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Immunologia

Appunti di immunologia basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Dianzani dell’università degli Studi del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro - Unipmn, Interfacoltà, Corso di laurea in biotecnologie. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Immunologia e Microbiologia docente Prof. U. Dianzani

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Recettori che legano il complemento

I batteri si difendono grazie a molecole proprie che inattivano il complemento.

18 T-CELL RECEPTOR

Il T-cell receptor è formato da 2 catene (o e o e costituiti da

 ,  ),

2 domini immunoglobulinici con legami solfuro.

Il recettore è simile a Fab, le cui catene hanno dominio variabile ed

uno costante e 3 regioni ipervariabili per catena.

T cell-receptor non è legato alla trasduzione segnale e si lega sempre

al complesso proteico CD3. Il CD3 è formato da 3 dimeri; senza di

esso i linfociti T non si possono formare perché non possono essere

portati in membrana (SCID –severe combine immunodeficiency).

CD4 (linfociti T-helper; monomero) e CD8 (T

citotossici; dimeno o a volte sono co-

-, -)

recettori che aiutano senza riconoscere

antigene.

Il linfocita T non vede così com’è Ag, ma

questo deve essere presentato da ‘cellule professioniste’ che tagliano in

parti e caricano il peptide sulla molecola MHC (major histocompatibility

complex). Per funzionare in vitro, il processo necessita di linfociti T viventi,

Ag, cellule professionisti viventi.

L’interazione è in realtà complessa: il fulcro è Ag<->MHC<->LinfTHelper,

ma ho molte altre molecole (interazioni accessorie) per funzione adesiva,

segnalazione…Molte molecole biotecnologiche interagiscono con questi

segnali per spostare l’interazione/l’azione in un verso o nell’altro.

Per quanto riguarda i co-recettori, CD4 lega MHC di classe II in una zona diversa da quella legata

all’Ag, mentre CD8 lega le MHC di classe I in un sito diverso da quello di legame all’Ag. I co-

recettori hanno un’azione di intensificazione.

Tutto i legami vengono definiti in toto come SINAPSI IMMUNOLOGICA o SINAPSOSOMA.

19 MHC (HLA DELL’UOMO)

Classe I

Le MHC di classe I attivano i linfociti T citotossici.

Sono costituite da una singola catena di 3 domini tra e 2 è presente una nicchia

1/2/3; 1

funzionale (con fondo di in cui viene presentato l’Ag.

-sheets)

La microglobulina fa da supporto ad e 2: si associa, ma non è una MHC perché proviene da

2 1

un gene/locus diverso e fa anche parte di un’altra molecola. Essendo la nicchia chiusa,

l’Ag/peptide può essere di massimo 8/9 a.a.:il sistema è detto a ‘vol au vent’. Alcuni residui si

legano al fondo di MHC, mentre il resto fluttua nella nicchia, spunta e viene visto dal T-cell

receptor.

La parte C.terminale è tendenzialmente idrofobica.

Nell’uomo sono di tipo HLA A/B/C; ciascuno ha anche decine di varianti alleliche (varianti di gene;

70 varianti per ogni tipo; ce ne sono altri detti ‘non canonici’ che non presentano Ag, ma si

occupano di altro). Le HLA sono evidenti in tutte le cellule nucleate (infatti non ci sono nei globuli

rossi). Classe II

Le MHC di classe II attivano i linfociti T Helper.

Sono costituiti da 2 catene della famiglia MHC, e le funzionali sono e che formano un

 ; 1 1,

dominio trasmembrana ed un piccolo tratto intracitoplasmatico. Anche nella classe II è presente

una nicchia che accoglie un peptide di massimo 8/10 a.a.; più che una nicchia è un solco, che è

aperto da entrambe le parti (‘hot-dog’; aperto).

Nell’uomo sono di tipo HLA DR/DP/DQ (anche qui varianti alleliche e ‘non canonici’).

La classe II si trova solo nelle cellule professioniste.

20 Esperimento

Purificazione di MHCI (h2dd e h2kd) da topo.

Togliere peptidi contenuti per vedere quelli più presentati: dal DD 4 peptidi di 9 a.a. con sequenza

random con posizioni 2, 3 e 9 = (G, P, L/I); da KD sempre peptidi di 9 a.a in posizione 2 e 9 (Y e

V/I).

Esistono dei SITI OBBLIGATI IN OGNI TIPO DI MHC, COLLOCATI IN ZONE diverse. Ci sono di fatto

tanti ‘vassoi’ per presentare diversi peptidi accomunati da parti di sequenza. La varietà di MHC è

sempre nelle nicchie di lato o al fondo.

Essendoci 2 alleli per ogni individuo (2 cromosomi), ci sono 6 varianti di classe I e 6 varianti di

classe II + varianti ibride (mezzo e mezzo) in ognuno: la variabilità è alta, ma ci aiuta a proteggerci

da molti patogeni.

Le MHC influenzano anche la scelta del partner: viene scelto il più diverso possibile grazie

all’impulso olfattivo. Le MHC condizionano la flora del nostro corpo e i recettori olfattivi legano

MHC.

Un esempio importante è quello degli olandesi emigrati, che hanno diversi tipi di MHC rispetto a

olandesi d’olanda. Durante le prime immigrazioni in Sudamerica, gli olandesi furono sterminati da

patologie sudamericane, perché avevano molecole contro i patogeni ‘olandesi’. La popolazione è

sopravvissuta per eterogeneità, che ha permesso la sopravvivenza degli individui più forti per i

patogeni della nuova zona.

I geni per MHC di classe I e II sono molto vicini tra di loro in qualsiasi specie. Nell’uomo si trovano

nel cromosoma 6; la probabilità di un crossing-over è basso. Ciascun genitore trasmette tutto

insieme il box HLA (aplotipo) ricevuto da uno dei nonni. La valutazione dell’aplotipo è uno dei

metodi per lo studio della paternità, con un 10/20% di non corretta paternità.

Una delle scoperte più importanti è che il locus è la causa maggiore del rigetto nei trapianti;

all’inizio veniva definito ‘Ag di istocompatibilità’. Inoltre, molte malattie autoimmuni sono legate a

problemi al riconoscimento sbagliato da parte di MHC (mostrano Ag non pericolosi). Si nota infine

una connessione tra certi alleli di HLA con determinate malattie.

APC (ANTIGEN PRESENTING CELLS)

Le APC sono di fatto 3 tipi di cellule.

Le CELLULE DENDRITICHE derivano dai monociti ed hanno come unica funzione proprio quella di

essere APC, in tutti i tessuti. Le cellule dendritiche assorbono antigeni nei liquidi interstiziali e li

elaborano; successivamente li espongono in molecole di classe I e II. In condizioni normali espone

molecole self e la risposta non si attiva; lo stimolo infiammatorio a seguito di una presentazione di

un Ag non-self la fa maturare, acquisisce motilità e spostarsi verso il linfonodo più vicino, a cui

presenta gli Ag captati. Il linfocita T helper o citotossico si attiva (per attivarli deve sempre

intervenire quindi una APC professionista).

I MACROFAGI fanno anch’essi da APC, pur non essendo specifici, in quanto sono anche adibiti ad

altro.

I LINFOCITI B sono APC molto specializzati, che se attivati dall’Ag si mutano a plasmacellule, che

rilasciano Ab ed in certi casi diventano cellule memoria.

21 Vie di presentazione

La via ENDOCITICA è legata alle MHC di classe II e

presenta Ag captati per endocitosi. La catena invariante

preserva la molecola di MHC (non lega l’Ag). La

vescicola legata all’MHC va nel reticolo endoplasmatico

rugoso, passa nel Golgi per le modificazioni (via via

procede all’acidificazione). La catena invariante viene

eliminata (tranne parte ‘clip’) ed avviene la fusione

dell’Ag con la vescicola.

La via CITOSOLICA riguarda le molecole MHC di classe I

e presenta Ag captati nel citosol. La via avviene sulle

APC e su cellule di tutto l’organismo. Il proteasoma

produce peptidi in maniera mirata modificati poi da

proteasi trimmer. I peptifi proseguono poi nel rer e poi

in membrana.

La via è utilizzata da virus o tumori.

N.B.: i linfociti T citotossici controllano ogni proteina

prodotta dalle cellule: se trovano un non-self o un self

modificato uccidono.

Le vie sono in generale costituite da:

1) Fase afferente: l’Ag arriva nei tessuti linfatici; i linfociti T elaborano la molecola

2) Fase efferente: i linfociti T escono e vanno nei tessuti

Via citosolica

Il proteasoma è un organello che elimina proteine marcate con l’ubiquitina; ha una struttura

cilindrica di varie subunità con attività proteolitica.

I prodotti ribosomiali difettosi meglio captati dal proteosoma sono le proteine non correttamente

foldate. Per esempio, nelle infezioni virali, il 30% delle proteine virali vengono foldate male.

I trasportatori della via citosolica sono i TAP.

Nel corso dell’infiammazione, molti tipi di cellule lo trasformano in immuno-proteasoma (la

creazione è favorita dagli interferoni). La modifica è mediata dagli INF, che inducono l’inserimento

di LMP2/7 e MECL-I. INF-gamma induce PA28, che velocizza il flusso di peptidi processati.

