Interazioni ligando macromolecola

Introduzione

La modellistica molecolare è un metodo per studiare dal punto di vista computazionale le interazioni che si instaurano fra un ligando e una macromolecola e le conseguenze che ne comporta. Si possono distinguere due sottogruppi, uno in cui la struttura della macromolecola è nota e uno in cui non è nota. Nel primo caso si possono utilizzare diversi metodi per ricavare informazioni molto diverse:

Metodi di modellistica molecolare

Meccanica molecolare

Permette il calcolo di energie sia delle molecole sia dell'energia di interazione. Questo permette di stabilire quanto un ligando e una macromolecola interagiscono fra di loro e se il legame è favorevole o meno, è quindi possibile stabilire fra più molecole quali si lega meglio.

Dinamica molecolare

È possibile utilizzare i metodi della meccanica molecolare per effettuare uno studio dinamico delle macromolecole ma anche delle interazioni che instaurano con i ligandi. Proprietà istantanee e proprietà medie.

Metodi Monte Carlo

Tralasciano il comportamento dinamico e si concentrano sulle proprietà medie, si cerca un legame fra le singole molecole a livello microscopico e le proprietà macroscopiche (misurabili sperimentalmente, proprietà all'equilibrio), in generale come le singole molecole partecipano a determinare una proprietà macroscopica.

Docking intramolecolare

Permette di individuare la geometria di interazione fra ligando e macromolecola, importante quando si vuole testare l'interazione fra ligando e macromolecola quando non si ha a disposizione la struttura del complesso.

Nel caso in cui la struttura tridimensionale della macromolecola non è nota ma sono note una serie di molecole in grado di interagire con essa determinando lo stesso effetto finale, non è possibile studiare a livello molecolare le interazioni dirette perché non essendo nota la struttura non è possibile ad esempio calcolarne la geometria di interazione e quant'altro. Sono metodi prettamente statistici, fra cui 3D-QSAR.

Struttura macromolecole e PDB

Le strutture delle macromolecole possono essere reperite su PDB, una banca dati che raccoglie tutte le strutture risolte sperimentalmente principalmente attraverso NMR e cristallografia ai raggi X (ultimamente affermando molto anche la cryo-EM). Fondato nel 1976, erano presenti solo 13 strutture, ad oggi ce ne sono 161.000 (150.000 proteine, le restanti sono acidi nucleici o complessi proteina-acidi nucleici). Negli anni si è registrata una frenata nelle strutture risolte tramite NMR, mentre quelle attraverso la cristallografia la crescita è pressoché costante nel tempo. Il vantaggio dell'NMR è che si possono determinare le strutture in soluzione più paragonabili alla situazione reale, il suo problema è dato dalla difficoltà di determinare le varie distanze interatomiche al crescere della dimensione della proteina. Inoltre essendo in soluzione le molecole si muovono (a differenza della cristallografia in cui i movimenti sono molto piccoli), si ottengono quindi una serie di strutture in cui si distinguono zone più strutturate e porzioni della molecola libere di muoversi.

Risoluzione

La risoluzione è espressa in Angstrom, la maggioranza delle strutture depositate hanno una risoluzione di 1.8-2Å. La struttura con risoluzione maggiore ad oggi ottenuta è la crambina, piccola proteina di 48 amminoacidi, risolta con una risoluzione di 0.48Å (impensabile di raggiungere tale risoluzione per molecole molto grandi). Avere una struttura ad alta risoluzione (basso valore di Å), significa che l'esperimento di diffrazione ai raggi X riesce a "vedere" in modo più preciso la distribuzione elettronica intorno ai nuclei della molecola (i raggi X interagiscono con gli elettroni che circondano i nuclei degli atomi). Questo consente di poter posizionare nello spazio i singoli atomi in modo più preciso. Per dirla in termini molto approssimativi, una risoluzione 1Å significa che la posizione di ciascun atomo potrebbe essere sbagliata di 1Å.

Le strutture possono sia essere ottenute direttamente dall'organismo che produce tale proteina sia da organismi modificati. La maggior parte derivano da microrganismi modificati in quanto è molto più semplice ottenerle in grandi quantità.

