un enzima molto

importante.

Esperimento di inserimento del gene fungino per la Cu/Zn SOD in lievito (S. cerevisiae):

Esperimento di mutagenesi 153

I mutanti per SOD crescono lo stesso grazie ad altri meccanismi, ma crescono molto di meno.

La SOD ha tante altre funzioni

Esperimento

Sequence polymorphisms in O.maius strains from polluted and non polluted sites

Always higher sequence polymorphism in the functional SOD1 gene than in the neutral ITS gene. Significantly higher

sequence polymorphism in strains derived from heavily polluted industrial sites (Niepolomice). In the Niepolomice

strains, sequence polymorphism accumulates in the SOD1 promoter region.

La domanda che ci si è posti era: c’è una diversa frequenza di mutazioni?

Alla base dell’adattamento ci sono predisposizioni a variazioni geniche nelle popolazioni sotto pressione?

ITS = gene neutro

SOD = gene funzionale

Risultato: ci sono molte più mutazioni nel gene funzionale, e in particolare nel ceppo delle zone più inquinate

(Polonia). Le mutazioni non sono avvenute a causa del metallo, altrimenti ce ne sarebbero molte anche nel gene non

funzionale. 154

Si è poi andato a vedere cosa era mutato.

Zone del gene SOD più mutate: la frequenza maggiore di mutazioni è nella zona del promotore (deputato alla

regolazione genica) del ceppo polacco.

1. Gene funzionale ha più mutazioni del gene neutro

2. Mutazioni più frequenti nel promotore.

BIORISANAMENTO

Per gli inquinanti organici sono più usati i microrganismi per risanare, mentre per gli inquinanti inorganici sono più

usate le piante. Si sfrutta il fatto le piante estraggono metalli pesanti dal terreno.

Queste devono essere piante metallotolleranti → ci sono diverse strategie:

 Meccanismi di esclusione

 Accumulo proporzionale ai livelli di inquinamento: più che per il fitorisanamento, sono utili come

bioindicatori, indicano la frazione biodisponibile di un inquinante nel suolo.

 Meccanismi di accumulo: hanno buoni meccanismi interni di detossificazione, sono le piante

iperaccumulatrici, che hanno meccanismi che consentono alle piante di crescere bene ad elevate

concentrazioni di inquinanti. 155

FITOESTRAZIONE FITOSTABILIZZAZIONE

Vantaggi

 

Elimina la contaminazione Limita la mobilità dei contaminanti

 

Restituisce il terreno per altri usi Ecorestoration

 

Si possono usare ammendanti che solubilizzano i Meno costoso

metalli nel suolo che poi sono assorbiti dalla Basta usare piante metallotolleranti con un

pianta (iperaccumulo nel vacuolo, nelle parti buon apparato radicale

aree) Svantaggi

 

Più costoso e lungo Il contaminante rimane nel suolo

 Limitato alla profondità radicale

 Piante accumulatrici e tolleranti

 Non sempre ha buon esito

FITOSTABILIZZAZIONE

stabilizzazione dei contaminanti dal suolo. 156

FITOESTRAZIONE

Estrazione di contaminanti dal suolo

Metalli assorbiti dal suolo e trasportati nella chioma.

Accumulo dei metalli fitoestratti nella parte aerea → raccolta

e incenerimento della biomassa vegetale.

Iperaccumulatrici:

450 specie nelle Angiosperme. Comparse nei luoghi con

elevate concentrazioni di metalli.

È un adattamento metallo-specifico.

Non è un adattamento all’inquinamento, ma è un

adattamento di difesa contro gli erbivori. 157

Ni: conferisce un colore particolare al

succo floematico. 158

Esperimento

Piante iperaccumulatrici di zinco mostrano aumentata espressione di geni che codificano specifici trasportatori sul

tonoplasto (MTP1).

Il genoma di A. halleri (iperaccumulatrice) contiene 5 copie del gene MTP1, mentre A. thaliana (non

iperaccumulatrice) ne contiene solo 1: 159

L’efficienza della fitoestrazione si può aumentare in vari modi:

1. La fase di uptake si può coadiuvare mediante l’aggiunta di chelanti nel suolo per facilitare l’assorbimento dei

metalli.

Chelanti = ac. citrico, siderofori, EDTA → è il più efficiente ma è molto costoso, inoltre spargere queste

sostanze nel suolo può essere dannoso nei punti in cui non ci sono radici vicine che assorbano: lì i metalli

solubilizzati finiscono nelle falde. (Svantaggi: Alta probabilità di contaminazione della falda acquifera, Costo

dei reagenti, Attività limitata nel tempo).

Altro sistema: si usano microrganismi (batteri e funghi) della rizosfera, he producono siderofori e altre

molecole che rendono più biodisponibili i metalli, inoltre così si ha un’azione localizzata e non c’è bisogno di

un inoculo continuo (mentre gli agenti chimici vanno aggiunti più volte): il rizoma viene mantenuto dalla

pianta stessa → si cerca di arricchire la rizosfera con le componenti efficaci in quella funzione (ad es. in

questo caso: efficaci nella solubilizzazione). RIZOSPHERE ENGENEERING.

Biotrasformazione e/o chelazione da parte di microrganismi (Es. Batteri e funghi saprotrofi della rizosfera)

Role of siderophore producing bacteria(SPB) in

phytoextraction of heavy metal contaminated soils.

Metal-resistant SPB can increase the efficiency of

phytoextraction directly by enhancing the metal

accumulation in plant tissues. Siderophores produced

by rhizosphere bacteria solubilize unavailable forms of

heavy metal-bearing minerals by complexation. Plants

can then uptake metals from metal–siderophore

complexes possibly by root mediated processes, such

as chelate degradation and release of metals, the

direct uptake of siderophore–metal complexes or by a

ligand exchange reaction.

Es. Chelazione da parte di batteri della rizosfera

(Microbacterium saperdae, Pseudomonas monteilii,

Enterobacter cancerogenes) aumenta di 4x

l’assorbimento di Zn da parte di Thlaspi caerulescens.

Vantaggi dei chelanti naturali prodotti da microrganismi della rizosfera:

• azione limitata alla zona di influenza della radice

• produzione continua (effetto rizosfera)

Rhizosphere engineering

La componente microbica nella rizosfera può influenzare l’efficacia della pianta nel fitorisanamento (sia metalli che

inquinanti organici) 160

RIZOFILTRAZIONE

Le acque contaminate fluiscono attraverso un substrato poroso fino alla zona di raccolta, venendo a contatto con

aree aerobiche ed anaerobiche

Scarti municipali, domestici, agricoli ed industriali. 161

FITOVOLATILIZZAZIONE

Rilascio in forme volatili meno

tossiche. Si tratta di una particolare

forma di fitoestrazione, riguarda solo

alcune elementi tra cui il principale è il

Se. Il vantaggio di questo processo è

quello di diluire molto l’inquinante, che

così può essere disperso. Le forme

liberate sono meno tossiche.

Il Se nella maggior parte delle piante 162

segue questo destino. Ci sono alcuni

taxa particolari che invece accumulano

Se, strategie particolari di accumulo.

Il Se usa trasportatori del solfato per

entrare nella cellula vegetale

(caratteristiche chimico-fisiche simili).

Il solfato, una volta introdotto nella

cellula, viene ridotto in solfito e

incorporato in Cys o altri aa. Il selenato

subisce lo stesso destino, il problema è

che la Cys e gli altri aa funzionano

grazie ai gruppi S, la Se-Cys non

funziona, avviene un’alterazione

funzionale delle proteine: mancano i

ponti disolfato.

Selenio:

Elemento essenziale per organismi

animali e microrganismi.

Nelle piante non è noto un ruolo

biologico.

Nel suolo: Tossicità del Se:

Il Se mima lo S e viene

trasformato dagli enzimi della

stessa via metabolica.

Si forma Se-Cisteina, che viene

inserita in proteine al posto della

cisteina (alterandone la

funzione).

Molte piante sono in grado di produrre forme volatili del Se, ad es: dimetilselenide, si tratta di molecole idrofobiche

a baso peso molecolare, che vengono diffuse tramite gli stomi. 163

In alternativa ci sono le piante iperaccumulatrici per il Se, ma ci sono pochi taxa.

Queste specie accumulano Se in forme non tossiche.

Astragalus bisulcatus è un’iperaccumulatrice del Se. Il Se viene accumulato in forma

organica, ma non tossica.

In A. bisulcatus, un enzima, la Se-Cys metil trasferasi (SMTA), metila questo

composto e ne impedisce l’inserimento nelle proteine:

Ciò che rende non tossica la Se-Cys è quindi la metilazione ad opera della SMTA, che permette alla cellula di

riconoscere la MeSeCys e di non inserirla nei processi di sintesi proteica. Viene invece accumulata nelle foglie, senza

danni.

Per confermare l’importanza di questa proteina nel processo di detossificazione:

Esperimento con A. thaliana trasformata

Si è inserito il gene per la SMTA e lo si è inserito in A.t. Risultato: a concentrazioni di selenito crescenti le piante

trasformate crescevano normalmente e accumulavano la Me-Se-Cys, mentre quelle non trasformate non crescevano

bene.

In realtà A.t. non assorbe molto selenato, si è fornito direttamente selenito saltando la prima tappa del pathway di

detossificazione. 164

NB. La Me-Se-Cys ha spiccate proprietà anticancerogene

MERCURIO

Mercury exists in three forms (Elemental,

Inorganic and Organic).

 Hg (elemental mercury)

0

 +

Hg (mercurous inorganic mercury)

 ++

Hg (mercuric inorganic mercury)

 Methylmercury and Phenyl Mercuric

(organic forms)

Organic compounds are lipid soluble and

pass readily across biological membranes.

Methylmercury is primarily a neurotoxin

(Minamata syndrome) while mercuric

chloride is toxic to the kidneys.

Il mercurio può essere volatilizzato.

Allo stato elementare è volatile: la pianta

deve essere in grado di renderlo

elementare. Ad oggi sono noti solo dei

batteri con questa capacità. Sono stati fatti esperimenti per trasferire questa capacità alle piante.

La pericolosità del Hg sta negli effetti che ha sul sistema nervoso.

Forme organiche di Hg: le componenti organiche dei composti organici del Hg (metil- fenil-) rendono idrofobica la

molecola nel complesso, non hanno quindi bisogno di trasportatori, ma entrano nella cellula per diffusione secondo i

gradienti di concentrazione e vanno a concentrarsi soprattutto nelle zone lipidiche (es. guaine mieliniche).

Forme inorganiche di Hg: hanno bisogno di trasportatori per entrare nella cellula.

La tolleranza al Mercurio nei Batteri

Alcuni microrganismi hanno la capacità di detossificare i composti inorganici e organici del mercurio (es.

metilmercurio, fenilmercurio) e di ridurlo in una forma volatile. I geni codificanti gli enzimi/proteine necessari sono

su un singolo operone: 165

Solo se presente

merA è quindi presente in tutti i batteri in grado di volatilizzare il Hg → riduce e volatilizza solo le forme inorganiche,

codifica per un’ossidoreduttasi: la mercurio reduttasi

merB invece è presente solo in alcuni batteri → è una liasi, agisce rompendo il legame organometallico tra Hg e la

parte organica: organo-murcurio-liasi.

Esperimento: Inserimento di nuove capacità metaboliche nelle piante

(Sistema per validare l’efficacia di questa

manipolazione)

Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing the

merA gene are highly resistant to ionic mercury:

Se si inserisce merA in A.t. → riesce a crescere su

terreni con Hg inorganico.

I semi wild type invece non germinano. 166

Poi si è inserito anche merB:

Trasformazione di Arabidopsis con i geni batterici merA

e merB conferisce tolleranza a composti

organometallici del Hg:

Trasformazione di specie arboree per il fitorimedio

Le piante arboree sono più efficaci per il risanamento, hanno

un apparato radicale più profondo, più biomassa.

Una pianta molto usata è il pioppo, si sta lavorando per

inserirci merA e merB. •Liriodendron tulipifera

•Populus deltoides

Il Hg se volatile è meno tossico perché è diluito, inoltre è in forma inerte, meno tossica. Se rimane nel terreno porta

a bioaccumulo, inoltre è un metallo quindi non si può comunque distruggere.

La fitoestrazione in pratica

Fattori che determinano l’efficienza del

processo di fitoestrazione:

 Profondità delle radici

 Efficienza di traslocazione

 Tasso di accumulo 167

 Biomassa

 Velocità di crescita

 Numero di raccolti / anno

 Pratiche agricole

Efficienza di estrazione

E = tasso di accumulo x biomassa x N.

raccolti

...le piante iperaccumulatrici presentano

generalmente:

 Biomassa molto ridotta

 Crescita molto lenta

 Apparato radicale superficiale

Esperimento a: Woburn Expt,

Rothamsted Research Stn, UK

La migliore pianta iperaccumulatrice identificata, Thlaspi caerulescens (Brassicaceae) impiegherebbe 13-14 anni nel

recupero di un sito contaminato!

Dal punto di vista applicativo ci sono problemi insormontabili. Ci si è spostati

quindi su altre piante: piante metallo-tolleranti (ma non iperaccumulatrici) a

rapida crescita:

 Altre specie erbacee metallo-tolleranti con alta biomassa e discreti tassi

di accumulo (>1)

o es. Brassica juncea, Helianthus annuus

 Specie arboree a rapida crescita ed elevata biomassa.

o es. Salix, Populus, Eucalytus 168

Vecchio esperimento in UK

Utilizzo di piante a rapida crescita per la fitoestrazione. Es. Brassica juncea (accumula Pb, Cd,

CrVI, Ni, Zn e Cu): dopo due raccolti

fa vedere la

differenza della

concentrazione di 169

Pb nel suolo.

Miglioramento genetico per la fitoestrazione

 Piante iperaccumulatrici a crescita lenta e con biomassa ridotta sono incrociate con varietà a crescita rapida

e biomassa elevata.

 La mutagenesi può produrre individui con nuovi ed utili caratteri genetici.

 I tratti genetici che controllano l’iperaccumulo vengono introdotti in piante a crescita rapida ed elevata

biomassa.

Es: B.j. = crescita veloce e alta biomassa x T.c. = iperaccumulatrice

Nelle piante è più semplice fare incroci: il numero di

cromosomi diverso è il problema (per mitosi e meiosi),

mentre nelle piante o sono già poliploidi o si può

raddoppiare tutto il genoma e così si possono fare ibridi.

Altro es.: si possono individuare mutanti naturali o indotti:

Mutagenesi di Brassica juncea

I tratti genetici che controllano l’iperaccumulo vengono introdotti in piante a crescita rapida ed elevata biomassa: 170

Para-fitorimedio

L’ultimo approccio consiste nel considerare non solo i benefici dovuti al fitorisanamento in sé, ma anche agli

eventuali prodotti collaterali, ad es. il pioppo finito il risanamento può essere usato per farne della carta.

È un discorso di convenienza, tutto ciò che si può recuperare per rendere conveniente e ridurre il costo

dell’intervento: Alimenti arricchiti in metalli essenziali, Produzione di composti ad uso farmacologico, Produzione di

energia (biofuel), Produzione di biofibre (carta, cellulosa etc), → da terreni altrimenti non utilizzabili.

INQUINANTI ORGANICI

Sono tutti biodegradabili da parte di 171

microrganismi (soprattutto negli ambienti

marini)

Non hanno avuto tempo sufficiente perché si sviluppino dei

microrganismi in grado di degradarli.

Phytoremediation of organic pollutants is not very effective because of the limited enzymatic activities of plants:

Phytoremediation involves several

processes: pollutants in soil and

groundwater can be taken up inside

plant tissues (phytoextraction) or

adsorbed to the roots (rhizofiltration);

pollutants inside plant tissues can be

transformed by plant enzymes

(phytotransformation) or can volatilize

into the atmosphere

(phytovolatilization); pollutants in soil

can be degraded by microbes in the root

zone (rhizosphere bioremediation) or

incorporated in soil material

(phytostabilization).

Principles of Bioremediation

Principle of microbial infallibility (M. Alexander, 1965): the empirical observation that no natural organic compound

is totally resistant to biodegradation provided that environmental conditions are favourable → xenobiotic

(completely synthetic) chemicals not included!

Factors influencing biodegradability, rate of

biodegradation include:

• pH, temperature, organic matter content

• presence/absence of required microbial 172

consortium

• bioavailability of target compound

Compound degradability may depend on:

• elemental composition

• structure of basic repeating units (in a

polymer)

• linkage between units

• degree of branching in the molecule

• arrangement and types of substituents

Principio di infallibilità microbica:

Un composto presente sulla faccia della Terra da

tempi lunghi ha degli organismi degradatori, fa parte di cicli. Non vuol dire che tutti i microbi siano capaci di

degradare tutto.

Gruppo siciliano: ha studiato gli ecosistemi marini e in essi ha trovato microrganismi e interi nuovi taxa che

degradano i derivati del petrolio, sono sempre presenti nelle acque a basse concentrazioni, che esplodono quando

c’è l’inquinante.

In Alaska disastro ambientale negli anni ’90: fuoriuscita di petrolio, si è provato in molti modi, l’unico efficace è stato

fornire nutrienti alle popolazioni microbiche già esistenti, ma tempi lunghi a causa del freddo!

Le piante sanno fare molto poco nei confronti degli inquinanti organici, non sono in grado di attaccare grosi

composti poliaromatici, ma hanno un ruolo ancellare: di sostentamento della flora microbica.