L’organello così modificato lavora più velocemente per mostrare ed eliminare proteine ed è molto

più selettivo: solo i peptidi delle giuste dimensioni si possono caricare sulle MHC di classe I.

L’immuno-proteosoma possiede strutture che non ci sono nei normali proteasoma (ex: pa28, lmp2,

lmp7, mecl-1). I peptidi vengono captati da TAP, che li porta nel rer, dove una MHCI viene

trattenuta dalla calnessina (che aiuta anche complesso globulina), tapasina e calreticolina. Il

-

peptide è caricato e MHC si muove verso la superficie cellulare.

Via endocitica

L’Ab di membrana lega l’Ag, che induce il differenziamento dei linfociti B; l’Ag viene inoltre

endocitato e legato al lisosoma; avviene la scissione in peptidi ed il legame ad una MHCII. Le

molecole utilizzano aiutanti: catena invariante (il clip viene tolto e sostituito con il peptide

endocitato), HLA-DM (permette il rilascio di clip ed il caricamento di peptidi che legano con alta

affinità), HLA-DO (inibitore di dm espresso da cellule epiteliali timiche e linfociti B).

22 Cross-presentazione

Le cellule dendritiche attivate possono fare anche cross-presentazione (presentazione di Ag in

MHC-I): i peptidi endocitati possono essere caricati su MHCII, ma non si conosce il meccanismo.

Sono presenti delle fessure nella membrana dell’endolisosoma ed i peptidi vengono rilasciati nel

citosol forse per proseguire con la via citosolica. Forse, avviene anche la fusione degli

endolisosomi con il rer ed il riversamento del contenuto.

La cross-presentazione avviene anche al contrario, ma in modo meno importante (presentazione di

Ag in MHC-II; autofagia). Altra via

Un’ulteriore via è quella delle microvescicole che nascono dall’estroflessione della membrana

cellulare. Le vescicole vengono caricate di materiale specifico (proteine rare, mRNA, non-coding

RNA) e rilasciate nel microambiente e a distanza. Avviene poi il legame con la cellula bersaglio e il

contenuto viene rilasciato per regolarne l’attività.

La via venne scoperta inizialmente per lo studio sulle cellule staminali (trasformano ex cellule

endoteliali in altro per un certo periodo e possono ad esempio riparare un tessuto).

Non si sa l’importanza in vivo. Via lipidica

I linfociti NK presentano marcatori di membrana NK, ma anche TCR: la loro attività è di tipo

citotossico ed helper (producono

particolari citochine, come

interferon-gamma ed

interleuchina4).

I marcatori NK riconoscono lipidi

di classe I e glicolipidi anziché

peptidi, presentati da CD1 in

membrana; i TCR vedranno i lipidi

antigenici.

Anche in questo caso i lipidi sono

self e non self.

CD1 non è polimorfica (5 varianti

alleliche –a, b, c, d, e).

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Esistono inoltre altri tipi di linfociti T:

- Linfociti T gamma-delta: riconoscono proteine native

- Linfociti T-MAIT (mucosal-associated invariant T cells): riconosce Ag non noti presentati da

MR1 (MHCI related protein).

Il problema delle vie anomale è la difficoltà della tecnica associata all’isolamento dei linfociti T

anomali. Secondo e terzo segnale

Il primo segnale è controllato dall’Ag, mentre il secondo

degnale è di danno, combattimento.

L’APC presenta il peptide, ma per attivare il linfocita T

deve mettere in membrana il segnale di danno. Infatti, se il

linfocita riceve il segnale primario senza il secondo

abbastanza intenso potrebbe anche decidere di suicidarsi.

Il secondo segnale è di vari tipi. Il segnale più conosciuto e

presente solo quando l’APC è attivata è il B7 (espresso su

cellule dendritiche, macrofagi e linfociti B attivati), che lega il CD28 dei linfociti T, espresso da

linfociti T a riposo o attivati.

Il terzo controllo è regolato delle CITOCHINE.

CTLA4 viene espresso da linfociti attivati dopo qualche giorno dall’attivazione. Il linfocita lega B7

dando un segnale negativo; l’affinità è 20 volte superiore rispetto al legame con CD28 (segnale di

attivazione; come recettori DiCoi, con una variante che segnala e una che compete perché non

segnala). Non si sa bene la funzione di CTLA4, ma è sicuro che dia un segnale negativo.

La grande affinità impedisce ai linfociti T di lavorare troppo tempo, anche perché l’effettore senza

patogeno potrebbe diventare autoimmune.

La cellula neoplastica sfrutta CTLA4; negli studi viene utilizzato un Ab monoclonale antagonista

contro la molecola per determinare lo sviluppo di risposta immunitaria (il metodo ha buoni risultati

al contrario di molecole agoniste). I farmaci sono detti immunomodulatori, che sbloccano però

anche cellule autoimmuni purtroppo (alcuni linfociti non vengono controllati da CTLA4 e

sviluppano una malattia autoimmune); ad esempio, esiste il farmaco che riconosce PD1

(mivolmab), con effetti sul 20% dei pazienti di melanoma e adenocarcinoma polmonare.

[Vista di molecole presentate da MHC il linfocita dà una serie di segnali (signaling) su come

combattere l’infezione]

L’APC, oltre ai T Helper, attiva anche il linfocita T citotossico (riconosce la cellula bersaglio, ma non

viene attivata da esso, perché necessita del secondo segnale). Anche per i T citotossici quiescenti

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è necessaria una fase nel linfonodo in cui la cellula dendritica gli presenta il peptide antigenico. La

cellula dendritica può farsi infettare dai virus e presentare con classe I il materiale, oppure fare

cross-presentazione di Ag endocitati (i peptidi possono andare nel citosol ed essere processate con

proteosma), o ancora fare MHC transfer (vescicole con MHC da patogeno si fondono con la cellula

dendritica, le MHC si fondono con la membrana dendritica).

Superantigeni

I superAg vengono riconosciuti da linfociti T e

presentati da MHC delle APC, ma senza

processazione. Basta infatti avere molecole

MHC in membrana.

Il superAg si lega alle regioni della cornice

delle regioni variabili (mettono nella giusta

posizione la zona ipervariabile) e lega la

catena nella regione esterna; il superAg è

legato da tante APC differenti e può essere

riconosciuto da molti TCR.

I superAg sono generalmente batterici

(Stafilococchi: enterotossine enterotossiche SEA/B/C1/2/3 che causano intossicazione alimentare;

Steptococchi: tossina sindrome da shock tossico), ma anche i virus li producono e li mettono in

membrana.

Il sistema immunitario si è evoluto per riconoscere Ag molto frequenti nell’ ambiente microbico,

oppure benefici per il batterio (impara a produrre tossine per sviare risposta immunitaria: ‘falso

bersaglio’).

MATURAZIONE DEI LINFOCITI

Linfociti B

Fase Ag-INDIPENDENTE

I linfociti B derivano da una cellula staminale emopoietica.

Il microambiente midollare invia dei segnali di membrana

(bla4-bicam1, scf e ckit citochine) di maturare come cellula

PRO-B, che arrangia la catena pesante.

Quando anche la catena leggera è riarrangiata, la cellula

diventa PRE-B; se la cellula è giusta, avviene la trascrizione di

un gene e la pre-B viene riempita di IgG intracitoplasmatiche.

Una piccola parte delle catene pesanti sono messe in

membrana e associate a 2 molecole (surrogato della catena

leggera con bassa efficienza). A questo punto inizia il blocco

del riarrangiamento catena pesante ed inizia quello della

catena leggera. Una patologia legata al riarrangiamento è la

Agam-aglobulinemia legata al sesso, a causa della quale non

avviene la produzione degli Ab perché non funziona il segnale

di maturazione e le cellule rimangono Pre-B.

Ciascuna cellula B mette dunque in membrana un Ab diverso,

in grado di riconoscere un certo Ag, che controlla che sia

Immunoglobulina completa. I processi per mettere in

membrana l’Ab sono totalmente casuali; un numero elevato

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di B immaturi ha quindi in membrana un Ab per Ag self, quindi non corretto perché potrebbe date

immunodeficienza. Ciascuna cellula B immatura deve controllare di essere reattiva; per farlo

‘osserva’ l’ambiente midollare e, se riconosce qualcosa, si suicida (controllo negativo). Comunque,

se qualche linfocita B reattivo per il self viene rilasciato (2%) non è pericoloso.

Per il periodo in cui l’Ag iniettato è in circolo, non verrà prodotto il linfocita B con quel determinato

Ab, perché quelli che lo riconoscono vengono uccisi (le cellule B memoria già esistenti restano).

Alla fine della fase Ag-indipendente, la cellula B diventa matura vergine/naive. Sia IgM che IgD

vedono l’Ag, cambia solo la zona costante della catena pesante (IgD ha un ruolo non chiaro).

Fase Ag-DIPENDENTE

I linfocti B maturi escono dal midollo e vanno in circolo. Se negli organi linfocitari secondari

trovano l’Ag a loro corrispondente si tramutano in plasmacellula e cellula della memoria.