Homology modeling

Quando la struttura di una proteina non è nota è possibile utilizzare tecniche di homology modeling che consentono di predire la struttura partendo da strutture simili. È quindi necessario conoscere la struttura 3D di diverse proteine simili su cui calcolare la struttura della proteina di interesse. È molto importante una corretta modellizzazione del sito attivo, il resto della struttura può anche non essere riprodotta in modo accurato. In alternativa si possono usare metodi 3D-QSAR in cui, partendo dalle proprietà chimico-fisiche di una serie di ligandi noti che presentano la stessa attività, si possono derivare informazioni complementari sulla macromolecola.

Natura delle interazioni

Due molecole possono interagire fra loro grazie a forze di natura elettrostatica, siano esse attrattive o repulsive, a lunga o corta distanza. Affinché avvenga un'interazione efficace, le forze in gioco devono essere attrattive. Dal punto di vista della macromolecola, sono presenti delle cariche elettrostatiche nette (amminoacidi carichi) o dipoli, ovvero dei gruppi di atomi che generano un dipolo. In linea generale entrambi generano un campo elettrostatico nell'intorno della macromolecola che permette il riconoscimento di un ligando. In particolare si possono distinguere 5 categorie di interazioni:

• Ponti salini: interazioni che riguardano una coppia di cariche.
• Legami H: tipicamente tra un H legato ad un atomo elettronegativo come O e N e un O/N.
• Carica-dipolo
• Dipolo-dipolo
• Dipoli istantanei: categoria non prevista dalla fisica classica ma che discende dalla meccanica quantistica.

Interazioni carica-carica (ponti salini)

Interazioni che avvengono fra macromolecola e ligando che possiedono una carica netta. Tutti gli amminoacidi carichi, Arg, Lys, His, Asp e Glu, possono dare interazioni carica-carica con altri gruppi carichi presenti sul ligando. I singoli o i gruppi di atomi carichi possono essere considerati come delle sfere, che possono avere una carica positiva o negativa. Queste interazioni dipendono dalla distanza (R) fra le due cariche (q) e sono governate dalla legge di Coulomb. Si può quindi definire una forza (F) e un potenziale (V):

In particolare, dal prodotto di due cariche opposte si ottiene una forza (o un'energia) negativa. Questo significa che è stabilizzante e quindi le due cariche tendono ad avvicinarsi e a mano a mano che le cariche si avvicinano questa forza diventa sempre maggiore. Partendo da R=∞ si ha che le cariche sono troppo lontane e non si "vedono", con il diminuire della distanza la forza fra le cariche diventa negativa e queste iniziano ad avvicinarsi fino a quando R=0, situazione irreale in cui le due sfere sono compenetrate e la forza fra le cariche è infinita.

Interazioni dovute a dipoli

Un dipolo è un insieme di atomi in cui si ha una distribuzione non simmetrica delle cariche, questo significa che c'è uno sbilanciamento fra le cariche positive e negative all'interno della molecola o del gruppo di atomi. Si genera quindi un vettore momento di dipolo (μ) dato dal prodotto delle cariche +/- dei centroidi (il centro geometrico) di tutte le cariche +/- presenti nella molecola o nel gruppo di atomi e della loro distanza r:

Se consideriamo il metano (ma è vero anche per CCl₄), in cui sul C centrale è presente una carica parziale negativa e sugli H ad esso legato è presente una parziale carica positiva, esso non è un dipolo in quanto c'è una simmetria nella distribuzione delle cariche e i baricentri dei due centroidi coincidono. Se si considera CH₃Cl (e così anche per CH₂Cl₂ e CHCl₃), essendo il Cl più elettronegativo di H e C, c'è uno sbilanciamento nella posizione del centroide negativo verso il Cl. Il dipolo viene indicato con una freccia che parte dal centroide della carica + verso il centroide della carica -, come indicato nell'immagine che segue.

I dipoli, oltre alla tendenza a interagire fra loro in modo casuale quando si trovano in soluzione in modo da avere interazioni favorevoli (fig. a), possono essere orientati in un campo elettrico in modo che la parte positiva della molecola sia direzionata verso quella negativa del campo. Questo avviene anche in presenza di un campo elettrostatico, se un ligando ha un dipolo questo può essere orientato dal campo elettrostatico che può essere generato da una macromolecola.