I microrganismi sono i punti di riferimento per la biodegradazione di questi composti, tenndo conto di alcuni

parametri (pH, temperatura, complessità molecola inquinante…).

Processo di biodegradazione: MINERALIZZAZIONE

I metalli non si possono distruggere, invece gli inquinanti organici

sì. La mineralizzazione è il processo che trasforma l’inquinante in

CO e H O con liberazione di energia.

2 2

Questo processo avviene con inquinanti naturali, per lo più ad

opera di microbi a respirazione aerobica. 173

Purtroppo questo processo non è sempre completo, soprattutto con xenobiotici: si ha una mineralizzazione

incompleta (es. dealogenazione).

Il prodotto finale è meno tossico di quello iniziale, ma non sempre: a volte il composto terminale è più tossico di

quello iniziale, o più biodisponibile → per gli interventi di biorisanamento questo è un problema, spesso in un

terreno c’è un miscela di inquinanti organici.

Inoltre un microrganismo non sempre trae energia da questo processo → bisogna che ci siano delle fonti alternative

di C per vivere. Si parla in questo caso di cometabolimo: si deve fornire una fonte semplice di C (es. amido, zucheri

semplici) → in condizioni di laboratorio è semplice, in natura invece si usano piante che, con gli essudati radicali,

mantengono i batteri nella rizosfera. 174

Altro aspetto interessante è che i microbi nel terreno non vivono isolati, ma formano consorzi con altri microbi →

consorzi che sanno fare cose diverse sullo stesso inquinante.

Se il batterio A sa trasformare un inquinante fino a un certo punto e il batterio B sa fare le tappe successive e così via

si può avere una catena di trasformazioni che può portare anche ad una mineralizzazione completa.

Ci sono stati studi ed esperimenti a riguardo, ad es. studio di biodegradazione con batteri (→dealogenazione,

condizioni anaerobiche) e funghi (→degradazione scheletro carbonioso, condizioni aerobiche).

SINERGISMO NELLA DEGRADAZIONE DI INQUINANTI

- Interazioni in cui due o più microrganismi determinano la trasformazione di un contaminante che non può essere

condotta dalle singole specie.

- La biodegradazione condotta da una miscela di più specie è più rapida della somma della velocità delle reazioni

condotte dalle specie separatamente.

- Può coinvolgere più organismi che traggono

energia dal parziale metabolismo del composto

oppure una combinazione di co-metabolismo e

biodegradazione che produce energia.

SINERGISMO IMPORTANTE NELLA DEGRADAZIONE

DI INQUINANTI E’ QUELLO TRA PIANTE E

MICRORGANISMI DELLA RIZOSFERA

L’idea è quella di sfruttare i consorzi: RIZODEGRADAZIONE = degradazione di inquinanti da parte di consorzi di

microrganismi della rizosfera e piante (che lavorano come una catena di smontaggio) 175

Tecnica degli isotopi stabili

Utilizzo di isotopi stabili per identificare microrganismi degradatori di inquinanti organici nella rizosfera: vengono

usati questi isotopi stabili per tracciare i flussi degli elementi. Si sfrutta il fatto che tra gli isotopi stabili ci sono dei

rapporti molto stabili, conoscendo questi rapporti si può andare a vedere con dei traccianti pesanti

(somministrandoli) i flussi, i trasferimenti negli organismi e nell’ambiente.

Average Terrestrial Abundances of the Stable Isotopes of Major Elements of Interest in Ecological Studies:

Tecnica SIP (Stable Isotope Probing)

Identification of functional groups of microorganisms by Stable Isotope Probing. A great advantage of SIP is that it

does not require cultivation of soil microrganisms.

Questa tecnica consente di verificare chi utilizza che cosa: nel biorimedio consente di verificare quali microrganismi

sono utili per degradare gli inquinanti: 176

Batteri che degradano

gli inquinanti

Batteri che non degradano

gli inquinanti ( non usano il

substrato)

Studio di biodiversità Studio funzionale

Stress biotici

Causati dall’interazione con altri organismi: 177

Patogeni: causano malattie alla pianta

• Biotrofi: si nutrono di cellule vive, colonizzano le piante causando pochi danni, entrando da aperture

naturali. Formano delle strutture dette austori (HA) invaginate nella membrana → interfaccia tra pianta e

fungo. È presente un flusso unidirezionale: passaggio di nutrienti dalla pianta al fungo.

• Emibiotrofi: ad una prima fase biotrofica segue (con meccanismi ancora poco chiari) una fase necrotrofica

• Necrotrofi: aggressivi, si fanno strada degradando quello che trovano, uccidono le cellule e i tessuti che

incontrano. Hanno una batteria di enzimi con cui attaccano i tessuti vegetali.

La pianta può mettere in atto risposte diverse:

Costitutivi (equiparabile alla tolleranza, passiva)

Meccanismi di difesa Difesa basale (Immunità Innata)

Inducibili Difesa mediata da geni di Resistenza (I. adattativa) 178

Difesa basale e mediata sono collegate, costituiscono delle tappe successive dei meccanismi di difesa.

I due meccanismi di difesa inducibili sono correlati e sono il prodotto della pressione selettiva nelle interazioni

pianta-patogeno: la pianta ha un’immunità innata, quando vengono superati da un patogeno la pianta sviluppa dei

sistemi di difesa nuovi contro quel patogeno (i. inducibile) diventando così resistente per un certo periodo, finchè il

patogeno non la supera di nuovo e così via.

I meccanismi dell’Immunità innata (Innate Immunity) hanno basi comuni in piante e animali:

Nell’Immunità innata vengono

riconosciute molecole

caratteristiche dei microrganismi,

patogeni e non patogeni. Ci sono

dei recettori in grado di

riconoscere delle componenti

strutturali microbiche (PAMPs e

DAMPs) che fanno scattare una 179

difesa di tipo basale, sia che

appartengano a patogeni che no.

Questi recettori sono molto simili

in animali e in piante.

Si trovano sia sulla membrana

plasmatica che nel citoplasma

MAMPs = Microbe Associated

Molecular Patterns.

PAMPs = Pathogen Associated

Molecular Patterns.

I recettori della IMMUNITA’ INNATA sono molto simili in animali e piante:

PRR = Pattern recognition receptors (riconoscono in modo specifico i MAMPS/PAMPs)

PRR generalmente sono transmembrana, con il dominio esterno molto ricco di Leu, che rendono il recettore molto

flessibile e adattabile a MAMPs diversi. Il dominio interno invece è una chinasi, svolge il ruolo di trasduzione del

segnale (cascata di trasduzione del segnale tramite MAP chinasi), è la parte che differisce di più tra piante e animali,

nelle prime più semplice, nei secondi più complesso. MAMP/PAMP-Mediated Signalling in Animals

and Plants

La percezione dei MAMPs/PAMPs attiva una via

di trasduzione del segnale che coinvolge una

serie di fosforilazioni/defosforilazioni (MAP-

Chinasi).

La trasduzione del segnale porta all’attivazione

di geni specifici di risposta. 180

Ci sono dei recettori transmembrana e altri nel

citoplasma.

Due MAMPs si è scoperto che sono: uno lo

spezzone della flagellina e l’altro una porzione

del fattore di elongamento (sono due

componenti strutturali della cellula microbica):

riconosce la presenza di un microrganismo.

Esperimento con mutante per il recettore della flagellina 22 → la pinta diventa suscettibile ai patogeni

Mutanti di Arabidopsis privi del recettore FLS2 per la flagellina (Col-0/fls2) sono suscettibili all’infezione da parte di

un patogeno batterico 181

Immunità innata (PTI)

Due ipotesi alternative per le somiglianze in piante e animali:

- Evoluzione convergente

- Comparsa del meccanismo nel progenitore di piante e animali, e conservazione nell’evoluzione

L’immunità acquisita in piante e animali segue la stessa logica, è mediata dall’interazione di specifiche proteine (R o

Ig) con componenti batteriche (Avr o Ag) → riconoscimento specifico.

BIOCONTROLLO

Le piante possono proteggersi dai patogeni anche attraverso la stimolazione di agenti microbici di biocontrollo:

Biocontrol agents:

• attack the pathogen

• compete with the pathogen

• enhance the plant’s defenses through

induced systemic resistance (ISR)

• often have multiple effects

Immunità adattativa

Mediata da difesa mediata da geni di Resistenza (R).

Risposta specifica di una specifica pianta ospite nei

confronti di uno specifico patogeno →specificità tra

genotipo della pianta e genotipo del patogeno.

Risposta ipersensibile: risposta di difesa della pianta:

attivazione a cascata di geni difesa che porta alla

formazione di composti, come H O e acido salicilico,

2 2

che sono secondi messaggeri che attivano una 182

risposta locale (messaggeri tissutali) → numero

limitato di molecole:

2+

• Ca citosolico

• Specie radicaliche (H O , NO[→ gas

2 2

modulatore della risposta genica a bassissime

concentrazioni])

• Fitormoni (ac. salicilico)

Questa attivazione è tipica di attacchi da patogeni.

L’insieme di questi 3 composti porta all’apoptosi → effetto: terra bruciata intorno al patogeno, che non può più

espandersi. Contemporaneamente si ha deposizione di fenoli, aumento di ROS, parete ispessita → terreno

sfavorevole al patogeno. Ad un necroforo la pianta non reagisce.

Blocco dell’infezione da parte di patogeni fungini grazie a HR: 183

Interazione gene-per-gene (Flor 1942) a = allele per avirulenza

A = allele per virulenza

R = allele per resistenza

r = allele per suscettibilità

Nel tempo sono comparsi

moltissimi geni per la

resistenza e moltissimi geni per

la virulenza.

Se non c’è il riconoscimento

gene x gene → si sviluppa la

malattia. Per attivare il

meccanismo di difesa bisogna

che ci sia riconoscimento tra

pianta e patogeno.

I patogeni possono rilasciare molti fattori Avr (o effettori), e la resistenza della pianta dipende dalla presenza della

specifica proteina di Resistenza (R). Interazione Avr1- R1: 184

Evoluzione dei sistemi di difesa contro patogeni nelle piante: dalla Immunità innata alla Resistenza mediata dai

geni R (Immunità acquisita)

(1) Resistenza (PTI) meccanismo dell’immunità innata.

(2) Alcuni effettori batterici sono proteine che entrano nella cellula vegetale e bloccano la catena di trasduzione

del segnale dell’immunità innata o bloccando la risposta (Effector) → la pianta risulta sensibile.

Tutti i batteri patogeni possiedono un apparato particolare per iniettare nella cellula vegetale questi

effettori, sono strutture derivanti dai pili di coniugazione, di tipo III (usato anche da Agrobacterium

tumefaciens).

Qual è il meccanismo per i funghi e nematodi patogeni?

Funghi → c’è un interfaccia tra austorio e cellula vegetale. Anche qui gli effettori riescono a entrare nella

cellula.

Nematodi → hanno uno stiletto macroscopico con la stessa funzione.

(3) Dopo la comparsa dell’effettore è comparsa la proteina R (nei genotipi resistenti ai patogeni), che è in grado

di riconoscere la modifica che l’effettore causa nella cellula. Questa proteina può anche trovarsi come 185

recettore libero nel citoplasma. Se gli effettori sono pochi l’immunità basale viene ripristinata: si va ad

innescare un’altra difesa (ETR) che coinvolge anche la risposta ipersensibile.

Evoluzione dei sistemi di difesa contro patogeni nelle piante: dalla immunità innata alla resistenza mediata dai

geni R:

Evolution of the plant–bacterial pathogen interaction.

(a) The plant has evolved receptors to sense pathogen associated molecular patterns (PAMPs) that trigger basal

defences.

(b)The bacterium injects effector proteins into the plant cell via a type III secretion system (TTSS) to interfere with

defence signalling or response.

(c)The plant responds to infection by the generation of immune receptors encoding nucleotide-binding (NB),

mitogen-associated protein kinase (MAPK), leucine-rich-repeat (LRR) R-proteins that recognize effectors and trigger

an acute defence response usually involving cell death.

Un sistema di secrezione batterico (T3SS=Type 3 Secretion System) inietta gli effettori nel citoplasma della cellula

vegetale 186

Ingresso degli effettori prodotti da diversi patogeni nella cellula vegetale:

Molti effettori sono enzimi proteolitici o proteine che bloccano la cascata di trasduzione che porta all’attivazione di

geni di difesa.

http://www.scoop.it/t/host-translocation-of-plant-pathogen-effectors

Sono stati recentemente scoperti altri effettori prodotti da patogeni possono modulare le risposte dell’ospite in

modo diverso: sono in grado di manipolare i flussi degli zuccheri nella pianta (patogeni fogliari): regolano i geni

SWEET (deputati alla regolazione del flusso degli zuccheri, passaggio apoplastico verso il floema). Questi patogeni

manipolano il sistema di efflusso del saccarosio (vivono nell’apoplasto) aumentandolo → aumenta il numero di

trasportatori sulla membrana: esce molto più zucchero di quello che avviene normalmente. 187

Effettori prodotti da diversi patogeni inducono la trascrizione di geni SWEET nella pianta:

Evoluzione del sistema pianta – patogeno: Il modello della “Regina Rossa” 188

In this scheme, the ultimate amplitude of disease resistance or susceptibility is proportional to [PTI – ETS + ETI]. In

phase 1, plants detect microbial/pathogen-associated molecular patterns (MAMPs/PAMPs, red diamonds) via PRRs

to trigger PAMP-triggered immunity (PTI). In phase 2, successful pathogens deliver effectors that interfere with PTI,

or otherwise enable pathogen nutrition and dispersal, resulting in effector-triggered susceptibility (ETS). In phase 3,

one effector (indicated in red) is recognized by an NB-LRR protein, activating effector-triggered immunity (ETI), an

amplified version of PTI that often passes a threshold for induction of hypersensitive cell death (HR). In phase 4,

pathogen isolates are selected that have lost the red effector, and perhaps gained new effectors through horizontal

gene flow (in blue)—these can help pathogens to suppress ETI. Selection favors new plant NB-LRR alleles that can

recognize one of the newly acquired effectors, resulting again in ETI.

Qui avviene la pressione selettiva sul patogeno, che svilupperà varietà nuove in grado di sfuggire al riconoscimento

→ ciclo continuo che oscilla tra suscettibilità e resistenza.

In agraria, i patogeni hanno sulle monoculture un effetto devastante, in natura invece essendoci più biodiversità c’è

più resistenza. Nelle interazioni ospite-patogeno, la frequenza

degli alleli R nella popolazione dell’ospite è

correlato con quella del corrispondente

effettore (E=Avr) nel patogeno.

A pathogen carries an effector gene (E1) that is

recognized by a rare R1 allele (top). This results

in selection for an elevated frequency of R1 in

the population. Pathogens in which the effector

is mutated are then selected, because they can

grow on R1-containing plants (right). R1

effectiveness erodes, and, because at least

some R genes have associated fitness costs,

plants carrying R1 can have reduced fitness

(bottom), resulting in reduced R1 frequencies.

The pathogen population will still contain

individuals with E1. In the absence of R1, E1 will

confer increased fitness, and its frequency in

the population will increase (left). This will lead

to resumption of selection for R1 (top). In

populations of plants and pathogens, this cycle is continuously turning, with scores of effectors and many alleles at

various R loci in play.

Stress biotico: predatori (larve di insetti fitofagi)

Si tratta di un problema sia diretto (→riduzione area fogliare con

conseguente diminuzione della resa) che indiretto (→ferite

vulnerabili all’attacco di patogeni) per l’agricoltura.

Danni prodotti dagli insetti:

 Durante la crescita delle piante e dopo la raccolta

 Per la maggior parte controllati con l’uso di insetticidi, che

presentano problemi: 189

o –Per la mancanza di specificità

o –Per l’inquinamento ambientale

o –Per i costi

La pianta mette in atto:

 Difese dirette

 Difese indirette

Ma in agricoltura c’è l’intervento dell’uomo con pesticidi e insetticidi.

DIFESE DIRETTE

Sono di tipo fisico (spine, tricomi…) e chimico:

 Sostanze che rendono meno appetibile la pianta es. fenoli, tannini

 Sostanze tossiche Es. cumarine, glucosidi cianogeni, inibitori di proteasi

 Sostanze repellenti es. composti volatili (olii essenziali, VOCs)

DIFESE INDIRETTE

Comprendono l’interazione con microrganismi, ad es. Bacillus thuringiensis, è batterio Gram positivo scoperto nel

1901, in Cina come agente di moria del baco da seta. E’ un microrganismo ubiquitario e sporigeno (in condizioni

avverse forma all’interno della cellula una spora, che è una struttura di resistenza che si ritrasformerà in cellula

vegetativa una volta che le condizioni esterne sono di nuovo favorevoli), produce una protossina proteica alcalinacon

funzione antinutrizionale che rilascia in forma cristallina.

Dopo la sua scoperta B.t. è stato studiato ampiamente come agente di controllo, è

uno dei pochi prodotti consentiti in agricoltura biologica.

Vantaggi:

 È molto specifico rispetto agli insetticidi

 Ha una breve persistenza nell’ambiente

siccome viene facilmente degradato dai raggi UV

 Consentito in agricoltura biologica 190

Svantaggi:

 Ha un costo elevato

 Degradato velocemente → ha bisogno di più applicazioni

 È attivo solo se ingerito dell’insetto (required full coverage of the plant)

Il pesticida “biologico” più ampiamente utilizzato da circa 50 anni, copre il 2% del

mercato globale degli insetticidi nel 1995. È “nemico naturale”di molti insetti,

usato ampiamente contro zanzare e mosche.