Il Riarrangiamento

La posizione delle catene immunoglobuliniche sui cromosomi è molto importante per la genesi dei

linfomi B, ovvero tumori derivati dai linfociti B.

Nell’uomo, la catena si trova sul cromosoma 2, la catena sul 22 e la catena pesante sul 14

 

Nei linfomi avviene la traslocazione dell’oncogene dalla sua posizione ad una zona che codifica per

le catene igG. Se il gene si sposta, il linfocita B, che di solito produce IgG, viene indirizzato a

produrre la proteina per la proliferazione (proteina costitutiva).

Dato che esistono 10^13 Ab diversi, non vale la regola 1gene 1proteina. Il dottor Tonakawa,

analizzando le regioni/locus delle catene pesanti (con Southern Blot), vide una parte del gene in

una cellula non linfocita B, ma fibroblasto; la stessa cellula non possedeva la sequenza per

dominio variabile: l’esone per i domini variabili è presente solo nei linfociti B ed in nessun’altra

cellula.

Le cellule staminali hanno dei frammenti (d, circa 100 v, j), che poi nel linfocita B vengono uniti ad

unico esone per le catene pesanti. La cellula sceglie 1d e 1j e li unisce (dj joining), poi viene scelto

ed unito il v, producendo così l’esone completo VDJ. il joining è un processo complesso, per cui

solo 1/3 dei domini variabili formatosi sono corretti. Nelle catene variabili si osservano frammenti

v e j.

Nella catena avviene un ‘taglia-cuci’,

perché la cellula sceglie casualmente uno

dei frammenti v e uno dei frammenti j per

legarli a C, ottendo l’esone v-j che codifica

per il dominio variabile: il gene è funzionale

(catena pesante e leggera).

Anche nella formazione della catena 

avviene un ‘taglia-cuci’, ma meno

organizzato.

Il processo avviene a livello di DNA (ricorda

lo splicing, ma quello avviene sull’RNA) e si

trasmette alle cellule figlie.

Questa particolare modifica del genoma

consente ad un gene di produrre anche

10^13 proteine. Il riarrangiamento per ora è

stato trovato nel linfocita B (Ab) e nel

linfocita T (TCR).

Il sistema è obbligato (sempre v-j per le leggere e vdj per le pesanti) da sequenze consensus.

Questa variabilità rappresenta solo la metà delle combinazioni possibili (10^6). Il resto è legato al

fatto che, una volta che è stato fatto il taglio, il legame dei ‘monconi’ viene fatto aggiungendo in

mezzo brevi sequenze a caso; RAG1/2 sono appunto ricombinasi, che tagliano e tengono i monconi

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vicini. RAG non unisce subito le parti, ma aspetta l’azione di altri enzimi. Si forma un ponte

fosfodiestere interno tra i due filamenti complementari e quindi una struttura a forcina. ARTEMIS

taglia la doppia elica su uno dei filamenti in modo non preciso. La forcina si apre ed avvengono

mutazioni P. a questo punto il sistema si interrompe per le leggere, ma non per le pesanti. Sulle

catene pesanti interviene anche l’ENZIMA TdT, una polimerasi che non richiede lo stampo, ma

procede con un allungamento casuale di 15basi circa. La sequenza, per essere corretta, deve

essere multipla di 3, ma non essendoci un controllo, il processo è corretto solo 1/3 delle volte (2/3

frameshift). Quando l’allungamento di un allele non viene fatta correttamente, il TdT lavora

sull’altro allele, ma se non riesce a riarrangiare neanche questo, la cellula muore. Le regioni

generate così sono dette REGIONI IPERVARIABILI.

LA VARIABILITA’ COMBINATORIA INCIDE COME QUELLA FUNZIONALE.

Nel riarrangiamento allelico, il primo gene che riesce a produrre la catena funzionante blocca la

produzione degli altri, in modo che ogni cellula abbia una sola catena pesante ed una leggera:

essendoci un Ab, la specializzazione è elevata.

Nella catena pesante, si eliminano tutti i v,d,j non utilizzati nel riarrangiamento, in modo che non

ci sia la possibilità di provare a riarrangiare la seconda volta (raramente avviene editing). Il

processo è diverso per le catene leggere.

La cellula trascrive inoltre un RNA che produce una IgD o una IgM per lo splicing alternativo. Il

dominio variabile viene montato su o su gli Ab prodotti sono diversi ma condividono il sito di

 :

legame dell’Ag.

La cellula B matura, entra in circolo, va negli organi linfocitari secondari muovendosi

continuamente. Se la cellula incontra l’Ag nelle giuste condizioni microambientali si attiva ed inizia

l’espansione clonale (molte cellule figlie).

In base alle indicazioni del linfocita T helper, il linfocita B può prendere due decisioni

differenziative distinte: può diventare plasmacellula, producendo IgM solubili, oppure tramutarsi in

cellula memoria, che riconosce l’Ag a livello del centro germinativo degli organi linfatici in modo

più preciso rispetto alle cellule naive.

Negli organi linfatici avviene lo SWITCH ISOTIPICO: la cell memoria produce la classe

immunoglobulinica ideale per quell’Ag, secondo le indicazioni del THelper e migliora il sito di

legame per l’Ag. Grazie alle mutazioni puntiformi nelle regioni ipervariabili CDR, il sito 100/1000vlt

più preciso, perché riconosce una [] 100/1000 minore.

Linfociti T

Il precursone dei linfociti nasce nel midollo osseo, ma successivamente entra in circolo e,

attraverso recettori, arriva nella corticale timica.

Il processo principale che deve affrontare il TIMOCITA, ovvero il precursore T (le altre sono le cell

epiteliali timiche) e quello dell’aggiunta del TCR.

I TCR hanno variabilità pari a quella degli Ab (10^13) e sono di tipo o (i primi sono i più

- -

comuni e conosciuti e prevalgono perché i secondi non possono essere espressi come pre-TCR, ma

richiede il riarrangiamento di entrambe le catene). Anche qui non vige la regola 1 gene 1 proteina,

ma viene sfruttato il meccanismo per la variabilità delle regioni ipervariabili.

e sono sul cromosoma 14 uno dentro l’altro; e si trovano invece sul cromosoma 7 lontani

   

l’uno dall’altro. La posizione dei loci è importante per generare linfomi T, che, come per i linfomi B,

sono causati dallo spostamento del gene sotto un promotore costitutivo. I linfomi B sono prevalenti

nel mondo occidentale, i linfomi T invece in Giappone.

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Nel TCR la parte più complessa è il riarrangiamento di mentre in è La difficoltà del

-, , - .

riarrangiamento è quella di unire v, d e j nel primo caso e solo v e j nell’altro.

Essendo i geni di e incatenati, all’interno nel primo gene di notano parti d, che appartengono

 

però al gene riarrangiando d viene persa: un linfocita T non può esprimere insieme e

; , - -.

Le DIFFERENZE con gli Ab sono:

- La TdT agisce sulla catena pesante ed anche su quella leggera

- In è possibile che il riarrangiamento di utilizzi più d perché i frammenti disponibili sono

- 

minori rispetto ad (crea vdj, vddj, vdddj…); la variabilità aumenta

- Nel Timo

Il linfocita T arriva dal midollo osseo ed entra nel timo.

Riarrangiamento catena pre- mette in membrana catena accumulo e segnale per

   ,

procedere.

Il pre-T induce oligomerizzazione e trasduzione del segnale, che blocca il primo riarrangiamento e

inizia quello della catena Questo riarrangiamento spesso sfugge all’esclusione allelica, ma uno

.

solo dei TCR espressi dalle cellule con due catene è selezionato positivamente (può legare MHC);

se produttivo, avviene l’eliminazione della parte .

TCR viene posto in membrana. È più marcato il numero di timociti in apoptosi perché non

-

hanno fatto il riarrangiamento.

N.B.: I timociti esprimono bassi livelli di TCR per la selezione positiva (per gli MHC self) e poi alti

per quella negativa (T autoreattivi).

Il linfocita T con il T-cell receptor in membrana non sa in cosa si specializzerà e non sa quindi se

servirà il CD4 o CD8; vengono quindi utilizzati entrambi, ottenendo un timocita doppio positivo

Il timocita interagisce con le cellule epiteliali timiche e prova il proprio TCR, vedendo se si lega a

classe I o II (che sono specifici dell’individuo). La maggioranza dei linfociti T non riconosce le

molecole MHC e muoiono per apoptosi, ma gli altri ricevono un segnale di sopravvivenza

(selezione positiva).

Quando sa cosa riconosce sceglie quale dei CD spegnere. il linfocita diventa singolo positivo. Il

meccanismo di spegnimento è stato pensato a caso fino a poco tempo fa: chi non spegne il giusto

co-recettore muore. Succede perché un po’ il timocita nel processo prolifera; parliamo di cloni, la

cui circa metà spegne il CD giusto.

A questo punto avviene il controllo di non riconoscimento di self. Il controllo negativo avviene a

livello della corticale timica. Le cell epiteliali timiche hanno un sistema di processazione diverso

dalle APC ed esprimovo livelli di MHC-II ancora assemblate a CLIP. Grazie a fattori trascrizionali e

ad un sistema d’espressione ectopica di peptidi self tessuto-sprecifici (AIRE), esprimono appunto

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piccole quantità di tantissime proteine (ex: insulina, che serve solo per il controllo e non va in

circolo).