I dipoli per dare un'interazione attrattiva devono essere orientati in modo corretto, ovvero affacciando le cariche opposte fra loro, se invece si affacciano le stesse cariche, l'interazione sarà repulsiva. Lo stesso vale quando i dipoli interagiscono con delle cariche nette. Un esempio molto semplice è un sale cristallino (NaCl) che si dissolve in acqua, questo avviene quando le interazioni carica-dipolo prevalgono sulle interazioni elettrostatiche interne al cristallo.

I dipoli, come le cariche nette, possono interagire fra loro e portare a strutture molto orientate nei solidi, parzialmente orientate nei liquidi. Queste strutture, in ogni caso, mostrano un punto di fusione più basso e di ebollizione più alto rispetto a solidi ionici e soluzioni non polari.

Dipoli indotti

I dipoli possono essere indotti in molecole non polari in seguito all'interazione con un campo elettrostatico prodotto da una carica netta o da un dipolo. Questo avviene perché la distribuzione di carica della molecola non polare viene perturbata dalla carica netta o dal dipolo, in termini molto semplici la presenza di una carica positiva attrae gli elettroni della molecola verso di sé generando un dipolo indotto.

Dipoli istantanei (transienti)

È una formazione di dipoli indotti che nasce da fenomeni di meccanica quantistica. Due molecole apolari che non possiedono una separazione di carica al loro interno, possono generare una coppia di dipoli autoindotti dovuti alle fluttuazioni istantanee di carica. Gli elettroni possono muoversi liberamente all'interno della molecola, per questo motivo non si hanno accumuli di carica in una regione di essa. Tuttavia, dato che i movimenti sono liberi, può accadere che per un brevissimo istante si può verificare un piccolo accumulo di carica in una zona della molecola che quindi viene bilanciata dalla molecola adiacente. Questo avviene ad esempio nel benzene, molecola simmetrica in cui i baricentri delle cariche parziali su H e C coincidono e quindi la molecola non ha un momento di dipolo. Tuttavia, le fluttuazioni istantanee di carica generano dipoli autoindotti che portano ad avere una strutturazione della materia a dare un liquido. Altro esempio è dato dalla formazione delle micelle, il core idrofobico interno genera interazioni dovute a dipoli indotti mentre le teste polari instaurano interazioni dipolo-dipolo con l'acqua.

Legami idrogeno

Di fatto è un tipo di interazione dipolo-dipolo, dipolo-carica o carica-carica, tuttavia è utile classificarli a parte in quanto il legame idrogeno è fortemente direzionato nello spazio. Si formano fra atomi di idrogeno legati ad atomi molto elettronegativi con altri atomi elettronegativi. Il caso classico è la molecola d'acqua, in cui gli H possono formare interazioni favorevoli con gli O. Questo determina le caratteristiche chimico-fisiche dell'acqua (altobollente e con punto di fusione alto). I legami H aumentano la coesione fra le molecole e permettono la strutturazione della materia, proteine e DNA in particolare.

Interazioni intermolecolari – forze di Van der Waals

Le interazioni viste finora non tengono conto di una regola fondamentale, gli atomi e le molecole non possono compenetrarsi. Per spiegare al meglio le forze di Van der Waals si utilizza il potenziale di Lennard-Jones, che tiene conto di quello che succede nella realtà quando due molecole si avvicinano nello spazio:

Il secondo termine, quello elevato alla sesta, rappresenta la parte attrattiva dell'equazione, deriva da misurazioni sperimentali e ha un valore fisico ben preciso. Il primo termine rappresenta la parte repulsiva dell'equazione e non può essere derivato da osservazioni sperimentali. Questa equazione, rappresentata dalla curva nera, rende conto di come varia l'energia al variare di r (la distanza fra le due molecole). A distanza infinita, dato che le interazioni sono inversamente proporzionali ad essa, l'energia è nulla. A mano a mano che ci si avvicina a r=0, iniziano ad esserci interazioni attrattive fra le molecole e queste tendono ad avvicinarsi. L'energia quindi continua a diventare sempre più negativa fino a quando almeno una coppia di atomi della molecola si trovano a una distanza talmente corta (r*) tale per cui le forze repulsive prendono il sopravvento su quelle attrattive e determinano un aumento molto rapido dell'energia. Queste forze repulsive sono dovute ai nuclei delle due molecole che si respingono. Il fatto che ci sia un cambiamento del contributo deriva dal fatto che la parte repulsiva è più attiva a distanza ravvicinata, mentre la parte attrattiva è più attiva a lunga distanza. ε indica la profondità della buca di potenziale, ovvero il massimo di energia negativa.