Modo di azione delle tossine di Bacillus thuringiensis:

di per sé il cristallo non è tossico, lo diventa nell’apparato digerente

dell’insetto: una volta ingerito il cristallo si trova in un ambiente

alcalino che ne permette la solubilizzazione nelle singole protossine,

dopo di che si trasforma in tossina ad opera delle proteasi specifiche

presenti nell’apparato digerente dell’insetto (che sono assenti in uomo

e animali, che inoltre, non avendo un ambiente alcalino nell’apparato

digerente, non ne permettono la solubilizzazione).

La tossina agisce inserendosi nella membrana delle cellule epiteliali

dell’intestino creando un canale ionico. Ciò determina un’alterazione

dei flussi ionici e quindi la lisi delle cellule epiteliali. L’insetto smette di

mangiare e si disidrata. Inoltre si ha proliferazione del batterio e

conseguente morte per setticemia. 191

Si tratta di un meccansmo molto selettivo.

Le endotossine (70-130 kDa) sono codificate dai geni cry (da crystal), di cui ci sono varie forme (conosciute circa 400

varianti di cry) con target diversi:

La tossina è una proteina composta da 3 domini:

i tre domini della tossina attiva sono conservati nelle diverse classi:

 dominio I: consente il passaggio attraverso la membrana

dell’epitelio intestinale (forma il poro vero e proprio), ed è il più conservato

 dominio II: riconoscimento del recettore

 dominio III: legame con il recettore

Aumento delle difese dirette delle piante mediante ingegneria genetica

Si è provato ad inserire questo gene direttamente nelle piante a scopo applicativo

(difesa diretta), perché produca la protossina:

Primo esperimento → Inserire il gene per la proteina Bt in piante di mais in modo

che la pianta sia costantemente protetta dall’attacco degli insetti. Risultati:

 Bt Crops

– Gene inserted 1991 into corn, potato, cotton, soybean.

– 1996, field use of Bt crops (solo 5 anni dalla sperimentazione in laboratorio, ma

non in Europa!) 192

• Advantage

– Only insects that attack crop are affected → non c’è bisogno di distribuire il

biopesticida in tutto il campo, ma è espresso ed è efficacie solo sulle piante.

– All parts of the plant produce the toxin, e non è necessario ripetere i

trattamenti.

• Disadvantage

– Strong selection for resistance to the toxins. Requires crop-

management strategies. (ma ciò vale per tutte le monocolture)

– All parts of the plant produce the toxin.

Negli USA le grandi aziende private hanno subito capito la portata di questi studi e hanno proseguito questa strada (a

sfavore degli enti pubblici) utilizzando diverse colture, dapprima non di interesse alimentare e poi anche quelle.

Cotone transgenico produttore di Bt Circa l’85% del cotone coltivato in USA è transgenico 193

La maggior parte del cotone coltivato in USA è geneticamente trasformato: Trasformazione anche di

altre piante di uso agrario

(es. mais)

HT = herbicide tolerant

(glifosato)

Bt = expressing Bt toxin

Di solito sono le ditte che

vendono glifosato che

vendono anche le piante

trasformate tolleranti.

Altro vantaggio mais Bt → permette il controllo sulla piralide a su altri patogeni che si insediano nelle parti ferite

della pianta, proprio perché esprimono la tossina cry in tutte le sue parti. Ciò è vantaggio notevole nel caso di

patogeni fungini che producono e rilasciano micotossine con vari effetti negativi sull’uomo e gli animale che

mangeranno quella pianta (scoperto da una moria di uccelli nutriti con arachidi avariate).

Ad es. tra queste micotossine ci sono le aflatossine, cancerogene e difficili da debellare perché termostabili. Sono

prodotte da funghi saprotrofi che si nutrono di substrati di tipo oleoso.

Quindi le piante Bt hanno un “effetto collaterale”: producendo la tossina cry in tutta la pianta, avrà danni minori ai

tessuti da parte di insetti e così un minor rischio di attacco da parte di saprotrofi fungini. 194

OGM

L’uso delle piante OGM è nato dall’esigenza di rispondere ai problemi dell’agricoltura = sfamare una popolazione

umana sempre crescente mantenendo però la qualità ambientale.

→ a patto che ci sia un’elevata quantità di nutrienti 195

L’esigenza è quella di ottenere sempre nuove varietà con caratteristiche di interesse, soprattutto la resistenza ai

patogeni emergenti (oscillazione tra resistenza e suscettibilità).

Tradizionale = breeding

Miglioramento Genetico = piante trasformate

Tradizionale (breeding) 1. Selezione varietà con tratti di interesse (di solito una è quella già

in uso, con buone caratteristiche di crescita, produttività ecc, e

l’altra è quella con il carattere desiderato)

2. Incroci con varietà della stessa specie (o specie compatibile

sessualmente) di uso agrario

3. Selezione artificiale della progenie (necessari molti cicli

riproduttivi)

È il metodo più utilizzato (da 10.000 anni), è più lento ed è casuale. Il

problema principale è che quel carattere desiderato dobbiamo già

averlo in natura da qualche parte: (1) lo si può cercare in natura (uno

dei motivi per cui è importante salvaguardare la biodiversità),

oppure (2) si possono ottenere nuove caratteristiche tramite

processi di mutagenesi fisica o chimica (radiazioni o agenti mutageni)

→ molte cultivar usate oggi sono state fatte così, si usa ancora molto in India. In alternativa (3) si possono ottenere

nuove caratteristiche da incroci tra specie diverse, ad es. triticale (incrocio tra Triticum e segale): fenomeno di

ibridazione, attraverso la poliploidizzazione indotta (con colchicina, che interrompe la migrazione dei cromosomi

durante la meiosi). A volte così si ottengono cultivar pericolose, ad es. un sedano rapa con proprietà fototossiche.

Il miglioramento genetico tradizionale opera una selezione artificiale sulla progenie che deriva da incroci: 196

NB: La selezione artificiale seleziona caratteri di interesse, non la sopravvivenza in condizioni naturali!

Da dove possono derivare tratti di interesse per il miglioramento genetico?

• Intense ricerche per selezionare varietà ad alta resa

• Esteso impiego di fertilizzanti chimici e fitofarmaci

Le sfide della ricerca in agricoltura oggi:

• Aumentare la produttività agricola per ettaro

• Ridurre l’uso della chimica in agricoltura

• Ridurre i costi di coltivazione

• Salvaguardare la biodiversità naturale

Ingegneria genetica

Non è basata sulla compatibilità sessuale, si prende il gene di interesse (da qualsiasi organismo) e lo si inserisce nella

pianta, che diventa trasformata. È una tecnica precisa, tracciabile, mirata (maggior controllo) e veloce. In un anno si

ottiene la nuova cultivar. Il problema è che è meno accettata. 197

Procedura:

1. Varietà con tratti di interesse

2. Identificazione del gene responsabile

3. Inserimento del gene in varietà della stessa o di altre specie di uso agrario (anche non compatibili sessualmente)

4. Selezione diretta dei trasformanti (transgene espresso e trasferito alla progenie)

Confronto tra le due modalità di miglioramento genetico:

Breeding tradizionale Ingegneria genetica

La pianta che si ottiene è identica alla pianta di partenza,

Assortimento dei caratteri e selezione successiva dei ad eccezione del carattere inserito (e del vettore di

caratteri di interesse nella progenie trasformazione)

Agrobacterium tumefaciens: un ingegnere genetico naturale

Il gene viene inserito sfruttando un vettore di trasformazione naturale: Agrobacterium tumefciens, che possiede un

plasmide che inietta nella pianta (tramite una struttura di tipo III), e che riprogramma le cellule infettate

costringendole a sintetizzare opine, molecole peptido-saccaridiche che la pianta non è in grado di utilizzare e che

quindi rilascia all’esterno, dove altri A.t. le usano come nutrimento. Agrobacterium tumefaciens (A.t.) è un

batterio del suolo che causa il tumore del

colletto in molte specie vegetali.

Il citoplasma di A.tumefaciens contiene

due tipi di DNA: un cromosoma e un

plasmide (plasmide Ti). Il plasmide

contiene una regione, T-DNA, che codifica

proteine responsabili della sintesi di

ormoni vegetali e di opine (derivati di

amino acidi utilizzati dal batterio come 198

fonte di C e N).

Il T-DNA viene trasferito dal batterio al

nucleo della cellula vegetale, dove viene

integrato a livello dei cromosomi.

I geni di A. tumefaciens presenti sul T-

DNA possono essere sostituiti con

qualunque gene di interesse, l’importante

è mantenere le zone a fianco del DNA T

(left bord e right bord) che servono per

l’integrazione e il riconoscimento della

sequenza.

Per facilitare la manipolazione del vettore

di trasformazione, alcune funzioni (geni

vir) sono spostate su un plasmide

separato (vettore binario).

Grazie alla capacità di rigenerazione delle piante, da un unico evento di trasformazione si può ottenere un numero

illimitato di individui.

Ci sono alcune specie vegetali rispondono meglio a questo procedimento e altre peggio. Agrobacterium è in

assoluto il metodo

più efficiente per

inserire un gene

esogeno nel genoma

NUCLEARE di una

pianta.

Ci sono poi altri due

metodi per

trasformare le

piante: il metodo

balistico e

transplantomica.

Il metodo balistico:

pistola a pressione

con microproiettili

con il gene di

interesse che

vengono sparati sulla

foglia, ed entrano nel

nucleo (alcuni). Ha

una bassa efficienza. 199

In Europa c’è una zona minima coltivata a OGM, per lo più sono campi sperimentali.

L’uso degli OGM nel mondo è però in crescita.

Piante OGM coltivate nel mondo:

Le multinazionale hanno un grosso peso in questo campo.

Principali caratteri agronomici ingegnerizzabili nei vegetali: 200

Il problema degli OGM di prima generazione è che si è privilegiato unicamente l’interesse del distributore (ridurre i

costi dell’agricoltore), è stato un errore strategico, il consumatore non vedeva nessun vantaggio nel consumare un

prodotto OGM, dubbi sulla sicurezza.

Es. pomodoro cv flavour saver → caratteristica OGM è che è privo di una liasi che porta alla marcescenza.

Con le piante OGM di seconda e terza generazione invece si prende in considerazione l’interessedel consumatore,

arricchendo il prodotto (es. biofortificazione).

Come per le interazioni antagoniste naturali, anche nel caso di interazioni con piante OGM possono svilupparsi

fenomeni di resistenza (es. patogeni e insetti): 201

Le soluzioni sono:

• Produrre nuove cultivar resistenti → irrealizzabile, processo

lungo

• Gestione tramite “zone rifugio”:

o Riduzione della pressione selettiva

o Mantenimento della biodiversità

Accanto all’area coltivata con la varietà transgenica che produce

un’alta dose di proteina Bt, vengono create “aree rifugio” coltivate

con varietà non transgeniche.

Solo insetti rr, resistenti omozigoti (molto rari), possono tollerare

elevati livelli di Bt. Nelle zone rifugio si sviluppano insetti suscettibili, che rallenta l’insorgere di resistenza.

Questo discorso vale per tutte le monocolture, inoltre questo sistema

mantiene la biodiversità. 202

Biofortificazione

Vaccini alimentari (edible plant vaccines)

• Specie più utilizzate: Patata, pomodoro, banana, lattuga, carote, arachidi, soia

• Malattie: Epatite B, diarree (da batteri e virus), rabbia, carie dentale

(Streptococcus mutans), diabete, HIV, etc

• Test clinici: Il primo in USA nel 1997

Principio vaccini alimentari: assorbimento di peptidi (determinanti del patogeno)

attraverso il tratto digerente, che immunizzano l’organismo. Vantaggi: non c’è bisogno di

personale paramedico né di strumentazione particolare, facile somministrazione.

È stata dimostrata una certa efficacia.

Problematiche relative all’uso di piante OGM

1. Preoccupazione per la salute

a. Effetti nocivi sulla salute umana (es. tumori, allergie)

b. Effetti nocivi indiretti dei marcatori di selezione (es. resistenza antibiotici)

2. Preoccupazione per la salvaguardia della diversità naturale

a. Effetti collaterali su specie non-target

b. Dispersione del transgene

3. Preoccupazione per gli aspetti socio-economici

1. Preoccupazione per la salute

Riguarda la preoccupazione sulla natura del prodotto in sé, considerato innaturale.

Dal punto di vista della salute non dovrebbero esseri preoccupazioni: queste piante sono sottoposte a vari controlli

→ piante OGM sono più sicure delle altre piante, che invece non sono controllate.

I controlli sulle piante OGM: Per la prima volta nella storia dell’agricoltura, tutte le piante sono controllate per

assenza di effetti sulla salute umana, sull’ambiente e sulla biodiversità prima di ricevere il permesso di coltivazione,

analoghi controlli non sono previsti per nuove varietà ottenute con le tecniche tradizionali.

Problema dei marker di selezione:

sono dei geni i resistenza agli antibiotici che vengono inseriti insieme al gene di interesse nella pianta al fine di

selezionare le piante in cui la trasformazione è avvenuta. Nella procedura di trasformazione si ha una certa

efficienza, bisogna selezionare le piante trasformate e scartare le altre.

Questi marker di selezione possono essere di geni di resistenza ad antibiotici, facendo crescere le piante su un

terreno con antibiotici verranno selezionate quindi le piante trasformate, con questo gene di resistenza.

Il problema è che quando mangiamo queste piante ingeriamo anche questo DNA che, all’interno del nostro

intestino, entra in contatto con la flora batterica e

può succedere che venga integrato da uno di

questi batteri, potenzialmente patogeno. 203

MA:

noi mangiamo continuamente DNA, ma non

succede quasi mai che la flora acquisisca parti di

questo DNA. Inoltre i promotori del gene marker

sono di tipo eucariotico e pertanto i batteri non lo

riconoscono. In più i geni vengono integrati per

analogia, se quel gene non c’entra nulla con i geni

presenti nel batterio difficilmente verrà integrato.

L’abuso che si fa degli antibiotici crea molta più

resistenza!

Non ci sono dati a favore di un trasferimento di

marcatori di selezione a batteri della flora

intestinale (....promotore eucariote con

Agrobacterium). Inoltre, la resistenza ad antibiotici

è già ampiamente diffusa per l’uso elevato di

antibiotici in terapia.

Soluzione → Sviluppo di piante

con nuovi marcatori di selezione,

o privi di marcatori:

2. Preoccupazione per la salvaguardia della diversità naturale

Gli studi dicono che il suolo ha un effetto tampone 204

Caso farfalla monarca:

sono stati fatti esperimenti con varie cultivar Bt e si è osservata in alcuni casi una riduzione della vitalità del 50% →

ma queste condizioni non erano naturali, inoltre solo due cultivar Bt sono risultate problematiche e quindi tolte dal

commercio.

Non è la tecnologia di per sé il problema, ma i diversi costrutti!

Dispersione del transgene:

Possibilità che il transgene si diffonda nell’ambiente naturale attraverso cross-ibridazione con specie selvatiche.

• Dipende dalla presenza di specie sessualmente compatibili

• Dipende dal vantaggio selettivo che può dare il transgene nelle condizioni naturali → Alternativa della

transplantomica (trasformazione dei cloroplasti). Per alcune specie il problema non si

pone, ad es. mais → non ha parenti

vicini (in Europa) con cui potrebbe

incrociarsi. 205

Le cultivar agrarie non possono

colonizzare gli ambienti naturali:

sono selezionate per ambienti

antropici.

Per altre specie il problema c’è, es.

colza → ha dei parenti prossimi in

Europa. Sono state sviluppate quindi

tecniche alternative di

trasformazione genetica :

TRANSPLANTOMICA =

trasformazione del cloroplasto:

- ci sono molti cloroplasti

nella cellula vegetale, che all’interno

hanno più copie geniche → si può

avere un’espressione molto

superiore (effetto di amplificazione)

- specie di interesse agrario → i plastidi presenti nel polline non partecipano alla formazione dello zigote: non

può trasmettere il transgene alla progenie (plastidi trasmessi per eredità materna) → viene impedita la

dispersione tramite polline.

- Accorgimenti sulla superficie di coltivazione (uso di piante tampone intorno al campo OGM). 206

Per la transplantomica non si può usare A.t. perché invia il DNA esclusivamente al nucleo. Per trasformare il

cloroplasto si può usare solo la balistica (molto difficile). Dopo la trasformazione bisogna fare dei passaggi per

favorire la duplicazione dei cloroplasti trasformati, su un terreno molo selettivo per le cellule trasformate.

Da qui è nata l’esigenza di trovare marker alternativi ai geni di resistenza agli antibiotici: sarebbe inserito in un gene

di tipo procariotico, che potrebbe facilmente integrarsi in un batterio della flora batterica.

3. Preoccupazione per gli aspetti socio-economici

Problema più grosso.

In laboratorio sono stati creati degli ibridi sterili in modo da legare l’agricoltore alla ditta che vende sementi → non

ha nulla a che vedere con gli OGM, ma stessa

logica.

Caso Golden rice

OGM di seconda generazione, arricchito di

vitamina A per combatterne la carenza (inseriti 207

3 geni per la sintesi di carotenoidi, presi dal

narciso → “narciriso”).

Fatto nl pubblico, brevettato non per lucro.