Anche le APC professioniste (macrofagi, cell dendritiche…) procedono con il controllo negativo,

presentando peptidi periferici ubiquitari.

Dopo il controllo negativo, avviene la completa maturazione a linfociti T vergini citotossici o helper

e l’uscita da timo (solo il 2% passano in periferia) e l’entrata circolo verso organi linfatici

secondari, per lo sviluppo dell’attività.

Uno studio interessante è quello delle ondate del funzionamento timo di TOPO (gestazione di

20gg). All’inizio son soprattutto presenti che poi diminuiscono per far spazio agli in

-, -,

maggioranza poco prima della nascita.

colonizzano tessuti periferici, mentre quelli epiteli tra una cellula e l’altra (IELL –

- -

intraepiteliali-) al 90% (10% -).

Ciascun epitelio è caratterizzato dai suoi linfociti ed è quindi specializzato: la cosa non è visibile

-

nell’uomo. Tuttavia, la funzione dei non è chiara, si sa solo solo che riconoscono l’Ag nativo,

-

piccole cellule batteriche e cellule del tessuto danneggiate.

I linfociti T vengono prodotti in grandi quantità nel primo decennio di vita, poi calano. Il

-

soggetto va avanti con i linfociti T già prodotti. Non è ancora chiaro se il tessuto del timo adulto è

ancora funzionale (meno attenzione negli interventi chirurgici), ma ci sono dei dati che lo fanno

presupporre. I linfociti T sono cellule a lunga vita e durano per anni. Sono inoltre molto precisi,

perché un blando riconoscimento di una molecola self è sufficiente per produrre ridurre il livello di

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proliferazione di quel linfocita. Ad esempio, i topi senza MHC possiedono linfociti T con una durata

minore di vita.

Nel corso della vita il numero di linfociti T rimane sempre lo stesso, l’adulto possiede infatti più

cellule memoria, ma meno cellule vergini e meno capacità di lavorare del timo, quindi una minore

capacità di rispondere a malattie nuove.

Il LINFOCITA T-REGOLATORE PROFESSIONISTA nasce direttamente nel timo dalle cellule epiteliali

timiche, che sono in parte autoreattive, ma non abbastanza da essere considerate pericolose. La

cellula invia il segnale trascrizionale Foxp3 che porta alla maturazione ed allo stesso tempo

inibisce la risposta immunitaria, per evitare problemi derivati da linfociti T che potrebbero

generare malattie autoimmuni.

I linfociti T professionisti sono specifici per ogni cellula del corpo. Pur essendo molto efficienti,

presentano dei problemi e vengono quindi controllati da linfociti T regolatori autoreattivi in

periferia; esiste quindi una tolleranza centrale nel timo ed una periferica dei linfociti T periferici.

Lesioni genetiche di Foxp3 o Aire portano a malattie autoimmuni contro tanti organi diversi molto

sensibili all’endocrino. Questo tipo di malattie autoimmuni sono dette MONOGENICHE e sono

estremamente rare.

Lo sviluppo dei LINFONODI dipende dall’attività della LTα (TNFRI) e soprattutto LTβ (LTβR),

prodotta dalle Lymphoid Tissue Inducing cells (LTi) di origine emopoietica (fegato fetale).

In caso di sbagliata germinazione dei follicoli linfatici (AICOS), si va incontro ad

ipogammaglobulinemia e mancato sviluppo dei linfociti.

I linfociti B sono attratti nelle aree B da parte della chemiochina CXCL13, prodotta dalle cellule

follicolari dendritiche (FDC), che lega CXCR5.

I linfociti T sono attratti nelle aree T da parte di CCL19 e CCL21, prodotte dalle cellule dendritiche

interdigitate edalle cellule endoteliali delle HEV, e produce una chemiochina che lega CCR7. La

secrezione delle citochine da parte dei TH è polarizzata.

La memoria immunologica

All’arrivo dell’Ag, inizia un’organizzazione che porta alla formazione del centro germinativo.

Si forma infatti il CONIUGATO B-T. Il B riceve segnale 1 dall’Ag ed il 2 dal linfocita T attivato; il

secondo segnale è mediato per esempio dalla CD40 del linfocita B e

dalla CD40L del linfocita T.

Il linfocita T sta riconoscendo lo stesso Ag che lega la cellula B, che gli

è stato presentato da una APC. L’interazione che avviene è sempre

specifica (riconoscono lo stesso complesso Ag; potrebbero anche

riconoscere 2 parti di uno stesso

batterio). Tra le superfici c’è

un’intercapedine, dove avviene

tutta la secrezione (localizzata e

direzionata verso lo stimolo).

Grazie a questo processo si sviluppa la MEMORIA

IMMUNOLOGICA, generata appunto nei centri germinativi dei

linfonodi.

Se scompongo la risposta primaria, si nota una prima ondata di

IgM seguita da un’altra di un’altra classe immunoglobulinica.

La seconda risposta è rappresentata da un’impennata della

curva, in quanto il tempo di latenza è più breve. La risposta più evidente è quella più specifica,

mentre la risposta IgM è più blanda e lenta.

IgG ha un’affinità per Ag migliore di quella della risposta primaria (lega a [] più basse) e si può

procedere con la maturazione dell’affinità.

30 Maturazione d’affi nità

Gli nzimi AID (activation induced cytidine deaminase= da citosina ad uracile) e UNG (uracil DNA

glycosylase; rimuove uracile dallo scheletro di DNA, creando un sito basico ed una mutazione),

funzionano sia nella maturazione di affinità/ipermutazione somatica, che nello switch isotipico (in

questo caso non sappiamo perché, ma se non ci sono si vedranno solo iperIgM.

Dal centroblasto al linfocita B memoria

Il CENTROBLASTO prolifera e smette di mettere in membrana l’Ab. Inizia l’inserimento di errori

nella replicazione del DNA voluti e casuali soprattutto a livello delle zone ipervariabili; di

conseguenza, le cellule figlie, i CENTROCITI, pongono di nuovo in membrana un Ab, ma mutato.

Ognuno dei centrociti ha Ab diverso. Nel centro germinativo dei linfonodi sono presenti cellule

follicolari dendritiche con molti Ag (molti recettori del complemento FCR?) sulla superficie, con i

quali i centrociti provano. Alcuni centrociti, che non sono compatibili e non ricevono il segnale di

proliferazione, muoiono, ma agli altri proliferano (chi meglio riconosce più prolifera) a LINFOCITA B

MEMORIA.

Il rischio in cui si incorre durante la modificazione è l’auto-reattività. Se il centrocita riconosce una

molecola presente non ha bisogno neanche di provare con le cellule follicolari e si sviluppa a

memoria perché riconosce direttamente la molecola: la cosa porta ad una malattia autoimmune.

Per evitare questa possibilità, il sistema si serve dei linfociti T Helper Follicolari, che interagiscono

se il B presenta in membrana molecole MHC con Ab anti-Ag corretti e sviluppa un segnale d’uscita

e maturazione finale. Switch isotipico

L’interazione CD40-CD40L è importante per il

segnale di procedere con lo switch isotipico; le

chemochine danno invece indicazioni a proposito di

che switch fare (ex: allergie).

Avviene un ‘taglia e cuci’ a livello del DNA.

Il linfocita T Helper da un segnale di necessità di

produzione di IgG1. Vengono quindi individuati gli

esoni v d j da incollare vicino a per produrre la

1

catena pesante.

31

La creazione sfrutta la regolazione consenso ed il macchinario di switch: avvicina le due zone e

taglia. Il DNA intercalare forma un DNA circolare che viene estruso, mentre una ligasi lefa le altre

parti. La cell B produrrà IgG1.

Lo switch è irreversibile, e la cellula B non può tornare a produrre IgM. Tuttavia, se sono ancora

presenti regioni per altre immunoglobuline, la cellula può effettuare nuovi switch isotipici, da cui

non può però tornate a IgG1.

Le risposte T dipendenti ed indipendenti

Le risposte T dipendenti non si verificano senza il linfocita T.

Solo il 20% di risposte sono B TIMO-INDIPENDENTI (2 categorie), quindi senza

l’aiuto del T Helper. Il meccanismo indipendente è utilizzato per Ag molto

complessi, con molti siti di legame, tra cui quelli per CD40 (2 segnali = non

serve l’Helper). Senza l’aiuto del linfocita T Help tuttavia, non avvengono

funzioni accessorie, come la maturazione di affinità e lo switch isotipico.

La maggior parte dei linfociti B sono di tipo 2, ma esiste anche il tipo 1, legato

alla leucemia linfatica di tipo cronica e che hanno un marker CD5.

I linfociti B1 si trovano nel peritoneo e nella pelvi e riconoscono Ag microbici,

ma con poca variabilità antigenica. Probabilmente riconoscono anche la flora

intestinale. Non fanno switch o maturazione.

Nella zona marginale della milza sono ance presenti cellulle con marker CD1, che potrebbero

essere i primi interattori nei confronti delle setticemie (controllo dei patogeni nel sangue).