Geometria, forma e PES

Una volta che due molecole si "riconoscono" e iniziano ad avvicinarsi sempre di più grazie alle interazioni elettrostatiche, avviene l'interazione vera e propria. I ligandi, essendo piccole molecole, sono più facili da "manipolare" rispetto a una macromolecola la cui struttura non può essere risolta da soli strumenti computazionali. Conoscendo la topologia della molecola, ovvero come sono collegati fra loro gli atomi, è possibile ricavare delle strutture 3D (geometria molecolare) del ligando. Da questa disposizione discendono tutte le proprietà della molecola, spostando gli atomi nello spazio mantenendo la topologia cambiano anche le proprietà associate. Il riconoscimento fra molecole avviene attraverso la loro forma, non attraverso la geometria. Ci sono rappresentazioni diverse ad esempio la superficie di Van der Waals, di ingombro sterico (indica la superficie oltre la quale non si può andare, in altre parole il volume occupato dalla molecola), elettrostatica (mostra la distribuzione delle cariche all'interno della molecola sopra la superficie di ingombro sterico, rosso negativo e blu positivo), idrofilica-lipofilica (stesse considerazioni della superficie elettrostatica).

In linea generale questo tipo di rappresentazioni danno informazioni di come sono disposte le cariche (piuttosto che altre proprietà) sulla superficie della macromolecola.

Geometrie molecolari

Per geometria molecolare si intende la posizione degli N atomi della molecola nello spazio tridimensionale. La geometria può essere descritta attraverso:

• Coordinate cartesiane: a ciascun atomo viene assegnata una terna di valori x, y e z rispetto a un riferimento esterno (l'origine degli assi). Sono necessari quindi 3N coordinate per N atomi che definiscono la posizione degli atomi nello spazio.
• Z matrix: sistema a coordinate interne, per N atomi sono necessari 3N-6 valori (gradi di libertà della molecola). Il vantaggio in questo caso è che, a differenza del sistema a coordinate esterne in cui traslazioni e rotazioni cambiano i valori di x, y e z, con la Z-matrix se si effettuano delle traslazioni e delle rotazioni i valori non cambiano perché non si ha un cambiamento della posizione reciproca degli atomi. I valori vengono definiti in base a distanza fra gli atomi (stretching dei legami), angoli di legame (bending) e diedri (torsional).

Superficie di Energia di Potenziale (PES)

La PES è una rappresentazione delle geometrie molecolari (conformazioni) possibili, ogni punto della PES corrisponde a una determinata disposizione degli atomi a cui viene associato un valore di energia potenziale. È uno spazio N-dimensionale che dipende dal numero di atomi della molecola, la visualizzazione è possibile solo per N ≤ 2 (molecole biatomiche) o per determinato sottospazio (ovvero fra le 3N-6 coordinate, se ne rappresentano due particolarmente informative ad esempio delle torsioni particolarmente importanti rispetto alle lunghezze del legame e agli angoli di legami, questi ultimi provocano variazioni di energia molto elevati per piccole variazioni mentre le torsioni causano variazioni di energia più piccole). Su questa superficie si possono individuare punti di minimo che rappresentano geometrie stabili, punti di sella che rappresentano geometrie instabili e punti di massimo, ovvero i punti di passaggio fra un minimo e l'altro. Per passare da un minimo a un altro è necessario fornire energia in quanto per uscire da una buca e andare in un altro minimo bisogna passare attraverso conformazioni a energia maggiore. Inoltre, per passare da un minimo a un altro si passa per il cammino a minor energia, nell'immagine è indicato un cammino attraverso un punto di sella, non si passa per il massimo perché richiede troppa energia. Il punto di sella è quindi rappresentato dal punto di massimo di uno specifico cammino intrapreso e il punto di minimo di tutti i cammini possibili per andare da una buca a un'altra.