Possibilità di riprodurlo per seme (con

trasmissione del carattere).

Il prodotto non è ancora sul mercato (son

passati 15 anni) non ci sono soldi sufficienti per

i controlli farmaceutici (che di solito possono

permettersi solo le aziende private). Modulo Prof.ssa Bonfante

Il mondo delle micorrize 1

O. Mattirolo, 1908 B. Peyronel, 1920 Tecniche moderne

“Sotto la superficie della terra , una comunità influente di microbi si confonde con le radici delle piante”.

Plant Microbes and Plant Health:

 Microrganismi patogeni e benefici

 Microrganismi promotori della crescita

 Metaboliti ed ormoni

 Nutrienti (N,P,Fe,C)

 Maggior resistenza a stress abiotici e biotici

Oggi, grazie alle nuove tecnologie di sequenziamento genico (NGS), abbiamo la possibilità di studiare i microrganismi

non coltivabili. Prima si conoscevano solo quelli coltivabili, che però rappresentano una porzione molto ridotta della

biodiversità totale.

Craig Venter ha gettato le basi per lo studio del non coltivabile. Tutto il DNA presente nel substrato campionato

viene sequenziato e analizzato selezionando un tipo di organismo (Archea, funghi…).

John Craig Venter (Salt Lake City, 14 ottobre 1946) è un biologo statunitense, noto per aver sfidato il Progetto

Genoma Umano nella corsa al sequenziamento del genoma.

Ha iniziato la sua carriera accademica presso il College of San Mateo in California. Fu poi arruolato nella Marina degli

Stati Uniti e inviato in Vietnam dove svolse il ruolo di infermiere militare. Al ritorno, ricevette la laurea in biochimica

nel 1972 ed il dottorato di ricerca in fisiologia e farmacologia nel 1975 presso l'Università della California di San

Diego. A San Diego sposa la dottoranda Barbara Rae. Dopo aver lavorato come professore all'Università di Buffalo, fu

assunto nei National Institutes of Health nel 1984. A Buffalo divorzia da Barbara Rae per sposare la studentessa

Claire M. Fraser. Il loro matrimonio durò fino al 2005.

Nel periodo trascorso nel NIH, Venter imparò una specifica tecnica per identificare rapidamente tutti gli RNA

presenti in una cellula e la utilizzò per identificare i geni espressi nel cervello umano. Le brevi sequenze di DNA

complementare (cDNA) utilizzate in questa tecnica sono state chiamate expressed sequence tags (ESTs, dall'inglese

marcatori di sequenze espresse) da Anthony Kerlavage, del TIGR (The Institute for Genomic Research). Craig Venter

chiese in quel periodo di poter brevettare tali sequenze, permesso che, al termine di un procedimento controverso,

gli fu negato.

Nel 2010 ha pubblicato un articolo su Science in cui annuncia di avere costruito in laboratorio la prima cellula

artificiale, controllata da un DNA sintetico e in grado di dividersi e moltiplicarsi proprio come qualsiasi altra cellula

vivente.

Tuttavia si ricordi che l'accezione di "sintesi" per quanto riguarda la cellula "sintetica" di Venter è del tutto

inadeguata: Craig Venter svuotò il nucleo di una cellula e vi pose del materiale genetico sintetizzato ex novo. Venter

stesso quindi utilizzò una cellula d'origine svuotata del proprio DNA, ma non sintetizzò chimicamente ex novo la

membrana della cellula, il citoplasma, gli organelli fondamentali, ecc. Per tale ragione, dire che Craig Venter ha

"sintetizzato la vita" è qualcosa di inadeguato ed errato.

NGS (Next Generation Sequencing)

https://youtu.be/HMyCqWhwB8E

http://www.roche.it/home/roche-in-italia/diagnostics/prodotti/next-generation-seq.html

http://www.nature.com/jid/journal/v133/n8/pdf/jid2013248a.pdf

Origine della simbiosi 2

I cloroplasti hanno avuto origine dai cianobatteri e i mitocondri dai proteobatteri. Entrambi questi organelli hanno

conservato la loro biochimica procariotica, ma il loro genoma si è ridotto, e la maggior parte delle proteine di questi

organelli è codificata nel nucleo (→ geni in parte migrati nel genoma nucleare). La teoria endosimbiontica ipotizza

che i geni batterici nel genoma eucariotica sono entrati nella linea eucariotica tramite organelli ancestrali. Ciò

predice l’influsso episodico dei geni batterici nella linea eucariota, con l’acquisizione corrispondente agli eventi di

endosimbiosi. Le sequenze del genoma eucariotico, ciò nonostante, implicano sempre più un trasferimento genico

orizzontale, sia da procarioti ad eucarioti che tra eucarioti, come fonte di diversità genica nel genoma eucariotico,

che predice una continua, linea-specifica acquisizione di geni procariotici nei gruppi eucarioti divergenti. Ora

possiamo discriminare tra queste due alternative tramite il clustering e le analisi filogenetiche delle famiglie geniche

eucariote che hanno omologhi tra i procarioti. I nostri risultati indicano che (1) il trasferimento genico dai batteri ai

procarioti è sporadico, come rivelato dalla distribuzione genica, e coincide con le maggiori transizioni evolutive

all’origine dei cloroplasti e dei mitocondri; (2) che la trasmissione genica negli eucarioti è verticale, come rivelato da

comparazioni topologiche estese, rare distribuzioni geniche derivanti da perdite differenziali; e (3) che un continuo,

linea-specifico trasferimento genico orizzontale, nonostante qualche volta avvenga, non contribuisca all’evoluzione a

lungo termine del contenuto genico nel genoma degli eucarioti. Science 31 October 2014

532, vol 346

È presente una base genetica molto forte per l’interazione con altri organismi: SYM Pathway, idea del pre-

adattamento genetico per l’interazione con altri organismi, ma in realtà non è così vero!

Nuovo concetto: importanza delle condizioni ambientali. Ad es. Saccharomyces cerevisiae e Chlamydomonas

reinhardtii → in condizioni ambientali adatte i due creano un ciclo chiuso, interagiscono, non solo metabolicamente.

Dalla loro interazione diventano autosufficienti e proliferano. Analogamente avviene con funghi filamentosi al posto

di S. cerevisiae.

Alghe appartenenti all’ordine Charales sono le basi delle piante terrestri, hanno già i geni alla base delle interazioni.

Niche engineering demonstrates a latent capacity for fungal-algal mutualism Erik F. Y. Hom Andrew W. Murray:

Le simbiosi mutualistiche modellano l’evoluzione delle specie e degli ecosistemi e catalizzano l’emergere di nuova

complessità biologica, ciò nonostante come queste simbiosi si instaurino non è ancora chiaro. È dimostrato che il

mutualismo obbligato tra il lievito S. cerevisiae e l’alga Chlamydomonas reinhardtii, due eucarioti modelli con life

histories molto diverse, può sorgere spontaneamente in un ambiente che richiede uno scambio reciproco di C e N.

Questa capacità di instaurare associazioni è filogeneticamente ampia, e si estende ad altri Chlamydomonas e ad altri

funghi. Inoltre si assiste all’associazione spontanea di cellule algali di Chlamydomonas con funghi filamentosi. Queste

osservazioni dimostrano che, sotto condizioni specifiche, cambiamenti ambientali possono indurre specie free-living

a diventare mutualisti obbligati e stabilisce una serie di sistemi sintetici sperimentalmente controllabili,

filogeneticamente correlati, per lo studio dell'evoluzione delle simbiosi. 3

Microbes: Not only Prokaryotes I funghi hanno un ruolo cruciale come microbi sia simbionti che patogeni.

I funghi micorrizici sono rappresentati da circa 6.000 specie fungine,

coinvolgono il 95% delle piante. È impossibile studiare l’ecologia delle piante

senza tener conto delle micorrize.

Maggiore è la biodiversità, tanto più sono presenti le micorrize. 4

“Effetto crescita” → È visibile a livello sistemico, la pianta inoculata cresce meglio, maggior biomassa. Simbionti =

biofertilizzanti, nutrizione minerale + effetto bioprotettivo contro i patogeni (biopesticidi), grazie all’”effetto

priming” che innalza il livello di difesa della pianta.

La radice micorrizzata trattiene molto di più il suolo, determina una certa tessitura del terreno.

Micorrize:

 Ectomicorrize → circa il 3%

 Endomicorrize → circa l’80% delle piante

terrestri o Micorrize arbuscolari

o Ericodi

o Micorrize delle orchidee

Distribution of fungi and plants in mycorrhizal symbioses: 5

Funghi micorrizici: funghi che barattano i nutrienti del suolo per il carbonio

Hanno un ruolo chiave nel sostenere la

crescita della pianta, ricevono risorse

organiche dalla pianta (scambio di

nutrienti) → questa caratteristica può

essere sfruttata in agricoltura per

aumentare la produttività dei coltivi.

[Alimenti che sostengono l’umanità =

riso, grano, mais, soia].

Nel mondo il principale fattore limitante

è la carenza di nutrienti minerali →

ricadute enormi dal punto di vista

economico.

Africa: il primo fattore limitante della produttività del mais è la bassa disponibilità di nutrienti 6

Pi → si estrae in alcune zone (es. Marocco), ma non è una risorsa rinnovabile. Il Pi è poco mobile, man mano che la

pianta cresce si crea una zona di deplezione. I funghi si estendono al di là della zona di deplezione, esplorano un’area

molto maggiore e quindi sono più efficienti dei peli radicali, possono aumentare di molto la produttività.

Queste micorrize sono sempre mutualiste? 7

Because of its low

solubility, phosphate

near the root is rapidly

depleted.

Mycorrhizal fungi

extend farther into the

soil, greatly enhancing

phosphate

assimilation.

La stessa interazione potrebbe

appartenere a diverse

categorie di interazioni

dipendentemente da:

 Tempo

 Condizioni ambientali

Come studiare le micorrize in

questo contesto?

Teoria del mercato biologico

(Quali sono le condizioni generali in cui si instaura un meccanismo di interazione tra piante e funghi?) 8

Risultato: sia la pianta che il fungo sono in grado di discriminare il partner migliore, ricompensandolo.

La pianta nel terreno riconosce il partner buono e quello cattivo, che non fornisce abbastanza substrato.

Le piante hanno mantenuto questo tipo di interazione mutualista. Ci sono anche partner cattivi, che però non hanno

successo perché non soddisfano le condizioni di mutualismo.

Le piante e le loro simbionti fungini micorrizici arbuscolari interagiscono in complesse reti sotterranee che

coinvolgono più partner. Ciò aumenta il potenziale di sfruttamento e di defezione da parte di individui , sollevando la

questione di come i partner mantengano un equo trasferimento bidirezionale di risorse. Abbiamo manipolato la

cooperazione nelle piante e nei funghi partner per dimostrare che le piante sono in grado di rilevare, discriminare e

premiare i migliori partner fungini con più carboidrati . A loro volta, i partner fungini aumentano il trasferimento dei

nutrienti solo a quelle radici che forniscono più carboidrati. Sulla base di queste osservazioni si può concludere che, a

differenza di molti altri mutualismi, il simbionte non può essere considerato "schiavo". Piuttosto il mutualismo è

evolutivamente stabile perché il controllo è bidirezionale , e partner che offrono il miglior tasso di cambio vengono

premiati.

Altro esperimento: David Read 1976

I benefici per l’ospite cambiano in relazione alle condizioni ambientali 9

In condizioni di bassa fertilizzazione ambientale le micorrize sono un sistema efficiente, altrimenti no.

Focus sul Pomodoro: A flag for the mediterranean food, A model organism for plant biology

I frutti del Pomodoro rispondono ai funghi AM? Le bacche sono influenzate dalla micorrizzazione?

Risposta: Sì (dopo 2-3 mesi)

Nella stagione di crescita non si può non fertilizzare (questione delle cultivar selezionate). 10

But what is happening

whether we have to wait for

longer time to allow

fructification?

Aim of the work: To detect the

potential effect of AM fungi on

the transcriptome of tomato

Moneymaker cv after

colonization with the AMF

Funnelliformis mosseae 11

Control-fertilized and AM-plants: a comparable growth

In AM plants biomass and fruiting are comparable to that of the non mycorrhizal fertilized plants.

Risultato: la micorrizzazione consente una bassa fertilizzazione.

The fruit phosphorus concentration:

Una conclusione:

 Forte interazione tra genotipo pianta/fungo/ ambiente

 Variazioni a seconda dell’organo considerato

 Variazione a seconda di ambiente e tempo

LEZIONE BERRUTI – Arbuscular Mycorrhizal Fungi

I funghi micorrizici c’erano prima della comparsa

delle piante. Fanno tutti parte del phylum

Glomeromycota, ma ci sono ancora poche

informazioni dal punto di vista genetico.

- “mycorrhiza” from greek mykes & rhiza

- Obligate plant root symbionts

- mutual benefit exchange

- 80-90% plant families are potential hosts 12

Oehl et al. (2011):

5 orders, 14 families, 29 genera

Krüger et al. (2012)

4 orders, 10 families, 19/20 genera

 about 250 well-described morphotypes

 about 350 MOLECULARLY WELL-DESCRIBED TAXA La spora nel suolo germina in direzione della radice,

una volta in prossimità della radice comincia a

formare ife, si infiltra nell’epidermide e colonizza il

parenchima corticale, dove forma un arbuscolo →

massima superficie di scambio. L’ifa non penetra mai

nella membrana cellulare della cellula vegetale.

Periarbuscolar space → qui avviene lo scambio dei

sintetati. 13

20% dei prodotti della fotosintesi

Il fungo deposita i nutrienti sotto forma di gocce di grassi. Le ife sono molto più efficienti e abili nell’esplorare il

suolo. Le spore vengono prodotte (a grappolo) sia nel suolo che nella radice. Altri vantaggi:

1. protezione dai patogeni

- per competizione

- complex acquired

protection system → sistema del

fungo simile all’infezione dei

patogeni (SAR = Systemic Acquired

Resistance)

2. migliorano l’aggregazione del 14

suolo:

glomaline, glomain-related proteins;

anti-erosione, avviluppa le particelle

del suolo.

Tanti altri vantaggi indiretti:

- aumento tolleranza

agli stress e ai metalli pesanti (→

phyitoremediation)

- maggior biomassa.

Le specie fungine native se inoculate

portano un miglioramento. 15

Benefici per la pianta: 16

AMF DIVERSITY

I AMF hanno una colonizzazione meno specifica, ma non è detto che diano il massimo risultato con tutte le specie.

La diversità genetica e morfologica corrisponde a diversità nei tratti funzionali (ad es. un fungo può essere utile per

fornire P e un altro per il recupero dei metalli pesanti).

Può esserci più di una colonizzazione da parte di diversi funghi nella stessa pianta ospite.

Famiglia Glomeracee → tipo di colonizzazione e

crescita meno esplorativa del suolo e più

invasiva per la pianta, fa anastomosi (A).

Fam. Gigasporacee → più esplorativa del suolo,

colonizzazione della pianta “a macchia”, meno

invasiva (B).

Anastomosi

In botanica, incontro o fusione di elementi

conduttori o di fasci vascolari (nelle foglie, nel

fusto), o di ramificazioni dei vasi laticiferi o di ife

fungine. In molti funghi le ife in una colonia o in

colonie adiacenti si fondono (anastomosi ifale).

Se le ife che si fondono hanno nuclei diversi

geneticamente la colonia che si produce è un

eterokaryon. Molti funghi hanno dei sistemi che

prevengono la fusione tra cellule geneticamente

identiche, in questo caso si ha una

incompatibilità vegetativa. Questo metodo è

usato per identificare I vari ceppi all’interno di

una stessa specie (appartenenza a gruppi di

incompatibilità).

Life-histories e tratti funzionali (B)

(A) 17

MORPHOLOGICAL APPROACH FOR THE STUDY OF AMF diversity

1. SPORA

Si setaccia il suolo per ottenere le spore, si usa un gradiente d saccarosio per separare spore e particelle di suolo. 18

Poi si separano le spore

raccolte in base a

colore, taglia e altre

caratteristiche (forma,

pedicello).

Rhizophgus intraradices → spora molto comune.

COLOR: White, pale cream (0-0-10-0) to yellow brown (0-10-40-0), sometimes with a green tint. Color is highly

variable within this continuum.

SHAPE: Globose, subglobose, irregular, with many spores elliptical (especially those extracted from within

mycorrhizal roots).

SIZE DISTRIBUTION: 40-140 μm, mean = 93.3 μm (n = 170). 19

Gigaspora gigantea → ha delle cellule ausiliarie, esterne.

COLOR: Bright greenish yellow to bright yellow-green.

SHAPE: Globose to subglobose, rarely irregular.

SIZE DISTRIBUTION: 240-400 μm, mean = 324μm.

2. COLTIVAZIONE

Bisogna trovare una pianta trappola in grado di intrappolare la maggior parte delle diverse specie e che massimizzi la

loro propagazione. Ci sono diverse piante con diversa idoneità alla propagazione del campione.

Il suolo viene diluito in sabia sterile, con pochi nutrienti. La pianta deve avere una bassa crescita radicale, ma molte

radici laterali da colonizzare, e un’alta efficienza fotosintetica (es. C4) e alta richiesta di P. inoltre deve essere

resistente ai patogeni e necessitare di poca cura.