Regolatori

Nella risposta immunitaria intervengono meccanismi terzi/esterni, per controllare che il T non si

attivi o si spenga in tempi rapidi:

- RECETTORI PER L’Ag: il Linfocita T quiescente viene ristimolato (1mg/ml di Ab anti-T). Dopo

5gg viene ristimolato in maniera molto blanda (0,1), perché altrimenti andrebbe in apoptosi

(=AICD= activation induced death cell. meccanismo per mettere fine alla risposta da parte

di cellule vecchie)

- RECETTORI INIBITORI: CTLA4 lega B7 e si assiste a spegnimento per competizione con

CD28; FAS e PD1 sono recettori del checkpoint immunitario. Ci sono farmaci che bloccano

questi punti, ovvero bloccano lo spegnimento della risposta immunitaria, magari dovuta al

tumore, però sbloccano anche la risposta autoimmune.

- CELLULE REGOLATORIE: T regolatori…

FAS è un induttore di apoptosi presente in tutte le cellule ed attiva le caspasi, enzimi che attivano

la cascata apoptotica.

I linfociti T quiescenti presentano FAS non funzionante. Se viene

attivato, per qualche giorno resta inattivo, ma poi se trova Fas-L

nel contesto infiammatorio (spesso in tumori –

immunoillusione-), avviene la morta dello stesso linfocita

citotossico.

Una patologia legata a FAS è ALPS, la sindrome

autoimmune linfoproliferativa. La patologia è

caratterizzata dall’accumulo di linfociti in organi

linfatici secondari, quindi da linfonodi ingrossati, a

causa di un difetto dell’apoptosi a seguito di mutazioni

di FAS. Dai linfociti non eliminati possono partire

malattie autoimmuni e tumori.

CTLA4 lega invece B7 in competizione con CD28; il

primo ha un’affinità 20 volte maggiore.

32

Probabilmente non dà segnale negativo, ma solo competizione. È probabile che avvenga la

produzione di sostanze di cellule dendritiche per proliferazione dei linfociti T Regolatori. Può anche

intervenire il TRegolatore stesso (ha tantissimi CTLA4) per impedire al CD28 di interagire con B7.

PD1 è un recettore legato alla ‘programmed death’ ed è evidente nei linfociti T esausti

(invecchiati); trasmette segnali negativi. Questi recettori sono molti nei T Regolatori, ma non

sembra che abbiamo una funzione effettrice. PD1 si lega a PD-L1 a livello dei tessuti infiammati di

ogni cellula, bloccando l’azione linfocitaria, e a PD-L2, presente solo nelle APC professioniste, con

ruolo poco chiaro.

N.B.: la stimolazione dei TCR induce flussi di Ca2+. CD45 inibisce il signaling, CD4 costimola il

signaling. AZIONE LINFOCITI T HELPER

Le citochine

Le citochine sono piccole proteine di 10/20 000 Da, secrete in maniera costitutiva oppure in modo

indotto, nel caso di quelle immunitarie. Le molecole agiscono sul recettore di membrana della

cellula bersaglio.

Le citochine prodotte hanno tipica azione paracrina, ovvero agiscono su cellule nello stesso

microambiente, ma di diverso tipo. Tuttavia, alcune hanno anche azione autocrina o endocrina.

La prima caratteristica delle citochine è la

PLEIOTROPIA: una stessa citochina agisce quindi

su tante cellule bersaglio in modo anche diverso,

in base alle caratteristiche delle cellule su cui

agisce.

La seconda particolarità è la RIDONDANZA: una

stessa azione può essere fatta da più citochine.

Infatti, non ci sono molte malattie derivate dalla

carenza di citochina, perché la funzione della

molecola non presente viene vicariata. Ciò che

invece crea problemi è la carenza di recettori

citochinici, che è paragonabile ad un difetto

pluri-citochinico.

la terza proprietà è la SINERGIA: le citochine lavorano l’una con l’altra, azione che rende il loro

segnale sinergico più forte di quello additivo.

Esempi di citochina sono l’interleuchina 4 e 5, che svolgono la medesima funzione: se lavorano

insieme ne basta poca di ciascuna.

L’effetto contrario è l’antagonismo

(interleuchina 4 e interferone-gamma).

Ci può anche essere una cascata

d’azione.

(sistema molto complesso, interazione bi-direzionale).

La risposta infiammatoria induce uno STORM CITOCHINICO, ovvero la produzione di molte

citochine che si influenzano l’una con l’altra, in modo che sia difficile cambiare la risposta

immunitaria cambiando un unico addendo. Per cambiare la risposta immunitaria devo mettere

tantissima citochina interessata (sindrome dell’endotelio che perde= liquido fuori dal sangue=

shock).

33

L’uso delle citochine in clinica è quindi poco utilizzato. La cosa più comune è invece lavorare con

gli antagonisti delle citochine, per bloccare quelle che non vanno bene trattamenti molto

efficaci ma costosi Recettori citochinici

I recettori sono molecole spesso complesse e multi-catene

assemblate in maniera varia.

Ad esempio, il recettore ad alta affinità per IL-2 è formato

da 3 catene, espresso così completo dal linfocita T

attivato.

Alcuni linfociti esprimono in maniera costitutiva la forma

incompleta solo con e (affinità intermedia), che lega

 

ma con minore affinità (ex: cell NK).

Nel corso della risposta immunitaria viene prodotta IL-2

che, se prodotta in quantità, genera una risposta

immunitaria aspecifica (affiancata a quella antigenica specifica) da parte della NK.

Del recettore esiste anche una forma a molto bassa affinità senza che lega ma non trasduce ed

,

inibisce l’azione della citochina (lega gli eccessi; T regolatori).

I recettori citochinici sono organizzati in famiglie; la più abbondante è quella del recettore per l’IL-

2.

Le citochine hanno componenti utilizzabili da più recettori. Ad esempio, il IL-2R ed IL-15R hanno in

comune e e cambiano in Questo significa anche che una lesione genetica che danneggia

 , .

una componente comune dei recettori per citochine, porta ad una lesione grave per tutte le

citochine, denominata SCID (severe combined immunodeficiency).

La condivisione di catene spiega la ridondanza e l’antagonismo.

Se una delle citochine è molto più elevata (vantaggio quantitativo) prevale, prendendo tutte le

componenti in comune per formare il proprio recettore.

I recettori citochinici sono di classe I, di classe II, la super-famiglia Ig e la famiglia di recettori TNF.

Esiste anche la famiglia delle CHEMOCHINE, ovvero citochine chemotattiche coinvolte nei processi

infiammatori; il loro recettore passa 7 volte dalla membrana e trasduce con G-protein.

Gruppi: CXC (2 cisteine separate da un a.a. qualsiasi), CC (2 a.a. unite), C (solo1) e CXXXC (solo1).

Alla sigla segue un numero progressivo che rappresenta ogni citochina. Per analogia, i recettori

hanno semplicemente la R nel nome. (CCL= ligando= solubile).

La trasduzione del segnale utilizza vie dedicate.

I R per INF-gamma utilizzano tirosine-chinasi JAK1 e 2 STAT 1

IL-4 anche agisce su JAK 1 e 3 STAT 6 (Jak1 è condiviso da molti, quindi, se manca, manca la

funzione di tutte= SCID)

Linfocita T helper/conv (convenzionali)

Questi particolari linfociti sono T Helper effettori, che producono citochine sulla base degli stimoli

ricevuti e del microambiente.

Il Th0 produce IL-2, il principale fattore proliferativo dei LinfT (pensa a riprodursi). A questo punto

Th0 può diventare più cose:

- Th1: produce in modo caratterizzante INF-; helper per la risposta cellulo-mediata di

macrofagi, NK, CTL (il citotossico se supportato è più funzionale)

- Th2: produce IL-4/5/6, ma la 4 è quella davvero caratterizzante; supporta l’attività dei

Linfociti B durante la produzione anticorpale)

- Th17: produce IL-17; supportano i neutrofili

34 - Th9: produce IL-9 (e 19); aiutano gli eosinofili

N.B.: per identificare un Th è anche necessario che

produca fattori trascrizionali.

La cosa più importante nel microambiente che

determina la differenziazione di Th0 sono appunto le

citochine, determinate dalla risposta immunitara.

La differenziazione a Th2 è determinata dalla

presenza di IL-4 prodotta dal mastocita.

Th0 diventa Th1 per presenza di INF- prodotto dai

NK.

[Le citochine contrastano quella contro-laterale].

Per diventare Th9 ci deve essere un’attivazione dei macrofagi, che producono TGF- ed IL-4, ma

non INF-

Per Th17 ci devono essere TGF- ed IL-1.

I patogeni hanno imparato ed utilizzano la produzione di

citochine a propri vantaggio.

Un esempio è la produzione di forme solubili di INF- da

parte di virus per bloccare la risposta infiammatoria.

La lebbra è una forma di infezione tubercolare. Se la risposta non è sufficiente per eliminare i

patogeni, i macrofagi li chiudono in granulomi. Inoltre, aumenta la differenziazione in Th1 e

diminuiscono i Th2 (se aumentano la risposta è sbagliata). La forma lepromatosa è meno

controllata perché non si sviluppano granulomi +++TH2 = sbagliata risposta.

