Genetica I, prof. Nicolis

Genetica 1 anno accademico 2017-2018

Replicazione DNA

La replicazione è semiconservativa poiché dalla doppia elica di DNA se ne formano due identiche che contengono ciascuna un’elica (detta parentale) appartenente alla molecola di DNA “madre”. L’elica parentale serve da stampo per la sintetizzazione dell’elica complementare a formare la doppia elica finale. In presenza dell’elica stampo, la DNA-polimerasi genera l’elica complementare con direzione 5’-3’. La DNA-Pol2 è sempre indirizzata nel sito di inizio di sintesi da un promotore.

Organizzazione DNA

Il DNA è organizzato in cromatina: DNA complessato a proteine (istoni e fattori trascrizionali). La cromatina è tipica degli eucarioti ed in particolare degli organismi superiori pluricellulari. Una fibra di 10 nm si condensa a darne una di 30 nm che con una successiva condensazione genera il cromosoma. Un cromosoma è una struttura ordinata composta da successive spiralizzazioni di DNA.

Basi cromosomiche dell'ereditarietà

• I geni sono localizzati sui cromosomi.
• Il genoma è la totalità dell’informazione genetica di un organismo.
• Assetto aploide: corredo dato da una copia di tutti i cromosomi (n).
• Assetto diploide: corredo dato da due cromosomi omologhi per ogni tipo (2n).
• Cromosomi omologhi: cromosomi che portano gli stessi geni.
• Gli eucarioti diploidi originano dalla fusione di due gameti aploidi.

Per gli animali pluricellulari e le piante a fiore valgono le seguenti due regole:

• Lo zigote è diploide.
• Il gamete è aploide.

La diploidia è una condizione tipica eucariotica che è apparsa piuttosto avanti nel corso dell’evoluzione. In generale, gli animali sono diploidi mentre le piante presentano spesso casi di tetraploidia o in generale poliploidia.

Meiosi

I gameti sono prodotti per meiosi: un tipo di duplicazione detta riduttiva. La replicazione del DNA avviene sempre in fase S. Le fasi generali della duplicazione cellulare sono: profase-metafase-anafase-telofase. Nella meiosi, una cellula madre (2n) produce quattro cellule figlie (n). Nella prima divisione meiotica, il cromosoma femminile si separa da quello maschile ed inoltre avviene il crossing-over. La seconda divisione meiotica è analoga al processo di mitosi. La meiosi garantisce una enorme variabilità ai gameti: nell’uomo ad esempio le possibili combinazioni genotipiche sono 2²³. La meiosi genera la diversità necessaria affinché la selezione naturale possa agire. Il crossing-over è un ulteriore contributo a questa enorme variabilità.

Allele: forma alternativa di uno specifico gene. Gli oociti sono bloccati in profase I nella donna; solo ¼ delle cellule prodotte dalla meiosi dell’oogonio diventano oociti. Nelle piante a fiore, il gamete femminile è l’ovulo, quello maschile il polline.

Genetica mendeliana

Gregor Mendel ha condotto i suoi esperimenti su Pisum sativum; una pianta con fiori ermafroditi. Mendel scelse sette caratteri ereditabili che si presentavano solo sotto due distinte forme. Attraverso lunghi tempi di autofecondazione produsse delle linee pure. Successivamente incrociò le piante di queste linee pure (f1) e osservò in che forme i suoi sette caratteri si presentavano nella f2. La chiave del successo del suo lavoro è stata fare degli incroci controllati con colture pure così da eliminare qualsiasi disturbo alla trasmissione dei sette caratteri selezionati. Per ciascuno di essi, Mendel osservò che nella f1 se ne presentava solo uno, mentre nella f2 il carattere mancante si presentava in ¼ delle piante. L’alta regolarità dei risultati e l’elevato numero di piante incrociate portò Mendel a sviluppare un modello matematico per spiegare questo fenomeno.

Inoltre, per spiegare il fatto che non si presentavano caratteristiche intermedie, Mendel ipotizzò l’esistenza di fattori fisici, ora noti come geni, che non si mischiavano fra loro e che portavano un determinato carattere. Ciascun fattore (allele) fu chiamato “A” se si presentava in f1, oppure “a” se si presentava per ¼ dei casi nella f2. Mendel ipotizzò inoltre che su ogni gamete ci fosse o A o a.

Dominanza: carattere che si manifesta nella f1 (A).

Recessività: carattere che non si mostra in f1 (a).

Fenotipo: manifestazione esteriore del carattere.

Genotipo: insieme dei due alleli presenti nel genoma.

Test-cross: test in cui si incrociano f1 con f2 per verificare la correttezza delle predizioni dei loro rispettivi genotipi.

Oggi sappiamo che la variante recessiva è spesso generata da una mutazione perdita-di-funzione del gene col carattere dominante. Ad esempio, recenti studi hanno dimostrato come il seme rugoso abbia il gene di sintesi dell’amido, presente anche nei semi lisci, ma che esso sia mutato e pertanto inattivo.

Monoibrido: individuo in cui si considerano gli alleli per un solo carattere. La proporzione dei fenotipi della f2 è A:a=3:1.

Diibrido: individuo in cui si considerano gli alleli di due caratteri. La proporzione dei fenotipi della f2 è: AB:Ab:aB:ab=9:3:3:1.

Triibrido: individuo in cui si considerano gli alleli di tre caratteri.

Omozigote: i due cromosomi portano la stessa variante allelica.

Eterozigote: i due cromosomi portano due distinte varianti alleliche.