3 purposes:

1. trapping as many fungal organisms as possible that are

indigenous to a field soil

2. establishing each ISOLATE of a species as unique CULTURE 20

3. increasing inoculum of each organism for agricultural use

GENERAL PROPERTIES OF AN OPTIMUM trap plant SPECIES:

1. Mycotrophic hosts tending to support the widest range of fungal

genotypes

2. Compatible with greenhouse climate

3. Tolerant of a wide range of soils

4. Moderate rate of root growth

5. Extensive root branching

6. High photosynthetic efficiency with a high P requirement (C4 metabolism)

7. Resistant to a wide range of pests

3. SINGLE SPORE INOCULATION

Una singola spora, in buone condizioni, attaccata ad una radice (plantula). Una volta che avviene la colonizzazione, la

pianta si può rinvasare. Dopo circa 120 giorni si possono raccogliere le spore. Ogni arbuscolo ha una durata di 5-7

giorni, poi collassa e ne viene un altro in un’altra cellula. Dopo 90 giorni la pianta nel vasetto non può più crescere,

dà tutto al fungo → formazione di spore. - During the active

phase of shoot and root growth, most

of the carbon is going to the fungi as

they colonize roots and investing in

mycorrhizal development.

- Once roots have

ceased growth because of constraints

imposed by pot boundaries,

mycorrhizal colonization catches up

with root niche space and at some

point also reaches stasis.

- With continued

photosynthesis in shoots, carbon is

repartioned to the one niche still

open to fungal growth, and that is in

sporulation.

CICLO C4

Il Ciclo C4 è parte del processo di fotosintesi, e deve il suo nome al fatto che il primo composto stabile a formarsi è

una molecola a 4 atomi di carbonio. Nelle piante a ciclo C4, durante la fotosintesi, a differenza che nel Ciclo di Calvin,

l'anidride carbonica non partecipa direttamente, ma viene trasformata in ossalacetato sulle cellule del mesofillo

della foglia. L'ossalacetato possiede 4 atomi di carbonio e viene trasformato in malato o aspartato, anche questo

composta da 4 atomi di carbonio. Una volta trasformato il malato o aspartato migra dal mesofillo verso le cellule che

circondano i vasi conduttori, le cellule della guaina del fascio. Qui il malato o aspartato viene ritrasformato in

anidride carbonica, CO2, la quale viene coinvolta nelle reazioni del ciclo di Calvin.

La fotosintesi di tipo C4 avviene soprattutto nelle piante che vivono nei climi tropicali, e si svolge in modo ottimale a

temperature elevate e in ogni caso più alte rispetto a quelle richiesta dalle piante appartenenti al ciclo C3; le piante a 21

ciclo C4 sono in grado di sopravvivere a temperature alle quali le piante a ciclo C3 non sopravvivono.

Il Ciclo C4 produce una quantità di zuccheri rispetto all'anidride carbonica utilizzata superiore a quella prodotta dal

ciclo C3, massimizzandone la produzione.

La fotosintesi C4 riduce al minimo la fotorespirazione poiché le cellule del mesofillo pompano costantemente CO2

mantenendone elevata la concentrazione, in modo che la RuBisCO leghi il biossido di carbonio anziché l'ossigeno. Le

piante a ciclo C4 aprendo gli stomi in misura inferiore rispetto alle piante a ciclo C3 riescono a effettuare la

fotosintesi alle stessa velocità limitando la perdita di acqua.

Le piante a ciclo C4 si differenziano in 18 famiglie e in oltre 100 generi. Dal punto di vista evolutivo, la reazione del

ciclo C4 si è affermata in modo indipendente rispetto alle altre linee evolutive vegetali.

4. ESTRAZIONE DELLE SPORE SANE

Alcune sono immature (non infettive), altre sono non sane, parassitate o morte → vanno ripulite.

Le spore a questo punto sono utilizzate per:

- Caratterizzazione morfologica

- Caratterizzazione molecolare

- Altri esperimenti

-

Gigaspora gigantea Tutte le

spore.

Spore

sane.

IMMATURE SPORES SPORES WITH ATYPICAL CONTENT PARASITIZED AND DEAD SPORES

SPORE MORPHOLOGY Sono presenti 3 pareti .

PVLG e Melzer’s → sono reagenti.

In base all’entità della sporulazione o si

osservano direttamente al microscopio o si

diluisce. In quest’ultimo caso si calcola il

diametro del campo visivo al microscopio e

si fa una media, poi si rapporta l’area 22

all’intera capsula Petri (spore/g di suolo).

SPORE GERMINATION 23

COLONIZATION RATE

Il tasso di colonizzazione si osserva mediante colorazione con cotton blue. In alcuni casi prima si fa una

chiarificazione con KOH, ciò fa si che i coloranti (tannini) siano rilasciati. Alcuni funghi si colorano meno perché

hanno meno chitina nella parete. 24

25

Metodo Gridline:

molto poco informativo ma veloce

MOLECULAR APPROACH FOR THE STUDY OF AMF diversity

PCR

Sanger Sequencing  Pirosequenziamento → (max 400 basi) Quando ci sono omopolimeri > 6

Next-Generation Sequencing (NGS) ntd il sistema fa errori, non è affidabile.

 Sequencing by synthesis → meno errori, 1 ntd per volta, max 800 bp.

Tecnologia Illumina.

PCR

La reazione a catena della polimerasi (in inglese: Polymerase 26

Chain Reaction), comunemente nota con la sigla PCR, è una

tecnica di biologia molecolare che consente la

moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici

dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e

terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di

ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale

genetico necessaria per le successive applicazioni.

Tale metodica fu ideata nel 1983[1] da Kary B. Mullis il quale

ottenne, per questo, il Premio Nobel per la chimica (1993).

La PCR ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della

duplicazione cellulare: la ricostituzione (sintesi) di un

segmento di DNA "completo" (a doppia elica) a partire da un

filamento a singola elica. Il filamento mancante viene

ricostruito a partire da una serie di nucleotidi (i "mattoni"

elementari che costituiscono gli acidi nucleici) che vengono

disposti nella corretta sequenza, complementare a quella del

DNA interessato.

Questo processo viene svolto in natura da enzimi chiamati

DNA-polimerasi, che sono in grado di sintetizzare

progressivamente un nuovo filamento di DNA nelle seguenti

condizioni:

devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto

forma di desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP);

il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che

compongono i filamenti devono essere già separate;

il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato,

ovvero non è possibile sintetizzare un nuovo filamento a

partire da zero;

devono inoltre essere rispettate opportune condizioni di

temperatura, pH, ecc.

È possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla

formazione dei nuovi segmenti di DNA, ponendo in

soluzione:

 una quantità, anche minima, del segmento di DNA che si

desidera riprodurre;

 una quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire

i nuovi filamenti;

 opportuni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi

sequenze di RNA (oligonucleotidi) complementari agli

estremi 3’ dei due filamenti del segmento da riprodurre; Figura 1. Schema delle fasi di una PCR: 1. Denaturazione 2.

 Annealing 3. Allungamento 4. Termine del ciclo.

una DNA polimerasi termo-resistente (non è necessario

che provenga dallo stesso organismo di cui si deve

replicare il DNA);

 un Buffer che serve a mantenere il pH stabile (tampone) e necessario per costituire l'ambiente adatto alla

reazione;

 altri elementi di supporto (ad es. ioni magnesio) indispensabili per il corretto funzionamento della DNA

polimerasi;

 acqua per portare a volume la soluzione.

Per avviare la reazione della polimerasi (fase di prolungamento del filamento a partire dal primer 5’) è prima

necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA (fase di denaturazione), quindi alla creazione del

legame tra i primer e le regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing). Questo

processo risulta però incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene distrutta alle temperature necessarie

alla denaturazione (96-99 °C).

Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alle polimerasi appartenenti a organismi termofili che non sono

inattivate dalle alte temperature, ad esempio la Taq polimerasi proveniente dal batterio termofilo Thermus 27

aquaticus. Ciò consente di realizzare più cicli di PCR in sequenza, in ciascuno dei quali viene duplicato anche il DNA

sintetizzato nelle fasi precedenti, ottenendo una reazione a catena che consente una moltiplicazione estremamente

rapida del materiale genetico di interesse.

Schema di un ciclo di PCR. La soluzione di DNA da replicare, desossiribonucleotidi trifosfati, ioni magnesio, primer e

TAQ polimerasi viene portata a una temperatura compresa tra 94 e 99 °C. Ci si trova, di conseguenza, in una

situazione in cui la doppia elica del DNA viene completamente scissa ed i due filamenti di cui essa è composta sono

liberi (fase di denaturazione).

Successivamente la temperatura viene abbassata fino a 40-55 °C circa al fine di permettere il legame dei primer alle

regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing).

Infine la temperatura viene alzata fino a 65-72 °C al fine di massimizzare l'azione della TAQ polimerasi che determina

un allungamento dei primer legati, utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA (fase di prolungamento).

Il ciclo descritto viene ripetuto generalmente per circa 30-40 volte. In genere non si superano i 50 cicli in quanto ad

un certo punto la quota di DNA ottenuto raggiunge un plateau. Ciò avviene, ad esempio, per carenza degli

oligonucleotidi usati come inneschi o per diminuzione dei dNTP. Bisogna inoltre considerare che si potrebbe

amplificare in maniera eccessiva anche eventuale materiale genomico contaminante.

SISTEMI DI SEQUENZIAMENTO

Metodo Sanger

Il metodo sviluppato da Frederick Sanger e collaboratori (il cosiddetto metodo della terminazione della catena, chain

termination method o metodo Sanger, dal nome del suo scopritore)[2][3], è un metodo cosiddetto enzimatico,

poiché richiede l'utilizzo di un enzima; il principio della tecnica sviluppata da Fred Sanger si basa sull'utilizzo di

nucleotidi modificati (dideossitrifosfato, ddNTPs) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche.

Nella reazione di sequenziamento, l'estensione è iniziata in un sito specifico del DNA utilizzando un oligonucleotide

primer complementare alla regione del DNA ed avviene ad opera di una DNA polimerasi che utilizza i quattro

deossinucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Insieme a questi, vengono introdotti i dideossinucleotidi i quali, una volta

incorporati dalla DNA polimerasi nella sintesi del filamento, ne provocano il blocco. Introducendo questi "bloccanti"

in quantità basse, si avrà una serie di filamenti di diversa lunghezza, in base a dove tali bloccanti sono stati

incorporati. Questi ddNTPs sono solitamente anche marcati (radioattivamente o per fluorescenza) in modo da

poterli visualizzare successivamente. Un'altra possibilità sta invece nel marcare il primer, anche se ora questa pratica

è caduta in disuso.

I frammenti vengono poi separati in base alla loro lunghezza su di un gel, si utilizza il gel di agarosio che ci permette

di separare frammenti che differiscono come lunghezza anche di una singola base (o altra matrice polimerica), quindi

vengono visualizzati su lastra fotografica o su gel (a seconda del tipo di marcatura). Nell'immagine qui accanto i

ddNTPs sono stati marcati radioattivamente e le bande scure corrispondono ai vari frammenti di lunghezza diversa.

Le posizioni relative delle bande nelle quattro corsie sono utilizzate per leggere la sequenza (dal basso verso l'alto). 28

Pirosequenziamento

Il pirosequenziamento è una delle nuove tecniche di sequenziamento ad elevato parallelismo, basata sul principio

del "sequencing by synthesis"; sviluppata da Mostafa Ronaghi, è stata descritta per la prima volta nel 1998[4][5][6].

Questa tecnica si basa sull'utilizzo di una serie di enzimi che producono luce in presenza di ATP quando un nucleotide

viene incorporato nel filamento (ad opera della DNA polimerasi).

Il pirosequenziamento consta di 5 passaggi principali:

1. La sequenza da analizzare, dopo essere stata amplificata con la PCR, viene incubata come singola elica insieme agli

enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi e apirasi e ai substrati adenosinsolfofosfato (ASP) e luciferina;

2. Uno dei quattro dNTP è aggiunto alla reazione. La DNA polimerasi catalizza l'aggiunta di tale base solo se è

complementare con il residuo del templato. In tal caso si ha concomitante liberazione di pirofosfato inorganico PPi;

3. Il PPi così prodotto viene trasformato in ATP, ad opera della solforilasi e usando l'ASP come substrato. L'ATP

ottenuto consente la conversione della luciferina ad ossiluciferina ad opera della luciferasi con produzione di un

segnale luminoso che viene rilevato da un'apposita camera fotosensibile CCD. L'incorporazione nel filamento dei

nucleotidi genera una quantità di luce che è proporzionale al numero di basi incorporate in un'unica aggiunta di

nucleotidi (ad esempio, nel caso di una sequenza omopolimerica tipo AAA, TTT, GGG o CCC, la quantità di luce

liberata è proporzionale al numero di nucleotidi incorporati, in questo caso 3);

4. L'enzima apirasi degrada il dNTP che non è stato incorporato, e l'ATP prodotto dalla solforilasi. Solo quando la

degradazione è terminata si aggiunge un secondo dNTP per far progredire la reazione di polimerizzazione

(ritornando allo step 1);

5. Si aggiungono ciclicamente tutti e 4 i nucleotidi fino alla deduzione completa della sequenza.

Pirosequenziamento NGS - hundred-thousands of seqs per run: 29

SEQUENCING BY SYNTHESIS (NGS) - millions of seqs per run 18s : contiene le zone ipervariabili

V3 e V4, servono per distinguere le

diverse specie, tra individui diversi

dello stesso isolato.

ITS : sono zone completamente

ipervariabili.

18s è la subunità small del

ribosoma, si usa questo gene

perché è il giusto bilancio tra zone 30

conservate e zone ipervariabili.

Anche il 28s viene usato.

La NGS fa molti errori, ma grazie ai diagrammi di flusso registrati dalla macchina è possibile risalire agli errori ed

eliminarli (1), diminuendo le sequenze, poi (2) si fa un raggruppamento delle sequenze simili (ci sono polimerasi che

fanno molti errori, altre meno) → si raggruppa per eliminare ulteriormente gli errori (copie identiche).

(3) OTU (Operational Taxonomc Unit) → ulteriore riduzione delle sequenze raggruppando.

(4) Chimera = sequenze formate per metà da una specie, metà da un’altra (per errori durante la PCR), devono essere

scartate (si fa tagliando a metà la sequenza e vedendo a chi appartiene). Una chimera può essere confusa con una

nuova specie!

(5) Si tolgono inoltre le sequenze che non hanno almeno 5 copie identiche (artefatti).

1 31

5

3

2 4

MaarjAM → database Blast solo per glomeromiceti.

Blast è pieno di errori (chimere anche tra phylum diversi). 32

Esempio di sequenza:

Le sequenze presenti nei database sono per lo più provenienti da sistemi antropizzati. I funghi provenienti da questi

ecosistemi sono morfotipi già studiati, presenti nei database di riferimento (per lo più provenienti da ecosistemi

agricoli). I funghi provenienti da ecosistemi non antropizzati sono poco conosciuti, bassa % di morfotipi e sequenze

note nei database. 33

ARE COMMUNITIES IDENTICAL IN SOIL AND ROOTS? → No

Glomeracee → famiglia che colonizza più le radici che il suolo (ma comunque presenti in abbondanza anche nel

suolo).

Paraglomeracee → famiglia molto difficile da trovare nelle radici, sono in una simbiosi obbligata (ipotesi che sia

facoltativa). Sono più presenti nel suolo che nella radici. 34

Glomus s.l. → ancora in dibattito, verrà diviso in altri generi.

Rhyzophagus/Sclerocystis → ancora non distinti filogeneticamente.

IS DIVERSITY CORRELATED TO ENVIRONMENTAL VARIABLES? → sì

La diversità è correlata alle variabili ambientali (ad es. chimico-fisiche del suolo, soprattutto, e climatiche). 35

36

Anche la stagionalità influenza la presenza fungina. In Italia in primavera si ha proliferazione radicale e fungina,

alcuni funghi diventano dominanti. In autunno ci sono meno specie e nessuna è dominante.

DO humans HAVE AN IMPACT on AMF biodiversity ?

Tillage! (= tutto ciò che riguarda la lavorazione del terreno, es. aratura ecc.) 37

Analisi quantitativa tramite la presenza di nuclei → imprecisa, possono esserci ife settate e non: non è detto che la

presenza di nuclei sia direttamente proporzionale alla biomassa (metodo semiquantitativo). Le vescicole inoltre sono

un luogo di deposito, non di attività, molto spesso contenenti DNA.

Campi arati (le ife vengono distrutte):

 minore diversità fungina

 minore stato di aggregazione del suolo

 minor numero di spore

Fertilizzazione (deleteria): 38

 meno ife Il fungo diventa inutile per la pianta, anzi dannoso, non si forma la zona di deplezione.

 meno diversità

Avvicendamento coltivi:

 aumenta la diversità di specie (che soddisfano le diverse esigenze)

Agricoltura più sostenibile:

 piante trappola

 inoculo diretto

 gestione corretta del suolo

o mai terreno incolto

o riduzione pratiche agricole ad alto impatto

o cover plant inoculate

 prodotti da agricoltura biologica → più remunerativi.

L’inoculo ha un impatto sulla comunità locale:

 sostituzione

 competizione

 effetti genetici (HGT, fusioni ifali) → nuovo isolato con caratteristiche adeguate al sito!

L’inoculo va effettuato tramite piante trappola o ROC (→solo per poche specie).

Disturbi antropici:

1. soil disturbance destroys the extra-radical mycelial network

2. different tolerance to hyphal disruption among different AMF species

3. AMF species differ in their capacity to PROPAGATE from fragmented mycelium

Effetti fertilizzazione: 39

40

WHY?