Linfociti T helper regolatori

Regolano la risposta T Helper e bloccano/spengono la risposta immunitaria: sarebbe infatti più

appropriato definirli ‘soppressori’.

I linfociti T REGOLATORI NATURALI nascono direttamente nel timo andando ad interagire con le

cellule epiteliali timiche leggermente autoreattive (FOXP3).

Sono definiti regolatori ‘veri’ ed apparentemente non hanno altri mestieri. Producono anche

citochine immunosoppressorie quali IL-10 e TGF-.

Fenotipo caratteristico: CD4, CD25 e FOXP3 positivi. Inoltre esprimono CTLA4, che induce la

produzione di fattori come IDO, che degrada il triptofano a prodotti che inibiscono la proliferazione

dei T. Producono anche inibizione contatto dipendente, quindi inibiscono cellule bersaglio una per

una toccandole.

Probabilmente inducono anche l’apoptosi.

I linfociti T REGOLATORI INDOTTI sono invece linfociti invecchiati, che smettono di produrre le

proprie molecole specifiche e iniziano a produrre IL-10 e TGF-, inducendo la fase proliferativa. Con

i dovuti stimoli, può tornare ad essere specifico. Non sono ancora stati utilizzabili a scopo

terapeutico e non sono stabilizzati neanche il vitro.

35

Esempi di questa categoria sono TR1 e Th3.

Tante cellule immunitarie, soprattutto i linfociti (CTL, NK, NKT, T-, TFH), possono assumere

attività regolatrice indotta, legata in parte alla produzione di citochine immusosoppressive (IL10 e

TGF-), oppure lavorare sulle cellule immunitarie attivate e non più sui patogeni (Fratricidio).

L’aspetto negativo di questo tipo di cellula è la difficoltà nello studiarli in coltura.

TFH

Sono helper follicolari, ovvero una popolazione assestante. Sono caratterizzati dal fattore

trascrizionale BCL6 e producono IL21. Inoltre, esprimono marker ICOS (max) e CXCR5.

Nel follicolo linfatico guidano la proliferazione dei linfociti B.

CTL

Cellule citotossicche, che uccidono il bersaglio, la cellula self pericolosa, attraverso l’induzione di

apoptosi.

La citolisi può avvenire in vitro, ma è un test molto artificiale perché c’è un bersaglio per 40/100

cellule citotossiche, mentre fisiologicamente le cellule bersaglio sono di più delle citotossiche.

Mentre quindi in vitro le cellule CTL bucano e lisano il bersaglio, in vivo la lisi non si verifica mai,

ma avviene apoptosi.

La CTL si serve di molecole nei granuli citolitici, ovvero perforina ed granzimi, per formare

un’intercapedine tra se stessa e la cellula bersaglio, in cui vengono rilasciate le molecole. La

perforina è uguale al 90% al C9 del complemento ed entrambi si attaccano al bersaglio e

polimerizzano (avviene solo sul bersaglio perché le cell citotossiche hanno molecole specifiche in

membrana), creano un poro che permette l’ingresso dei granzimi (serino-proteasi che attivano le

caspasi, in particolare la 3) che inducono apoptosi.

Altre armi, anche se meno efficaci, sono FAS-L, che lavora su FAS del bersaglio, e TNF-, una

linfotossina che agisce sul recettore del TNF. Il secondo porta a segnali più promiscui perché è

caratterizzato da 2 vie: una attiva disc che si scinde in caspasi 8 e bid; l’altra agisce su

mitocondrio che rilascia citocromo C. Le due vie sono utilizzate anche da cellule non

professioniste.

La cascata apoptotica è sotto il controllo di inibitori (FLIP, BCL, IAPs): non tutte le cellule

dell’organismo sono ugualmente sensibili all’apoptosi.

NK

Le cellule NK non sono né T né B, in quanto non possiedono Tcell R e Ag di membrana.

Sono in grado di ammazzare cellule infettate o malate in modo non Ag specifico, quindi solo

parzialmente selettivo, utilizzando il meccanismo della perforina.

Subito è stata evidenziata la capacità di rilevare le Ig fissate sulle cellule bersaglio in modo non

diretto, ma per intermediazione per Ab. Il secondo meccanismo, che funziona senza Ab, funziona

grazie ai recettori di attivazione (NCR/KIR) e di inibizione (CAR).

La cellula NK esprime contemporaneamente molti KIR e CAR, che riconoscono cose diverse: KIR

riconosce classe I ed il CAR vede la cellula stressata. Il KIR inibisce CAR per lasciare posto al

linfocita T citotossico che valuta cosa la cellula esprime: se riconosce peptidi virali/tumorali,

ucciderà la cellula bersaglio. I virus per non farsi riconoscere tendono ad impedire la messa in

membrana delle MHC classe I, per cui il linfocita T citotossico non riconosce nulla. Se CAR vede lo

stress, ma KIR non vede classe I, la cellula NK induce la sua stessa apoptosi.

Le cellule NK sono una fonte di problema in gravidanza. Se la placenta fosse un organo normale,

essendo del bambino e quindi non-self, il sistema immunitario della madre la riconoscerebbe come

non-self e la eliminerenne (a volte capita). La placenta però non esprime molecole MHC I e le sue

cellule mettono in membrana una MHC I detta HLAG che viene riconosciuta da KIR, ma senza

presentare Ag. Molti virus si sono evoluti per utilizzare questo metodo.

Alcuni CAR riconoscono molte molecole espresse dai patogeni (come toll-like R).

36

KIR per di più riconosce HLAC. NKT

Le cellule NKT hanno attività Ag specifica ed aspecifica; possiedono CD4 o CD8

Le NKT-I= sono seminvarianti, le TCR sono molto poco variabili.

Hanno diverse funzioni e non presentano di MHC (ma su?)

Linfociti T -

Anche questi linfociti hanno diverse funzioni e sono molto abbondanti nel topo, all’interno degli

epiteli.

Si pensa siano la prima linea di difesa.

Tra i ligandi, ci sono piccoli Ag non peptidici e molecole di stress. Alcuni riconoscono Ag presentati

da CD1 e MHC-like. Memoria immunologica

Meccanismi:

- ESPANSIONE CLONALE: crea un esercito di effettori specifici per eliminare il patogeno. Al

termine dell’attacco rimane una cellula memoria molto più preparata rispetto alle cellule

vergini da cui l’esercito è derivato

- Una singola cellula memoria è molto più efficiente di una vergine MIGLIORAMENTO

DELL’AFFINITÀ per l’Ag: ciascun sistema recettoriale viene migliorato

- MIGLIORAMENTO FUNZIONALE del sistema effettore

Nel MIGLIORAMENTO DELL’AFFINITA’, ciò che viene perfezionato è il legame dei Recettori alle

mutazioni dei geni delle catene e Il meccanismo è importante per i linfociti B, perché l’Ab

 .

rilasciato risulta più affinato.

I linfociti T invece non mutano il TCR perché il riconoscimento dell’Ag per T è molto più complicato.

Infatti, l’Ag non self deve essere riconosciuto in MHC self (i maturi sono il 10% di quelli iniziali) ed

è quindi rischioso (possibile perdita della cellula o autoreazione).

I linfociti B possono rischiare perché un T gli impedirà di uscire dal centro germinativo nel caso di

non corretta maturazione o comunque un B autoreattivo da solo non genera malattia autoimmune.

Il T autoreattivo è invece più pericoloso perché non viene controllato e basta da solo per generare

malattia autoimmune.

Di fatto il T non ha bisogno di migliorare il TCR, perché non è solubile. È invece importante che

lavori meglio il sistema recettoriale, quindi ottimizza solo il sistema di trasduzione del segnale.

La cellula vergine aggrega tutte le molecole co-stimolatorie, pro-adesive e di trasduzione: è

necessaria molta E per il complesso recettoriale. Nella cellula memoria il complesso rimare unito e

quindi basterà poco Ag per l’attivazione. Le molecole rimangono unite grazie ai raft lipidici di

membrana (ricchi di colesterolo e presenti in grande quantità nelle cellule memoria; i R lavorano

così insieme).

Per il MIGLIORAMENTO FUNZIONALE, I linfociti B fanno switch isotipico.

Nel caso dei T, in cui non ho switch, la funzionalità della cellula muta a livello di T helper: la cell

memoria permane con quel progetto differenziativo (bias), per una produzione più rapida.

RISPOSTA CONTRO I MICRORGANISMI PATOGENI

Batteri extracellulari TH2, anticorpi

Parassiti extracellulari TH2, anticorpi

Microrganismi intracellulari a localizzazione endosomica TH1

Microrganismi intracellulari TH1, CTL a localizzazione citosolica

37

Asse di risposta eosinofili + TH9 (IL-9)

I microrganismi cercano di non essere riconosciuti= IMMUNOELUSIONE.

Alcuni microrganismi riescono a convivere con l’infettato: è il caso delle infezioni croniche, che non

comportano una riduzione della speranza di vita, anche perché l microrganismo, se uccide l’ospite,

uccide se stesso (auto-limitazione). Un esempio è il virus Ebola il virus dell’infezione del bacio

(Herpes4).