1. in a nutrient-rich environment, a plant can directly uptake from the soil

2. fertilization can make MYCORRHIZAL partners costly, and even parasitic.

CROP ROTATION?

WHY?

plant diversity and mycorrhizal diversity are positively correlated

AMF biodiversity restoration

- agricultural fields and degraded lands are all soil environments in which humans have had an impact on

the ecological balances

- an appropriate management of these symbiotic fungi would lead to a great reduction in chemical

fertilizer and pesticide inputs (>sustainability):

1. direct re-introduction of an AMF inoculum

2. selective management of the target ecosystem 41

HOW TO MANAGE NATIVE OR INOCULATED AMF

- fall cover cropping

- no detrimental agricultural practices

- cover crop mixtures to elevate the native AMF inoculum

- fertility islands (small patches of cover plants inoculated with AMF)

SUSTAINABILITY

- AMF restoration = initial cost

- amortization over the years

- reduce fertilization and pesticide costs

- inoculated crops can be sold at a premium price to an eco-friendly orientated consumer class (organic

farming)

INOCULUM MASS PRODUCTION

TRAP PLANT CULTIVATION → 3 purposes:

1. trapping as many fungal organisms as possible that are indigenous to a field soil

2. establishing each ISOLATE of a species as unique CULTURE

3. increasing inoculum of each organism for agricultural use

ROC (root organ culture) 42

Andrea Berruti

https://www.researchgate.net/profile/Andrea_Berruti 43

44

Symbiotic associations are among the most decisive drivers of ecological diversification, occurring in every aquatic

and terrestrial habitat on earth. Molecular tools have allowed us to identify remarkable radiations of symbiotic

partnerships across diverse ecological conditions, but it is unknown whether the regulatory mechanisms underlying

such partnerships evolved repeatedly or are based on pre-existing ancestral pathways. In general, traits arising from

symbiotic partnerships require complex coordination between different species and are typically characterized by a

diversity of types and symbiotic states. Toby Kiers, 2014

E negli ambienti acquatici?

Per molto tempo si è pensato che I funghi simbionti fossero incompatibili con una bassa percentuale di ossigeno e /

condizioni anaerobiche….

Solo circa il 12-18% delle piante non sono micorrizzate. La predominanza è di piante che formano micorrize. Fino a 5

anni fa si pensava che la vita in acqua fosse incompatibile con i simbionti fungini.

Es. Littorella e Lobelia sono piante acquatiche micorrizzate, le richieste di O2 sono compatibili con l’O2 disponibile.

C’è una correlazione tra AMF e disponibilità di O2.

The Scientific World JournalVolume 2014 (2014),

Arbuscular Mycorrhizal Fungal Mediation of Plant-Plant

Interactions in a Marshland Plant Community Qian

Zhang, et al

AM colonization was positively related to oxygen 45

concentration. P. australis increased oxygen

concentration, enhanced AMF colonization, and was

thus indirectly capable of influencing plant interactions.

Aerobic AM fungi appear to be ecologically relevant in

this wetland ecosystem. They drive positive neighbor

interactions for subdominant plant species, effectively

increasing plant diversity. We suggest, therefore, that

AM fungi may be ecologically important even under

waterlogged conditions.

E nel riso?

Chi c’è?

Cambia a seconda del metodo di coltivazione?

Che cosa fa il microbiota associato al riso?

Può aumentare la produttività del riso?

Altro es. è il riso (di cui in Italia è in atto un calo dei consumi) → quali sono le relazioni tra AMF, radici ed ambiente

acquatico?

Le micorrize nelle radici del riso sono presenti se la pianta è all’asciutto e scompaiono se l’apparato radicale viene

sommerso.

Crowned roots → grosse radici da cui ne dipartono di laterali più larghe e poi più fini. Anatomia molto particolare,

parenchima aerifero : canali (formati per lisogenia o schizogenia) per il passaggio dell’aria, dalla superficie alla parte

sommersa.

L’apparato radicale del riso: 46

In blu: micorrize

Large lateral roots all’asciutto → sono ben micorrizzate, ma appena va in sommersione → perde le micorrize.

Fine lateral roots → mai micorrizzate.

Il sorgo ha un’organizzazione simile. 47

Vallino et al. 2013

Etilene → fattore di crescita importante per la formazione del parenchima aerifero, processo di maturazione e

abscissione del frutto.

In sommersione gli ormoni come l’etilene cambiano completamente l’anatomia della radice, il fungo non ha più lo

spazio fisico, la sua nicchia viene distrutta, il fungo quindi si ritrae e rimane attivo nell’ambiente. Rimane attivo il

dialogo tra pianta e fungo.

Conclusioni

- Le Simbiosi micorriziche sono presenti anche negli ambienti acquatici

- Possono essere importanti indicatori in ambienti ecologicamente di interesse come le paludi o le risaie

- Nuova acquisizione 48

TIPOLOGIE DI MICORRIZE (morphology-based)

a. Ectomicorrize

Ci sono diversi comparti, il micelio fungino esplora il

suolo e avvolge le radici, approfondendosi nei

tessuti radicali, tra le radici secondarie, che formano

dei rigonfiamenti di colore particolare (colore del

fungo). Hartig net.

b. Endomicorrize

1. AMF → il fungo esplora il terreno e

si approfonda nelle cellule delle

radici. Alcuni funghi rilasciano delle

molecole coloranti (pigmenti)

particolari.

2. Ericoidi Le micorrize

3. Nelle orchidee formano dei

gomitoli (ife)

c. Ectoendomycorrhizae nelle cellule

1. nelle Gimnosperme della radice.

2. Arbutoid

3. Monotropoid

Benefits for the Plant:

- Mineran Nutrition (N, P)

- Pathogen protection

- Water stress protection

- Heavy metal protection

- Biodiversity 49

le comunità di funghi micorrizici aumentano la biodiversità e la produttività della comunità vegetale → le due cose si

riflettono: Wood wide web (studi tra il ’92 e il ’95)

L’ecologia non si può studiare solo dal punto di vista macroscopico, ma anche dal punto di vista microscopico, sotto

terra.

Benefits for the Fungus

- Sugar uptake

- Life cycle accomplishment

Scambio tra fungo e pianta → equilibrio

Plant nutrients feed the mycorrhizal mycelium which explores larger and larger soil volumes 50

Laccaria laccata

Il micelio forma una texture molto fitta nel terreno, che deve essere sostenuta energeticamente dalla pianta, ma che

esplora il suolo alla ricerca di P e N. Soil and mycorrhizal fungi

A bridge between the root and the soil

Soil texture

Hanno avuto grandissimo successo

evolutivo, si trovano in tutti gli

ambienti. Alcune associazioni sono

antichissime (risalgono all’Ordoviciano, 51

micorrize arbuscolari).

Leguminose-micorrize → nel Cretaceo.

Le ectomicorrize invece sono molto più

recenti, compaiono nel Terziario (34-50

MYA), trovate ectomicorrize fossili

conservate nell’ambra.

Funghi, piante e strategie diverse.

E le ectomicorrize? Molto più giovani!

Our fossils are preserved in a 52 million-yr-old piece of amber from

the Tadkeshwar Lignite Mine of Gujarat State, western India. The

amber was produced by representatives of Dipterocarpaceae in an

early tropical broadleaf forest. The ectomycorrhizas were

investigated using light microscopy and field emission scanning

electron microscopy. Dissolving the amber surrounding one of the

fossils allowed ultrastructural analyses and Raman spectroscopy.

Ectomycorrhizas from a Lower Eocene angiosperm forestChristina Beimforde1,

Nadine Schäfer1, Heinrich Dörfelt2, Paul C. Nascimbene3, Hukam Singh4, Jochen 52

Heinrichs5, Joachim Reitner1, Rajendra S. Rana6, Alexander R. Schmidt1Article first

published online: 11 NOV 2011

Eocene- terziario…34-50MYA

D. Read è il primo ecologo che si è occupato dell’ecologia dei funghi.

Brughiera → N sotto forma organica → Dominio: micorrize

ericoidi

Prateria → N sotto forma inorganica → Dominio: AM

Le comunità vegetali sono in strettissimo rapporto con le

comunità fungine e con il suolo.

Il lavoro di Read è stato confermato dagli studi genomici sui

funghi.

I funghi AM in realtà possono proliferare anche nei suoli ricchi

di N organico. 53

Esistono zone, come la macchia mediterranea, che

rimescolano tutte le condizioni ipotizzate da Read.

Nestedness non ha una traduzione, il concetto che esprime è clusterizzazione, è la capacità del fungo di interagire

con piante diverse.

Modularità → definisce la specificità dell’interazione.

Che rapporti ci sono tra le comunità delle piante e le comunità dei funghi?

Lessons from ecological studies on ECM communities:

- Diversity of ECM fungi depends on the plant communities

- Comparison between above-ground e below-ground diversity

- Space distribution of ECM fungi

- Dynamics of ECM fungi and evolution of plant communities

- Wood-Wide-Web: the hyphal network

Diversità sotto terra

Non c’è una relazione diretta tra il corpo fruttifero dei funghi

ectomicorrizici (diversità sopra al suolo) e i funghi ECM presenti nelle

radici ECM (diversità sotto terra).

Le radici ECM di solito ospitano un grande numero di specie ECM. Le

specie non-fruttifere rappresentano i più comuni simbionti ECM.

Ectomycorrhizal fungi often form fruiting bodies (mushrooms) near trees: 54

I funghi ectomicorrizici fanno corpi fruttiferi, è possibile farne un mappaggio (mappe di distribuzione) e studiarne le

interazioni.

C’è una correlazione diretta tra corpi fruttiferi e quello che c’è sotto terra → ci sono molti più funghi associati alle

radici rispetto ai corpi fruttiferi presenti.

Le specie ECM che non fruttificano sono molte di più rispetto a quelle che fruttificano.

Many familiar mushrooms are fruiting bodies of EM fungi: 55

Le prime analisi sono state fatte su basidiomiceti in foreste molto conservate, senza disturbo.

Genet = singolo individuo. Dinamica della comunità ECM:

R strategy = stress-tollerante; S strategy = specifiche

La dinamica è riflessa anche dalla maturità della pianta. Piante appartenenti alla stessa specie possono essere messe

in contatto da funghi diversi o dallo stesso fungo simbionte (wood wide web) → c’è uno scambio nutrizionale (C, N,

P) tra le piante che condividono lo stesso simbionte (ponte tra le piante).

“effetto nursery” = plantule nutrite dalla pianta madre tramite il fungo.

ECM and host specificity

es. Cenococcum geophilum (Ascomycetes, associated to more than plant 150 mostly on young

spp.), Pisolithus tinctorius (Gastromycetes), Thelephora terrestris

“generalists” → plants

(Afilloforales), Hebeloma crustuliniforme (Agaricales), Laccaria laccata 56

(Agaricales), Paxillus involutus (Agaricales)

es. Suillus e Rhizopogon spp. (Basidiomycetes), sometimes with one genus mostly on mature

“specialists” → (es. Suillus luteus on pine, Suillus grevillei on larch) plants

ECM fungi allow connections among roots from diverse plants

belonging to the same species ( “specialist fungi”) or to diverse species (

“generalist fungi”)

ECM plants share the same symbiont and are physically connected

through the extraradical mycelium

What about the function?

Does the WWW allow a nutritional exchange ? →sì!

There is a nutrient exchange among plants which share the same

symbiont (C, N, P).

Esperimento con Betula papyrifera/Pseudotsuga menziesii

Si è indagato il flusso di nutrienti tra sink/source. Risultato: il flusso vale solo se il sink non è in grado di

fotosintetizzare → i fattori ambientali sono la chiave! Fattori chiave che si intrecciano:

Luce, fotosintesi, efficienza micorrizica.

C transfer between two plants sharing the same ECM

Symbiont: Nutrient flow from “source” to “sink”.

WWW: some new concepts: What about the plant individual,

from a functional point of view?

 The “nursing”

 WWW parasitism

Comunicazione molto

complessa tra piante diverse. 57

ECTOENDOMICORRIZE

In realtà si tratta di tappe transienti, i funghi seguono con

l’associazione la maturazione della pianta.

 Mantello Anatomia

 Rete di Hartig simile alle

 Approfondamento endocellulare ECM roots

Ectoendomycorrhizae in young Gymnosperm seedlings

Pinus seedlings (1-3 years): Transient step before ECM. 58

Fungo coltivabile facilmente: Wilcoxina mikolae

(Ascomycetes)

Può formare delle vere ectomicorrize su piante più mature →

grande plasticità.

Le frecce indicano : Intracellular coils

Arbutoid Ectoendomycorrhizae:

pianta ospite:

 Corbezzolo

 Piante albine appartenenti alle Ericales (monotrope, associate a funghi ectomicorrizici)

[Ericales tribe Arbutoideae (Arbutus, Arctostaphylos, Pyrola)]

Micobionti :

 Ascomycetes

 Cenococcum geophilum

 Basidiomycetes

 Cortinarius 59

 Hebeloma

 Lactarius

 Laccaria

L’ifa di penetrazione ha le caratteristiche comuni a tutte le ife endocellulari (invaginazione della membrana

plasmatica → dominio del fungo e quello della pianta son ben differenziati).

In realtà nessun fungo è realmente endocellulare, ma sono sempre limitati in uno spazio apoplastico (tra la parete

cellulare e la membrana plasmatica) → chiave dell’interazione mutualista: funghi parassiti e patogeni invece entrano

nel citoplasma, con perdita di funzionalità della membrana.

Rari boschi monospecifici In Lazio montagne della Tolfa (corbezzolo)

Piante monotrope albine → sopravvivono grazie al WWW, il fungo fa da ponte tra la pianta ad alto fusto e la

monotropa. 60

Phytobiont Mycobiont

Ericales: Basidiomycetes:

Tribe Monotropoideae Rhizopogon

(Monotropa, Sarcodes, Allotropa, Pterospora) Russula

Aclorophyllic species Tricholoma 61

Conclusioni:

Il termine micorriza indica un ampia gamma di interazioni pianta-fungo.

Le micorrize sono la simbiosi con le piante dominante negli ecosistemi.

La plasticità dei funghi micorrizici permette la creazione di una rete WWW ifale che offre nuovi scenari per l’ecologia

vegetale e la fisiologia.

Tabella delle funzioni ecologiche: 62

Secrezione di glomalina: glicoproteina secreta nel suolo che tiene aggregato il suolo → anche impatto abiotico.

Fitobionti (≈ 225.000 specie)

 Bryophytes, Pteridophytes, Spermatophytes (~80% vascular plants)

Ne sono prive:

 Erbacee: Juncaceae, Cyperaceae, Caryophyllaceae, Cruciferae, Chenopodiaceae

 Alberi:

- Fraxinus (Oleaceae)

- fruit trees (Rosaceae)

- some Gymnosperms (es. Gingko)

- Populus e Salix (Salicaceae) nè AM nè ECM

Pioppo: nei primi mesi instaura un’associazione AM endomocirrizica, poi ectomicorrizica. Pianta modello per le

piante perenni.

Arabisopsis: non è una pianta ospite. Perché? Non si ha ancora una risposta definitiva ma:

- Motivi filogenetici

- Motivi anatomici

- Motivi di percezione

SYM pathway non presente in A.t.?

Spesso le piante non ospiti sono infestanti, hanno qualche effetto sull’instaurarsi del WWW?

Setto che non permette il

Esperimento: passaggio delle radici, ma

solo quello delle ife

Trifoglio A. thaliana 63

Ife

Il fungo entra attraverso i peli radicali, ma la radice muore → non si osserva nessuna interazione né crescita di

arbuscoli in A.t., ma le sue radici vengono usate come substrato, probabilmente sono morte. Non si sviluppa una

corretta micorrizzazione.

Ci vorrebbero altri esperimenti per capire perché una pianta è resistente ad un patogeno o un simbionte con un

approccio molecolare, genetico.

Arbuscular mycorrhizal fungi reduce growth and infect roots of the non-host plant Arabidopsis thaliana.

[Schematic representation of a dual-compartment microcosm containing a host plant (left), used to pre-establish the

arbuscular mycorrhizal (AM) network (dashed lines), and Arabidopsis thaliana (right). The two root systems were

separated by a 30μm nylon mesh (permeable to hyphae) to reduce the effects of direct root competition].

Rhizophagus irregularis hyphae (F) penetrate Arabidopsis thaliana roots through root hairs (H, arrow) (a, b and c)

and, more rarely, directly through the epidermal cells (d) Conclusion

In other words

Arabidopsis will be an

ideal system to study

mechanisms of non-

host resistance to AM

colonisation.

Elucidating these

mechanisms will

obviously make a

great contribution to

understanding the

basis of the

mycorrhizal

interaction.

Grande successo evolutivo: AMF are the most widespread and ancestral fungal symbionts of plants: 64

I fossili testimoniano la presenza delle micorrize già nel Devoniano (450 MYA)

Già a partire dagli anni ’20 è possibile ricostruirne la storia…

Once upon a time, deep in the heart of the forest… AMs already existed:

Arbuscule-like structure

in the rhizome of

Aglaophyton

Remy et al. PNAS 1994

Dove si trovano i fossili?

Di che piante parliamo?

Chert is a sedimentary rock comprised primarily of very finely crystalline silica

minerals, mainly a number of varieties of quartz. Some cherts are formed from the

accumulation of siliceous animal remains such as radiolaria, diatoms or sponge spicules.

Most, however, are formed by chemical precipitation from silica rich fluids either within or

replacing pre-existing sediments after they have been buried, or more rarely as a primary

surface deposit. The 'Rhynie chert' falls into this last category and was originally deposited as

sinter from ancient hot springs. It is a rather unusual variety of bedded chert of

predominantly dark blue-grey colours that is of Early Devonian (Pragian) age, between 400

and 412 million years old (see inset right). The most remarkable feature of this particular rock

is that it contains exceptionally well preserved fossils of some of the earliest plants and

animals to colonise the land. Sono state trovate nelle radici di Rinophyta

The 'Rhynie chert (in Scozia)' delle strutture simili agli arbuscoli.

About 20 cm high (selce)

La selce, essendo molto resistente, ha conservato parti organiche.

Rinophyta → sono state le prime piante a comparire sulla terra?

Non ci sono fossili di briofite.

Quando sono comparse le radici? Nel basso Devoniano.

Nelle prime tappe dell’evoluzione le micorrize erano presenti, nonostante le radici non fossero ancora comparse →

sono state le micorrize a spingere verso l’evoluzione delle radici?

I funghi AM sono indifferenti al fatto che la pianta sia in fase gametofitica o sporofitica. Lo stabilirsi di

un’associazione simbiotica non è correlato alla presenza di radici. 65

66

Christine Strullu è una paleontologa che ha studiato le selci per capire l’insturarsi dell’associazione, grazie ai materiali

molto ben conservati.

Fungal associations in Horneophyton ligneri (pianta estinta, di incerta collocazione sistematica, vissuta all'inizio

del Devoniano (circa 410 milioni di anni fa)- Rhyniophyta)from the Rhynie Chert (c. 407 million year old) closely

resemble those in extant lower land plants: novel insights into ancestral plant–fungus symbioses Christine Strullu

Derrien. We studied petrographic sections of exceptionally

well-preserved petrified plants from the 407 million yr-old

Rhynie Chert (Scotland, UK). For comparative purposes, we

illustrate fungal associations in four extant lower land plants.

We document two new endophytes in the plant

Horneophyton lignieri.

Conclusione → probabilmente ci sono due tipi di endofiti: ai

funghi AM si associa un altro simbionte. Nelle piante che

colorizzarono la terra emersa probabilmente c’erano già due

simbionti (endocore).

Fungal associations in Horneophyton ligneri from the Rhynie

Chert (c. 407 million year old) closely resemble those in

extant lower land plants: novel insights into ancestral plant–

fungus symbioses. 67

Quali sono le piante basali?

Hornworts (ANTOCEROTE) Mosses (MUSCHI) Liverworts (EPATICHE)

(Anthoceratophyta) (Bryophyta) (Marchantiophyta)

- 3 classes and ~9000 species

- Most of lines seem to have been

formed in the Permian (275 MYA),

even if Ordovician fossil spores

- 12 genera and 200-220 species were found (475 MYA)

- Their origin is around 300-400 MYA

“Hornworts are consider the sister group to earliest vascular plants

as well as the key lineage to understand the transformation from

gametophyte-dominated life cycle of non-vascular plants to the

sporophyte-dominated life cycle of vascular plants” (Villareal et al.,

2010).

“Liverworts are considered the most ancient group of land plant

and consequently the sister-group to the other extant land plants”

(Groth-Malonek et al., 2005; Qiu et al., 2006)

Quale è lo status micorrizico di queste piante?

Molte epatiche sono micorrizzate, i muschi solo di rado, le anthocericales a volte.

Nelle epatiche non ci sono ancora veri e propri stomi (no regalozione né scambi gassosi); sono presenti dei rizoidi per

l’adesione al terreno.

Tramite la tecnica FISH vengono evidenziati i nuclei dei funghi che hanno olonizzato l’epatica (punti arancioni =

endobatteri presenti nel fungo).

Questa associazione è veramente funzionale? Sì, c’è un vero scambio di nutrienti, viene spinta e promossa la crescita

della pianta e la riproduzione asessuale. 68

FISH (Fluorescence in situ hybridization)

La ibridazione fluorescente in situ, in inglese Fluorescent in situ hybridization (FISH) è una tecnica citogenetica che

può essere utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l'assenza di specifiche sequenze di DNA nei cromosomi.

Essa utilizza delle sonde a fluorescenza che si legano in modo estremamente selettivo ad alcune specifiche regioni

del cromosoma. Per individuare il sito di legame tra sonda e cromosoma si utilizzano tecniche di microscopia a

fluorescenza.

Processo. Innanzi tutto bisogna preparare la sonda, che deve essere abbastanza lunga per ibridare esattamente il

suo obiettivo (e non un'altra sequenza simile del genoma), ma non deve essere tanto grande da impedire il processo

e potrebbe essere marcata con metodi diretti o indiretti: sono da preferire i metodi indiretti in cui il segnale è 69

determinato, non direttamente da un fluorocromo legato ad un nucleotide della sonda, ma dall'interazione di

biotina o digossigenina legate ad un nucleotide sempre della sonda, con substrati (avidina/streptavidina o anticorpi

anti-digossigenina) legati direttamente ad un fluorocromo. Questo metodo permetterà la visualizzazione di un

segnale migliore e più intenso, rispetto ad una marcatura diretta del nucleotide della sonda. Essa può essere fatta in

vari modi, per esempio con la nick translation e la reazione a catena della polimerasi usando dei nucleotidi marcati.

Poi, si produce un preparato cromosomico. I cromosomi sono attaccati saldamente al substrato, di solito di vetro.

Dopo la preparazione si applica la sonda al DNA del cromosoma e si inizia l'ibridazione. In molti passaggi di lavaggio

tutte le sonde non ibridate o parzialmente ibridate vengono rimosse. Se l'amplificazione del segnale è necessaria a

superare il limite della sensibilità del microscopio (che dipende da molti fattori come l'efficienza della sonda, il tipo di

sonda e la tinta fluorescente), gli anticorpi fluorescenti o la streptavidina si legano alle molecole marcate, per

amplificarne la fluorescenza. Infine, il campione è poi messo in un composto non-imbiancante e osservato al

microscopio a fluorescenza.

Interfase FISH. Nell'interfase FISH la sonda è applicata a preparati con nuclei, anche a citospin, sezioni paraffiniche, o

anche a nuclei estratti da blocchi paraffinici. L'ibridazione è svolta in modo simile. I segnali fluorescenti sono visti

come punti nel nucleo cellulare, che è di solito colorato con una tinta di contrasto che riconosce il DNA.

Fibra FISH. Nel fibra FISH, i cromosomi di interfase sono attaccati ad un vetrino in modo tale che siano allungati in

linea retta, invece che arrotolati come sono di solito, o adottando una conformazione casuale, come nell'interfase

FISH. Si fa ciò utilizzando delle cesoie meccaniche lungo il vetrino o alle cellule che sono state fissate al vetrino e poi

tagliate, o ad una soluzione di DNA purificato. Lo srotolamento dei cromosomi permette una risoluzione molto più

elevata. La preparazione dei campioni di fibra FISH, anche se concettualmente è semplice, in realtà è talmente

complesso da essere definita quasi un'arte, e ciò significa che essi vengono preparati abitualmente solo in laboratori

specializzati.

Applicazioni. Individuazione attraverso una FISH della traslocazione t9:22 che genera la proteina bcr-abl, causa della

leucemia mieloide cronica.

La FISH può essere utilizzata per mappare la sequenze di uno specifico cromosoma. Anche se ci sono altri modi per

far ciò, il vantaggio principale della FISH è che essa non dipende dalla ricombinazione e così può essere utilizzata

nelle regioni cromosomiche dove è soppressa, come nel centromero. Essa può essere utilizzata per mappare le

sequenze ripetitive che si presentano in diversi punti del cromosoma.

La FISH può essere utilizzata anche per colorare i cromosomi per raffrontare due specie o varietà utilizzando il DNA

di interi cromosomi o addirittura anche l'intero genoma di una specie o di una varietà come sonda nel studiare

un'altra specie o varietà. In questo modo, le

anormalità dei cromosomi possono essere

identificate e si possono così dedurre le

relazioni evolutive.

La FISH può essere utilizzata per identificare

microorganismi ed è ampiamente utilizzata

nel campo della microecologia. I Biofilm

sono (spesso), per esempio, complesse

organizzazioni batteriche multispecie.

Preparare le sonde per una specie e

utilizzare la FISH con questa sonda permette

di visualizzare la distribuzione di questa

specie specifica nel biofilm. Preparando la

sonda (in due colori diversi) per due specie

permette di osservare e studiare la

collocazione di queste due specie all'interno

del biofilm, rivelando la fine architettura del biofilm.

La FISH si applica anche in studi clinici per scoprire se un paziente è stato infettato da un agente patogeno, i batteri

presi dai tessuti o dai fluidi del paziente si sviluppano di solito sull'agar agar (un polisaccaride) per determinare

l'identità dell'agente patogeno. Tuttavia molti batteri, anche quelli noti da tempo, non crescono molto bene in

laboratorio. La FISH può essere utilizzata per definire direttamente la presenza dell'agente patogeno sui campioni del

tessuto del paziente. Le sonde batteriche della FISH sono spesso iniettori per la regione dell'rRNA 16s.

Mutualistic mycorrhiza-like symbiosis in the most ancient group of land

plants

Humphreys et al. 2010 demonstrate that a mutualistic relationship 70

between arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and a member of the most

ancient clade of land plants Marchantia paleacea promotes carbon uptake,

growth and asexual reproduction in the plant.

Plants were grown at ambient CO2 concentrations (400 ppm) and at

concentrations representative of the early Paleozoic era (1500 ppm).

Measurements of net CO2 assimilation revealed that the AMF associated

plants had a substantially enhanced photosynthetic gain at both ambient and elevated CO2 concentrations

compared with the non-mycorrhizal plants.

Nel Paleozoico la CO2 atmosferica era di 1500 ppm, ma qual era la resa fotosintetica?

Esperimento:

Resa peggiore = pianta NM a 400 ppm; Resa migliore = pianta AML a 1500 ppm

Le briofite micorrizzate sono avvantaggiate dalle alte concentrazioni di CO2. Anche nelle epatiche questa

associazione è funzionale, la concentrazione di CO2 ha un impatto molto forte.

La successiva diminuzione della CO2 fino agli attuali livelli ha stimolato l’evoluzione e il sopravvento delle specie

attuali.

Probabilmente l’altro tipo di simbionte era importante soprattutto in quella atmosfera ricca di CO2. 71

AMs managed to persist across one of the major steps of plant development programs:

- the transition from N gametophytes to dominant 2N sporophytes

- Looking for new model plants

Pteridofite: hanno una fase gametofitica (n) e sporofitica (2n) separate → come fa il fungo ad essere attivo in

entrambe le fasi?

AMs: an evo-devo perspective

1. AMs managed to persist across one of the major steps of plant development programs: 72

2. There is not a strict organ specificity: not only roots!

3. Some aspects of the colonization process are strikingly uniform: hyphal branching, arbuscules

4. Common molecular and genetic determinants must exist across different plant taxa (caratteri molto

conservati).

The interface: a landmark of the biotrophic interactions: 73

The fungal partners

Appartengono a:

Ancora vero?

Novembre 2015- La lezione di A.Berruti

Che cosa abbiamo imparato dal genome Sequencing project? Tisserant et al 2013; Liu et al 2014

Glomeromycota are related to the Mucormycotina (according to Peyronel, 1922)

J.Spatafora, 2014: fungal phylogenesis on the basis of the Genome sequencing.

I basidiomiceti sono biotrofi e patogeni obbligati (perché gli mancano funzioni metaboliche), molto specializzati, non

si possono coltivare senza la pianta associata.

Questi funghi non hanno una riproduzione sessuale (o meglio, non è mai stata osservata). Sono eucarioti, ma hanno

una riproduzione puramente clonale, come mai non si va verso un impoverimento? Forse semplicemente non è

ancora stata trovata la via di riproduzione reale. 74

AM fungi are one of the most widespread component of the plant microbiota:

Multigenomic organisms vs homogeneous mycelia

The nature of AMF:

Secondo Beniamino Peyronel: Phycomicetoid fungi = Zygomycetes-related

Identificazione: caratteristiche morfologiche e sequenze di DNA

Some unusual features of the AMF biology:

- Obligate biotrophs

- Coenocytic mycelium (can anastomose and

exchange genetic material)

- Asexual (sexual phase not known; no single

nucleus stage during the life cycle)

- Spores and hyphae are multinucleated and

present a high genetic variability

o Homokaryotic (Pawlowska & Taylor, 2004)

o or Heterokaryotic? (Kuhn et al, 2001; Hijri 75

& Sanders, 2005; Bever & Wang, 2005)

- Species, communities, individuals difficult to

be defined

Some unique biological features of AMF:

- A sexual phase has not been described (but mating type related genes are present…..

- Obligate biotrophs

- Multinucleated structures

AMF spores exhibit unique features:

- Ca. 200 described morpho-species

- Limited evidence for recombination: ancient asexuals?

- AMF, unlike all other known eukaryotic organisms, possibly lack the

genetic bottleneck of a single-nucleus stage

[Sanders & Croll (2010) Arbuscular Mycorrhiza: The Challenge to Understand the Genetics of the Fungal Partner. Annual Reviews of Genetics

44: 271-292; Pawlowska (2005) Genetic processes in arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Letters 251: 185-192]

Funghi multinecleati:

- Che natura hanno questi nuclei?

- Esistono fasi in cui c’è un solo nucleo?

Suggerimenti e ipotesi sulla diversità genomica dei funghi

Ciò che sappiamo sul ciclo di vita dei funghi suggerisce che potrebbe esserci diversità genetica anche tra i nuclei di un

singolo isolato. Diversamente dalla maggior parte degli organismi, non è presente nessuna fase del ciclo in cui

l’organismo si sviluppa a partire da un singolo nucleo. Quando si forma una spora, più nuclei si spostano dall’ifa al

suo interno , quindi la spora porta con sé un campione della popolazione di nuclei che sono mescolati nel citoplasma.

Non essendoci uno step a singolo nucleo che resetti la diversità a zero, possiamo aspettarci che le differenze siano

costruite tra i nuclei che condividono la stessa rete ifale, e che questa diversità venga perpetuata tramite le spore. In

effetti, i nuclei si comportano più come una popolazione che come un singolo individuo.

Live cellular imaging of AMF. Spore of G. diaphanum visualized by confocal microscope showing 208 nuclei stained

with SytoGreen dye [BMC Evol Biol. 2011; 11: 51. M Hihri] 76

77

1. Versione omocariotica → più accreditata; tutte le spore che si formano sono tutte uguali

2. Versione etecariotica → in questo caso nella progenie si trovano nuclei diversi, popolazioni diverse.

Come sono questi nuclei? Uguali ? Diversi? A still open question…

The reproductive mode of AMF and organization of genetic variation in these organisms remain elusive:

Nella formazione delle spore I nuclei migrano dalle ife adiacenti.

Come si genera la biodiversità in una popolazione clonale? I modi in cui si possono generare le diversità dei nuclei: 78

P. Young 2015

(a) Anastomosi funghi → cioè i funghi nel suolo possono anastomizzare con altri funghi: scambio di nuclei =

origine biodiversità.

(b) I vari nuclei possono anche mutare; se le informazioni nuove sono deleterie non è un grosso problema

poiché ci sono gli altri nuclei normali, se invece sono utili vengono selezionati positivamente.

(c) Ipotesi che sia la pianta a selezionare la popolazione fungi con i nuclei più vantaggiosi.

(d) Sistema stocastico che seleziona alcuni nuclei (genetic drift) → effetto collo di bottiglia nella formazione

delle spore: i nuclei nella spora non sono diversi per caso, ma per l’effetto collo di bottiglia.

Genomi dei funghi simbionti

But What can we say today??

- Phylogenetic position

- Genome features

- Multinuclear status

- Asexual microbes

- Transcriptomic analysis Figura 2. Francis Martin-INRA.

The genomes of many host plants is

known…

1. The genome sequencing projects of

ECM fungi

2. The genome sequencing projects of an

AM fungus

3. The genome sequencing projects of

endobacteria

4. What we have learnt so far…

Sequenziamento di 1000 genomi:

Glomus intraradices: dal 2004, ancora in corso.

La teoria eterocariotica non permetteva di sequenziare tutto il genoma. L’analisi del trascrittoma indica un numero

di geni molto maggiore a quello aspettato.

SSP = small secreted protein, proteine esclusive della fase simbiotica, sono “effettori” che regolano l’interazione tra

pianta e fungo, inoltre influenzano la trascrizione della pianta ospite.

manca qualsiasi gene che sia in grado di degradare la

parete cellulare → come fa il fungo ad attraversare la

cellula?

Biotrofismo tra fungo e pianta: non c’è bisogno di queste

proteine degradatrici, che porterebbero alla morte della

cellula vegetale, ci vuole un’interazione molto fine.

Probabilmente è il fungo che tramite degli effettori induce

la pianta a rilassare la parete e così il fungo riesce ad

entrare, senza scatenare meccanismi di difesa. Questa

teoria non è ancora stata dimostrata. 79

Nel fungo non c’è nessuna invertasi, quindi il saccarosio

non viene utilizzato così dal fungo, ma è la pianta che

converte lo zucchero e lo rende disponibile per il fungo.