Uno stesso patogeno può utilizzare vari

meccanismi di immunoelusione (ex: HIV li usa

tutti):

- modificazione dell’assetto antigenico

- mimetizzazione nell’ospite

- resistenza ai meccanismi effettori

- modulazione della risposta immunitaria

- utilizzo a proprio vantaggio della risposta

immunitaria (più raro)

Modifi cazione assetto antigenico

Esistono diversi ceppi di patogeno:

Ex: il virus Polio possiede 3 sierotipi (A, B, C) che

danno la stessa malattia, ma sono diversi.

Ex: lo Pneumococco ha 84 sierotipi diversi (i

sierotipi inducono la produzione di Ag diversi non

incrociati)

Ex: il Papillomavirus (difficoltà nel vaccino) porta

a tumore al collo dell’utero

La modificazione dell’assetto antigenito è dovuta

alla VARIABILITÀ GENETICA del microrganismo.

Un caso tipico è quello del virus dell’influenza. Le

proteine più importanti sono HAI (emoglutinina) e

NA (neuroamidasi), che consentono l’entrata del patogeno nell’organismo. Il virus tende ad

introdurre modificazioni puntiformi soprattutto in quelle proteine, cosa che porta alla DERIVA

GENETICA. La proteina continua a funzionare, ma l’organismo ospite la riconosce meno (la

popolazione non è mai comunque inerme).

Ogni 10 anni il virus influenzale cambia molto grazie all’antigenic shift, quando 2 virus si

incontrano in un unico animale. Ex: all’interno del maiale (di maiale ed influenzale) virus ibridi

pandemia grave perché il sistema immunitario umano è inerme (dopo la guerra mondiale, 40

milioni di morti). Conversione genica della glicoproteina

variante-specifica di superficie nel

tripanosoma.

Il picco crolla quando il bersaglio inizia a

produrre gli Ab contro il tripanosoma e la

variante scompare cambio genico

tripanosoma.

Un meccanismo simile è usato per la PILINA

della Neisseria gonorrhoeae.

38 Mimetizzazione del patogeno

il patogeno cerca di mimetizzarsi nell’ospite.

Fase di latenza del virus (herpes, HIV, CMV)

- Toxoplasma gondii: produce una membrana che lo isola

- Plasmodium malariae: si “nasconde” dei globuli rossi (cibo, O2 e protezione da membrana

- globulo rosso; il globulo no ha neanche MHC)

Borrelia burgdorferi e spirocheta della sifilide si ricoprono di anticorpi “inattivi” (malattie di

- Lime/borrelia; zecche)

Alcuni stafilococchi: coagulasi che ricopre il batterio di fibrina

- Inibizione dell’espressione di MHC

- herpes simplex: ICP47 inibisce TAP

o CMV e adeno: MHC-I

o CMV, morbillo, e HIV: MHC-II

o

Il gonococco si lega alla superficie mucosa

-

La malaria è la malattia che fa più morti al mondo, in particolar modo nei paesi poveri. La zanzara

infetta un bersaglio ed inietta una ‘saliva’ infetta di sporozoiti; gli sporozoiti entrano nel fegato ed

iniziano il ciclo vitale intermedio, diventando merozoiti; vengono rilasciati e infettano i globuli

rossi. Quando il globulo non è più fonte di nutrimento, scoppia insieme a tutti gli globuli infettati in

maniera sincrona, causando febbre ciclica.

Intanto vengono prodotti gametociti, che infettano l’intestino della zanzara e vengono così

trasportati. Il problema di trovare una giusta risposta sta nel sapere che organismo colpire. Il

merozoita e il gametocita non possono sopravvivere nel globulo rosso. Lo sporozoita va eliminato

nel suo breve tempo tra la puntura ed l’entrata nel fegato. Si è anche pensato di vaccinare le

zanzare. Resistenza ai meccanismi eff ettori

Inibizione dei fagociti:

- Streptococcus piogenes: la proteina M inibisce la fagocitosi

o Micobatteri: resistenti all’uccisione dopo la loro fagocitosi

o

Inibizione della citotossicità cellulo-mediata: vari virus producono molecole che inibiscono la

- cascata apoptotica della cellula

Inibizione degli anticorpi: le Neisserie producono proteasi che scindono le IgA

- Inibizione del complemento:

- Virus vaccinico: inibitore del C4b

o Herpes simplex: inibitore del C3b

o Pseudomonas: elastasi inibisce C3a e C5a

o Alcuni Gram-: lipide A inibisce lisi

o Modulazione della risposta immunitaria

Modulazione della risposta verso sistemi effettori poco dannosi per il patogeno

- micobacterium leprae: risposta TH1 lebbra tubercoloide; risposta TH2 lebbra

 

o lepromatosa

HIV: nelle fasi finali la risposta è spinta verso TH2 ( AIDS)

o

Produzione di fattori immunosoppressori:

- EBV: BCRF-1 (IL-10-like, attiva fase riparatrice bloccando fare armata)

o EBV, CMV, HIV: infezione e uccisione di linfociti (soggetto suscettibile ad altre

o infezioni)

Produzione di “falsi bersagli”: superantigeni

- Sfruttamento della risposta a proprio vantaggio

EBV: attiva i linfociti B che infetta

- HTLV-1 e HIV: attivano i linfociti T che infettano

-

39 Virus del tumore mammario murino MMTV: tumore ereditario del topo; usa i linfociti B come

- vettore per raggiungere la ghiandola mammaria

Latte materno: intestino del cucciolo (MALT)

o Infezione dei linfociti B: esposizione di un superantigene

o attivazione dei linfociti T: attivazione dei linfociti B infettati

o Migrazione nella ghiandola mammaria: produzione di virus per attivazione linfocitaria

o (amplificazione linfociti B infettate)

Infezione dell’epitelio mammario: tumore mammario

o IMMUNIZZAZIONE

Immunizzazione passiva

Trasmissione all’individuo delle difese già pronte sotto forma di farmaco immunologico.

Trasferimento di effettori dell’immunità specifica (Ab e linfociti T in ceppi sinergici) da un soggetto

immune a uno non immune.

Vengono utilizzati anticorpi da un altro animale detti anti-siero e trasferiti interspecie.

L’immunizzazione passiva può essere utilizzata contro agenti microbici o biochimici (ex: Balto

trasportava siero anti-tossina difterica prodotto nell’animale).

Un esempio dell’applicazione dell’immunizzazione passiva è lo sviluppo del siero antitetanico, ora

prodotto nell’uomo in soggetti già immuni (TetHum). Il siero anti-botulinico è un altro

rappresentate; si trova nelle conserve (viene utilizzato come anti-sieri per ragni ecc –enzimi che

agiscono su meccanismi vitali fondamentali-).

L’immunizzazione passiva naturale è il trasferimento di anticorpi dalla madre al feto.

Immunizzazione attiva o vaccinazione

Induzione mediante l’antigene di una risposta immune attiva in un soggetto non immune.

Inizialmente i vaccini venivano prodotti in organismi in vivo (Pasteur per esempio creò il virus della

rabbia nel cervello di coniglio).

Il vaccino è un farmaco e come tutti i farmaci ha effetti collaterali ed è quindi da somministrare

solo in caso di necessità, ovvero quando i possibili danni sono meno rischiosi rispetto alla malattia

contro cui ci si vaccina.

Inoltre, ogni individuo risponde in modo differente alla vaccinazione: c’è chi risponde meglio ad un

farmaco, c’è chi non deve fare il vaccino perché è già resistente è c’è chi è più soggetto ad effetti

collaterali.

Con i vaccini si osserva un EFFETTO GREGGE. I vaccini non funzionano in tutti nello stesso modo,

alcune persone non vengono protette come altre, ma, se tutti gli altri sono vaccinati e hanno

risposto bene, anche quelli che non rispondono vengono protetti perché non possono essere

infettati.

Più ci sono persone non vaccinate, più c’è il rischio per quelli che non sono ben protetti di

prendere la malattia.

Tuttora non esiste tuttora una sperimentazione di genere o per i bambini.

Il BRACCIO DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA è costituito da una parte umorale (anticorpi) e da una

cellulare (TH1 e CTL): l’organismo sceglie quella migliore per combattere il patogeno.

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La SEDE DELLA RISPOSTA è principalmente il plasma, la placenta o le mucose (ex: MALT).

Per scegliere al meglio la risposta, l’essere vivente studia il rapporto tra i tempi di incubazione e la

latenza della risposta.

Ad esempio, il virus influenzare ha un tempo di incubazione breve (24 ore) a livello mucosale: sarà

quindi più utile una risposta anticorpale di IgA neutralizzanti.

Il virus polio infetta invece gli enterociti (sempre mucosale); contro di esso verranno utilizzati IgA

per impedire l’infezione prima ancora che avvenga, oppure una risposta citotossica, in quanto

dall’infezione alla paralisi passano un paio di settimane (le cellule hanno il tempo di maturare).

Tipi di vaccini

Il virus a MICRORGANISMI INTERI prevede l’iniezione dell’intero patogeno nell’organismo. Tuttavia,

questo viene modificato in modo che non produca la malattia. La modificazione può avvenire in

diversi modi.