Il fungo ha tutte le capacità di sopravvivere da solo nel

suolo (≠ dai patogeni), e regola molto la sua trascrizione.

Ci sono dei trascritti specifici per l’arbuscolo, non

corrispondenti a nulla presente nelle banche dati.

Why won’t Glomus assemble?

• Substantially larger physical genome size (now estimated to be > 150

Mbp)

• Polymorphism

• This genome shows evidence of being both highly repetitive and

polymorphic, making it very challenging to assemble using a WGS

approach

• Work in progress Activities: Compiling, filtering and assembling all

the new 454 and Illumina genomic sequences 80

Glomus intraradices: No genome? No party! Yes, the transcriptome:

Generation of a set of 25,906 non reduntant virtual transcripts (NRVTs) from germinated spores, extraradical

mycelium (ERM) and symbiontic roots(IRM) using Sanger and 454-sequencing.

Lessons from the G. intraradices transcriptome:

Transcripts for the meiotic recombination machinery but unknown sexual cycle

[

Giovannetti et al 2003]

Transcripts for many membrane transporters As expected…

Transcripts for SSPs as in Laccaria and obligate

Are exclusive of the symbiotic phase biotrophic pathogens

[Kloppolz et al 2011]

Lack of expression hydrolytic

Enzymes acting on plant cell wall as obligate biotrophic pathogens

Polysaccharides

Lack of invertase enzymes no use of sucrose

Unlike biotrophic pathogens, obligate biotrophy in G. intraradices is not associated with Striking reduction of

metabolic complexity (e.g. lack of N and S assimilation pathways), so that the ability to interact with soil

environment is mantained in the symbiotic fungus.

Expression of fungal genes in the intraradical phase: 81

Genome of an AM fungus: a first conclusion

Unexpected difficulties have hampered the

genome assembly of Glomus intraradices. But the

transcriptome analysis reveals some symbiosis-

related genes and give light to a peculiar

evolutionary history of these ancient fungi.

Arbuscule-like structure in the rhizome of

Aglaophyton. 450Mya ago.

MA:

The genome of an arbuscular mycorrhizal fungus provides insights into the oldest plant symbiosis:

Rhizophagus irregularis strain DAOM

- Size of the genome assembly 153 Mb; coding space 98% complete on the basis of conserved core eukaryotic

single-copy genes; 28,232 protein coding genes predicted.

- Genome is rich in A and T bases (A + T content 72%) → no contaminazioni

- Transposable elements (TEs) make up 11% of the assembly

- But -fosmid sanger- much higher TE abundance (36%), including several retrotransposons.

- Retrotransposons are long (9 to 25 kb), highly repetitive and nested: explanation for the observed

fragmentation of the assembly? Hypothetic 55Mbs

- Lack of an efficient elimination mechanism?

- Genome polymorphism: are AM fungi heterokaryotic, i.e. harbour genetically different nuclei ? Neither

segmental duplication nor distinct haplotypic contigs were detected suggesting that the assembled data is

not composed of multiple genomes (non c’è molta differenza da nucleo a nucleo).

[Tisserant et al PNAS 2013, F. Martin INRA‐ Nancy Lin et al 2014] 82

I due gruppi di lavoro hanno ottenuto lo stesso risultato.

Analisi possibili grazie a Illumina NGS e piattaforme bioinformatiche.

Illumina sequencing.

HMW gDNA was high‐molecular‐weight DNA was used to generate libraries for Illumina Sequence by Synthesis

(Illumina‐SBS) genome sequencing using the standard Illumina TruSeq DNA protocol

http://genome.med.harvard.edu/documents/illuminaTruSeq_DNA_SamplePrep_Guide_15005180_A.pdf

Illumina sequencing was conducted using the services of a commercial provider

(GATC Biotech AG, Konstanz, Germany) on a HiSeq 2000 sequencing platform. Illumina sequencing yielded

37,094,828 single end reads of 100 bp length

Genome assembly. All computational genome assemblies were conducted using an Apple Power Mac server (2 x

2.93 GHz 6‐core Intel Xeon with 64 Go DDR3 RAM). Before genome assembly, the sequences were filtered for

adapter sequences, low quality reads and bacterial and fungal contaminants (Fig. S1). Sequences with a GC%>45

were considered as contaminants and discarded (Fig. S20). We then used the CLC Genomic Workbench program v6.0

for the genome hybrid assembly using 30,067,076 filtered reads (3,78 Gb). Parameters were as followed: automatic

word size; bubble size, 50; deletion cost, 3; insertion cost, 3; length fraction, 0.5; mapping mode, map reads back to

contigs; minimum contig length, 1,000; mismatch cost, 2; similarity fraction, 0.8. This genome hybrid assembly, so‐

called Gloin1, resulted in 28,371 scaffolds, ranging in size from 1,000 to 57,883 nucleotides (N50 length of 4.19 kb).

Transposons are ubiquitous genetic elements discovered so far in all investigated prokaryotes and eukaryotes. In

remarkable contrast to all other genes, transposable elements are able to move to new locations within their host

genomes. Transposition of transposons into coding sequences and their initiation of chromo‐ some rearrangements

have tremendous impact on gene expression and genome evolution. While transposons have long been known in

bacteria, plants, and animals, only in recent years has there been a significant increase in the number of

transposable elements discovered in filamentous fungi. Like those of other eukaryotes, each fungal transposable

element is either of class I or of class II. While class I elements transpose by a RNA intermediate and employ reverse

transcriptases, class II elements transpose directly at the DNA level.

Retrotransposons (also called transposons via RNA intermediates) are genetic elements that can amplify themselves

in a genome and are ubiquitous components of the DNA of many eukaryotic organisms. They are one of the two

subclasses of transposon, where the other is DNA transposon, which does not involve an RNA intermediate. They are

particularly abundant in plants, where they are often a principal component of nuclear DNA. In maize, 49‐78% of the

genome is made up of retrotransposons. In wheat, about 90% of the genome consists of repeated sequences and

68% of transposable elements. In mammals, almost half the genom e (45% to 48%) is transposons or remnants of

transposons. Around 42% of the human genome is made up of retrotransposons, while DNA transposons account for

about 2‐3%.

I retrotrasposoni sono elementi mobile del genoma, scoperti da Barbara McClintock nelle piante di mais, in cui si

osservava un fenotipo non stabile (nel mais gene retrotrasposone connesso al pigmento).

AC = activator che fa “saltare” il gene da una parte all’altra.

I retrotrasposoni rappresentano l’11% del genoma dei funghi.

Phytosphora: un tempo classificata tra i funghi, oggi si sa che è imparentata con le alghe. Da un punto di vista

morfologico è molto simile ai funghi, patogeno della patata ecc.

Il genoma è diviso in due parti: una stabile, l’altra mobile. Quest’ultima rende la pianta molto veloce e plastica, può

adattarsi velocemente a molte situazioni. Un frammento di DNA che si

sposta cambia profondamente la

regolazione degli eventi di quel

genoma. 83

Mancano ancora molti frammenti.

Il genoma è molto connesso alla tassonomia, non alla funzionalità. 84

A tyrosine kinase (TK) is an enzyme that

can transfer a phosphate group from

ATP to a protein in a cell. It functions as

an "on" or "off" switch in many cellular

functions. Tyrosine kinases are a

subclass of protein kinase. 85

86

Molti dei geni della categoria arancio sono attivi nella fase simbiotica. Chitina deacetilata → chitosano,

prodotto molto reattivo prodotto dai

funghi e da scarti dei gamberi, usati

come integratori.

Zuccheri, vengono convertiti sotto

forma di glicogeno per riserva (presenza

di glicogeno sintasi più enzimi legati alla

conversione degli zuccheri). 87

Table S9 IMPO! Description: metaboliti importanti, es. tiamina 88

89

The genome of an arbuscular mycorrhizal fungus provides insights into the oldest plant symbiosis:

All living organisms use thiamine, but it is synthesized only in bacteria, fungi, and plants. Animals must obtain it from

their diet, and thus, for them, it is an essential nutrient. Insufficient intake in birds produces a characteristic

polyneuritis. In mammals, deficiency results in Korsakoff's syndrome, optic neuropathy, and a disease called beriberi

that affects the peripheral nervous system (polyneuritis) and/or the cardiovascular system. Thiamine deficiency has

a potentially fatal outcome if it remains untreated. In less severe cases, nonspecific signs include malaise, weight

loss, irritability and confusion.

Thiamine or thiamin or vitamin B1, named as the "thio‐vitamine"

("sulfur‐containing vitamin") is a water‐soluble vitamin of the B

complex.

Single Nucleus Genome Sequencing Reveals HighSimilarity among Nuclei of an Endomycorrhizal Fungus

[Kui Lin1., Erik Limpens2., Zhonghua Zhang3, Sergey Ivanov2¤, Diane G. O. Saunders4, Desheng Mu5, Erli Pang1, Huifen Cao1, Hwangho Cha1,

Tao Lin3, Qian Zhou3, Yi Shang3, Ying Li3, Trupti Sharma2, Robin van Velzen2, Norbert de Ruijter6, Duur K. Aanen7, Joe Win4, Sophien

Kamoun4, Ton Bisseling2,8, Rene ́ Geurts2, Sanwen Huang3,9*]

Nuclei of arbuscular endomycorrhizal fungi have been described as highly diverse due to their asexual nature and

absence of a single cell stage with only one nucleus. This has raised fundamental questions concerning speciation,

selection and transmission of the genetic make‐up to next generations. Although this concept has become textbook

knowledge, it is only based on studying a few loci, including 45S rDNA. To provide a more comprehensive insight into

the genetic makeup of arbuscular endomycorrhizal fungi, we applied de novo genome sequencing of individual 90

nuclei of Rhizophagus irregularis. This revealed a surprisingly low level of polymorphism between nuclei. In contrast,

within a nucleus, the 45S rDNA repeat unit turned out to be highly diverged. This finding demystifies a long‐lasting

hypothesis on the complex genetic makeup of arbuscular endomycorrhizal fungi.

Subsequent genome assembly resulted in the first draft reference genome sequence of an arbuscular

endomycorrhizal fungus. Its length is 141 Mbps, representing over 27,000 protein‐coding gene models. We used the

genomic sequence to reinvestigate the phylogenetic relationships of Rhizophagus irregularis with other fungal phyla.

This unambiguously demonstrated that Glomeromycota are more closely related to Mucoromycotina than to its

postulated sister Dikarya. 91

R. intraradices → manca della via della tiamina, magari questo è il motive per cui non può essere coltivato e lo si

trova solo in associazione. Questo fungo è in grado di assorbire i nutrienti dal suolo e di trasferirli alla pianta. I

patogeni invece non possono assorbire nulla né dal suolo né dall’aria. Sono i meccanismi di trasporto ad essere

diversi tra biotrofo patogeno e biotrofo simbionte. In R.i. mancano i geni per la degradazione della parete cellulare,

la produzione di tiamina e la produzione di tossine.

Superossido dismutasi → coinvolta nel metabolismo delle ROS, porta alla produzione di H2O2 e poi, tramite catalasi,

H2O.

In conclusione: 92

Esperimento:

Gli autori hanno preso 4-5 nuclei e li hanno sequenziati. Risultato: notevole sovrapposizione → teoria omocarionte

più probabile, seppur qualche piccola differenza ci sia (normale).

Lin et al. sequenced the same R. irregularis isolate as Tisserant et al., though a separate subculture that they

designate DAOM197198w. Their study addressed the question of genomic diversity more directly, because they

sequenced four individual nuclei using whole genome amplification, as well as two separate multinuclear samples.

The overall assembly was 141 Mb, comparable to that of Tisserant et al., but the individual nuclear assemblies were

smaller, 71–115 Mb. This does not, however, indicate that the individual nuclei have large deletions, since all

assemblies are incomplete. In fact, the two papers draw strikingly similar conclusions on genomic diversity. Lin et al.

estimate that more than 99.7% of the aligned sequence is identical between nuclei, and overall polymorphism, 0.1

SNP per kb, was even lower than the corresponding estimate by Tisserant et al., though this could reflect differences

in the sequencing and analysis as well as in the biological material. A comparison of the two assemblies gives 8 SNP

per kb, a much larger value, which suggests that these two cultures of the same original isolate may have diverged,

though technical differences in the assemblies might also affect this result.

The two genome papers assert that there is little genomic variation among the nuclei of R. irregularis DAOM197198,

except perhaps at the rRNA locus. On the other hand, it is clear that mycelium containing genetically different nuclei

can be created by anastomosis between different parental lines , and there is persistent evidence that AM fungal

isolates do have internal genetic variation that can segregate, and that subcultures can have different phenotypic

properties . How can we reconcile these apparently in‐ compatible views of the genomic structure of AM fungi?

Peter Young 2015 Current opinion in plant science August 2015

COLONIZZAZIONE

Diverse fasi:

1. Nella rizosfera → segnalazione e riconoscimento

2. Sulla superficie della radice → contatto

3. Dentro la radice → colonizzazione e scambio (Reprogramming of plant cells) 93

1. Signalling events in the rhizosphere

Ci sono scambi di segnali tra pianta

e fungo, in modo che avvenga il

riconoscimento. La pianta emette

strigolattoni, che quando

raggiungono il fungo lo fanno

ramificare e nucleare,

contemporaneamente il fungo

rilascia il myc-factor.

Gli strigolattoni non sono solo

molecole di segnalazione, ma

funzionano anche da ormone.

Ifopodio = struttura slargata con cui

il fungo prende contatto con le

cellule epidermiche della radice.

Myc-LCO (LipoChitoOligosaccaridi) =

4 ologosaccaridi, presente in tracce

minime. I funghi AM rilasciano quindi un cocktail

di molecole bioattive, così come fa la

pianta.

La catena lipidica non si sa bene come

sia prodotta dal fungo.

Dopo che avviene il contatto tra

ifopodio e cellula vegetale, il nucleo di

quest’ultima si sposta vicino alla

membrana nel luogo del contatto, e

comincia la riorganizzazione cellulare

(sintesi di nuova membrana ecc.).

Myc factors stimulate formation of AM

in plant species of diverse families

(Fabaceae, Asteraceae and

Umbelliferae). In the legume Medicago

truncatula these signals stimulate root growth and branching by the symbiotic DMI signalling pathway. These

findings provide a better understanding of the evolution of signalling mechanisms involved in plant root

endosymbioses and will greatly facilitate their molecular dissection.

Conclusion:

Cellular and molecular events demonstrate that plants and fungi dialogue and as a consequence of that the

colonization process proceeds. 94

Gli strigolattoni aumentano la presenza di piante parassite (es. strighe) → per

eliminarle si usa la tecnica del “suicidio controllato”: si fa una prima semina per far

germinare le infestanti ed eliminarle, poi fa l’ultima semina. È colpita soprattutto

l’Africa. Sta cominciando a colpire anche l’Italia.

Queste molecole fanno ramificare il fungo, facilitano quindi l’instaurarsi di

micorrize. Poi si è scoperto che si tratta di ormoni che fanno ramificare la pianta.

Endogeni → ormoni (per la ramificazione)

Strigolattoni Esogeni → essudati radicali (piante parassite e funghi

simbionti)


PAGINE

425

PESO

39.18 MB

PUBBLICATO

+1 anno fa


DESCRIZIONE APPUNTO

MODULO 1
Le interazioni nel mondo del vivente. Varietà e terminologia delle relazioni nutrizionali tra piante e microrganismi. Definizione di simbiosi: simbiosi permanenti e simbiosi cicliche. La simbiosi all’origine della cellula eucariote.
Le simbiosi azotofissatrici. Inquadramento generale e basi biochimiche e dell’azotofissazione. Descrizione delle più importanti associazioni azotofissatrici illustrando per ciascuna di esse le tappe di formazione, il livello di integrazione cellulare, le interazioni metaboliche e gli aspetti
ecologici.
- Noduli radicali delle leguminose. Fase extraradicale e intraradicale. Segnali molecolari scambiati e loro percezione. Processo di organogenesi. Scambi metabolici. Regolazione genica
- Attinorize. Modalità di infezione. Confronto con la simbiosi nelle leguminose
- Associazioni tra piante e cianobatteri. Spettro tassonomico dell’ospite vegetale. Regolazione del differenziamento del simbionte
Descrizione delle più importanti associazioni tra organismi fotosintetici e funghi illustrando per ciascuna di esse le tappe di formazione, i meccanismi di segnalazione, il livello di integrazione cellulare, le interazioni metaboliche e gli aspetti ecologici.
La simbiosi micorrizica. Caratteristiche generali e tipologie micorriziche:
ectomicorrize ed endomicorrize (arbuscolari, delle Orchidee, delle Ericales) ed ectoendomicorrize. Aspetti ecologici del wood-wide-web. Il contributo dei progetti di sequenziamento.
Concetto di microbioma e importanza delle interazioni con le comunità microbiche: dalla salute umana all'ecologia vegetale. Moderne metodologie per studiare la diversità tassonomica e funzionale delle
comunità batteriche e fungine che interagiscono con le piante.

MODULO 2
Interazioni tra piante e organismi antagonisti (predatori e patogeni).
Interazioni tra piante e ambiente, con particolare riferimento al ruolo del microbioma vegetale.
Lettura, presentazione e discussione di dati di letteratura.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia dell'ambiente
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher chiararik di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Interazioni tra piante microrganismi e ambiente e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Bonfante Paola.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Corso di laurea magistrale in biologia dell'ambiente

Ecofisiologia
Appunto