Vaccino a patogeno ucciso

Il patogeno viene modificato con il calore, che denatura gli Ag: il sistema non è quindi il migliore

dal punto di vista immunologico.

A seguito del calore vengono utilizzati derivati della formalina e cross-linker chimici/fissativi che

legano le molecole provocando un ‘congelamento’ chimico (le molecole rimangono intatte).

Esempi di vaccini:

vaccino influenzale (si prende il ceppo dell’anno dai primi soggetti infetti)

- epatite A

- primo vaccino polio (Salk-parenterale): vaccino parenterale (non per bocca come fino a

- poco fa; ora si è ritornati a Salk)

rosolia

-

Vaccini a patogeno vivo attenuato

Il microrganismo viene modificato in modo da ridurre la sua capacità infettante, in modo che,

quando iniettato nel soggetto, generi un’infezione blanda e non pericolosa, che viene eliminata dal

sistema immunitario.

I vaccini vivi attenuati sono stati scoperti per caso da Pasteur a seguito di non curanza di alcune

colture.

Il patogeno viene fatto crescere in terreni non propri del microrganismo stesso (ex: il bovis viene

anche fatto crescere in un terreno con la bile, quando di solito cresce in un terreno normale).

Dopo qualche tempo i patogeni sopravvissuti mutano e si selezionano i microrganismi adattati,

quindi non più adatti al loro terreno ideale né all’animale/uomo. Il virus attenuato porterà ad

un’infezione così blanda che il sistema immunitario lo riconoscerà prima che sviluppi la malattia.

Per la modifica si può anche utilizzare un animale ‘improprio’ (ex: polio nel rene di scimmia).

Esempi di vaccini vivi attenuati:

vaiolo

- BCG

- Morbillo

- Parotite

- Polio (Sabin-orale)

-

Il sistema attenuato è migliore perché il sistema immunitario è in grado di leggere meglio un

microrganismo. Tuttavia, c’è una fetta di popolazione per cui il patogeno non è abbastanza

attenuato (il soggetto potrebbe essere immunodeficiente); un caso eclatante è quello della

campagna vaccinale contro la tubercolosi in Africa Centrale. Il rischio di questi soggetti è proprio

quello di produrre la malattia stessa.

I vaccini uccisi sono più sicuri e controllati, ma funzionano meno bene.

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Inoltre, il microrganismo attenuato può portare a malattia perché nel corso dell’infezione si

sviluppano retromutazioni casuali che rendono il patogeno virulento (REVERSIONE A VIRULENZA).

Statisticamente succede, anche se è raro (ex: polio, 1:100 000 malato, il virus ha però incidenza

maggiore).

Si cerca quindi di non affidare al caso l’attenuazione: ora si spera infatti che dopo molto tempo in

coltura il virus si attenui (più mutazioni puntiformi= meno rischio retromutazione). Tuttora, i

vaccini vengono anche mutati con l’ingegneria genetica per l’inserimento di delezioni (ex: virus

herpes porcino con Tyr chinasi deleta).

Somministrazione

Virus uccisi:

i macrofagi fagocitano e presentano i virus uccisi del vaccino in classe II

- risposta T Helper (soprattutto TH2)

- richiamo dei Linfociti B

- Produzione di plasmacellule e buona risposta anticorpale. La risposta citotossica manca un

- po’

Virus attenuati:

presentati su classe II o I

- risposta TH e T citotossici

- -risposta completa

-

ex dosi: il vaccino della polio è attenuato, ma necessita di 4 richiami, perché il vaccino protegge da

3 ceppi (A prevale nella prima dose, B nella seconda e C sicuramente nella terza; il 4° è di

controllo).

Il vaccino a virus ucciso possiede un rischio di generare malattie autoimmuni (mimetismo

molecolare), non comunque superiore all’insorgenza della malattia per cui protegge, con cui si

rischia anche l’encefalite.

Ex: il morbillo possiede Ag simili a quelli nervosi e può generare sclerosi multipla.

I vaccini attenuati sono più instabili perché devono essere tenuti in freezer a -80°. Quello ucciso

liofilizzato è molto più comodo a livello di campagna vaccinale, perché più stabile.

Macromolecole purifi cate

Spesso nella produzione dei vaccini non viene utilizzato l’intero patogeno, ma solo un Ag del

microrganismo ritenuto responsabile della patogenicità. Le molecole possono essere:

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- TOSSOIDI o ANATOSSINE

è il caso di Clostridium tetani o botulinum.

Il patogeno viene fatto crescere in anaerobiosi poi ucciso. La tossina tetanica viene quindi

purificata e trattata con i derivati della formalina: L’INATTIVAZIONE CHIMICA crea il tossoide o

l’anatossina.

Dal punto di vista industriale non è sicuro per gli operatori e la sicurezza sul lavoro ha un costo

notevole. Da poco è stata introdotta la modifica del gene della tossina tetanica in modo che

produca già l’anatossina; da quest’ultima viene presa solo la parte recettoriale e non quella tossica

(inattivazione per ingegneria genetica).

- PROTEINE DI SUPERFICIE:

ex: Haemophilus influenzae (problemi in primi anni di vita), Pneumococco, Neisseria meningitidis.

Nel primo caso la protezione proviene dal polisaccaride di superficie dell’emofilo, a cui però i

bambini rispondono male.

I bambini rispondono bene agli Ag timo-dipendenti –T/B-. Per rendere l’Ag timo-dipendente lo

posso coniugare ad una proteina (tetanotossoide).

- MOLECOLE RICOMBINANTI:

il vaccino contro l’epatite B (Ag Au) è stato il primo vaccino biotecnologico (anni ’80).

La pratica risultò difficile dal punto di vista industriale perché il patogeno cresceva solo negli

epatociti, cellule difficili da coltivare. Di conseguenza fu clonato il gene e la proteina

corrispondente venne fatta produrre da un’altra cellula, purificata ed iniettata. In questo modo il

problema è diminuito, ma ora quella problematica è la C.

i vaccini necessitano di ADIUVANTI che li tengano nel giusto posto e per indurre una risposta.

L’adiuvante è un’emulsione di proteine pro-infiammatoria che induce un minimo di necrosi

tissutale e quindi infiammazione.

La risposta è tanto più forte quanto più l’Ag è ritenuto pericoloso dall’organismo.

Le macromolecole sono a meno rischio di autoimmunità,

perché viene utilizzato solo 1 Ag con pochi epitopi. Il rischio

dell’autoimmunità deriva dall’adiuvante perché può far

conoscere anche il self a seguito dell’induzione

dell’infiammazione; il rischio aumenta all’aumentare della

forza adiuvante. Proprio per questi effetti collaterali sono

molti gli studi sugli adiuvanti. (Vd ipersensibilità)

Vaccini di nuova generazione

Vettori ricombinanti vivi

I vettori ricombinanti vengono utilizzati per creare

microrganismi geneticamente modificati.

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Ex: Herpes virus porcino

Ex: l’Anti-rotavirus ha effetti gravi sui bambini (disidratazione a seguito di gastroenterite). Il virus

umano non si riusciva ad attenuare, ma quelli di scimmia danno una risposta blanda nell’uomo. I

due virus però non cross-reagiscono e quindi non davano la risposta giusta. Il virus di virus di

scimmia venne modificato per inserire la proteina di superficie VP7. Il problema del virus

modificato era il rischio d’invaginazione intestinale.

Vaccini polivalenti in matrice solida

L’Ag viene inserito all’interno di una particella carrier che rende il vaccino più efficace.

I carrier possono essere liposomi, micelle o ISCOM (parte esterna idrofobica con detergente e Quil

A; dentro idrofilica per la presenza di proteina; presentazione in MHC I).

L’Ag viene obbligato ad entrare nel citosol delle APC.

Dna nudo

Iniezione di soluzione salina intramuscolo (IM) o intraderma (ID).

La captazione del DNA da parte delle cellule del tessuto può essere incrementata per

elettroporazione, danneggiamento temporaneo delle fibre muscolari con miotossine, soluzioni

ipertoniche di salina o sucroso.

La risposta non è forte come nei vaccini tradizionali. Per aumentare la captazione si utilizza la

GENE GUN, che spara il DNA plasmidico adsorbito su microparticelle di oro o tungsteno all’interno

delle cellule tessutali (minori danni tessutali).

Si utilizza anche l’elettroporazione in vivo: il plasmide viene iniettato sottocute, e viene indotta

una scossa per aprire le membrane della cellula e favorire l’ingresso.

Metodi alternativi:

Aerosol del DNA su superfici mucose nel naso

- espressione di librerie di immunizzazione (somministrazione contemporanea di tutti i geni di

- un dato patogeno)

Vaccino entra, il DNA viene integrato nel genoma ospite ed i geni espressi potente risposta

cellulare con induzione di linfociti CD8+ T MHC I-ristretti e Th1 MHC II-ristretti Induzione di

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie (Facoltà di Farmacia, di Medicina e Chirurgia, di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali) (NOVARA)
SSD:

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ceciliairene96 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Piemonte Orientale Amedeo Avogadro - Unipmn o del prof Dianzani Umberto.

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