Allele dominante: allele che dà lo stesso fenotipo sia nell’omozigote che nell’eterozigote.

Allele recessivo: allele che dà il suo fenotipo solo nell’omozigote.

Analisi statistica

Si usa il test del ^χ (scarto quadratico medio) per la valutazione di H₀: rapporto di segregazione 3:1. Risulta essere ^χ2=^{(O – E)2}/E con un solo grado di libertà. Più grande è lo scarto quadratico medio rispetto al valore atteso e meno è probabile che l’evento sia casuale, e che quindi H₀ sia errata. Si ottiene un ^χ2 = 0,263 che corrisponde a una probabilità 0

Interazione tra geni

Ancor prima della decifrazione del codice genetico, il medico Garrod introdusse il concetto di “un gene – un enzima, un gene – una proteina” a seguito dei suoi studi su malattie congenite (difetti metabolici) che coinvolgevano pazienti omozigoti recanti mutazioni perdita-di-funzione per geni implicati nella codifica di enzimi chiave metabolici.

Esempio: l’albinismo causato dalla mancata sintesi di melanina.

Esempio: fenilchetonuria in cui il gene mutato in omozigosi provoca un accumulo di fenilalanina dato che non è funzionale l’enzima per convertirla in tirosina. Troppa fenilalanina danneggia il sistema nervoso degli embrioni. Oggi il deficit di fenilalanina-idrossilasi è individuato da semplici test ematici prenatali e il deficit si argina con una corretta dieta. I principi mendeliani si estendono all’interazione tra geni.

Complementazione

La complementazione è la comparsa di un fenotipo non mutato dall’incrocio di due individui che presentano la stessa mutazione fenotipica. AA bb x aa BB = Aa Bb, che dà AB, fenotipo selvatico; questa è la complementazione. AA bb x Aa x bb = Aa/AA bb, che dà Ab, fenotipo mutante, la complementazione non avviene. Questo fenomeno avviene quando in una catena metabolica uno degli enzimi coinvolti è danneggiato dalla mutazione del gene che lo codifica: questo provoca un cambiamento del prodotto finale di tale metabolismo. Alleli multipli dello stesso gene non danno complementazione. Mutazioni su geni diversi, coinvolti nella stessa catena metabolica, danno complementazione. Due individui con lo stesso gene mutato si dicono appartenenti alla stessa famiglia di complementazione.

Test di complementazione: questo test permette di verificare se due individui che presentano lo stesso fenotipo aberrante abbiano subito la modificazione sullo stesso gene o su geni diversi. Se l’incrocio tra questi individui produce una f1 normale allora la mutazione è avvenuta su geni diversi coinvolti nello stesso processo metabolico. Ad esempio, aa BB (fenotipo mutante) x AA bb (fenotipo mutante) = Ab Bb (fenotipo normale). Se invece l’incrocio genera una f1 anch’essa mutante significa che i genitori hanno lo stesso gene mutato. Questo fenomeno ha come base la complementazione.

Esempio fiori: dall’incrocio di due fiori bianchi si produce un fiore color porpora. Con la successiva autofecondazione (f1 x f1) si ottengono le seguenti proporzioni: R:B=9:7. Questo risultato non è in accordo con le normali leggi mendeliane. Il risultato è spiegabile soltanto ammettendo che i genotipi aa o bb diano come risultato il fenotipo fiore bianco (fenotipo a o b). Ipotizzando le generazioni parentali come aa B- x A- bb si ottiene una f1 A- B- che presentando gli alleli dominanti A e B produce un fiore rosso. Non è importante sapere di preciso il genotipo della generazione parentale in quanto basta la presenza di un allele A o B per dare fenotipo rosso.

Epistasi

L’epistasi è l’azione di un gene che maschera l’espressione fenotipica di un altro gene.

Epistasi recessiva: l’omozigosi recessiva (aa) con mutazione perdita-di-funzione è la condizione genetica che influenza gli altri genotipi mascherandone gli effetti.

Epistasi dominante: l’omozigosi dominante (AA) con mutazione acquisto-di-funzione è la condizione genetica, assieme all’eterozigosi, che maschera l’effetto di un altro gene.

Esempio topo:

• AA CC (aguti) x aa cc (bianco) -> F1: Aa Cc (aguti)
• F1 x F1 -> F2: 7 non aguti (4 bianco e 3 nero) e 9 aguti. Il rapporto è quindi 9:4:3.

Quando non c’è sintesi di pigmento il genotipo relativamente al gene aguti è irrilevante. Aguti dipende da A (AA/Aa), non aguti dipende da C. In questo caso C è epistatico su A poiché se è presente cc maschera l’effetto fenotipico di A.

Geni duplicati non concatenati

AA BB x aa bb -> Aa Bb (autofecondazione) -> 15 fenotipi A/B, 1 fenotipo a/b. Questo si ha poiché A e B sono geni duplicati su due cromosomi diversi; quindi la sola presenza di A o B dà lo stesso fenotipo. Il fenotipo diverso si ha solo con la doppia omozigosi recessiva aa bb.

Geni duplicati: geni che si trovano su cromosomi diversi che tuttavia avendo una grande omologia di sequenza provocano effetti fenotipici identici.

Codominanza

La codominanza porta nell’eterozigosi alla manifestazione di un fenotipo intermedio rispetto ai due omozigoti. Avviene quando ci sono alleli multipli sullo stesso locus.

Esempio gruppo sanguigno:

• IA/- A, codominante
• IB/- B, codominante
• ii 0, recessivo

Questo perché IA e IB codificano per enzimi che producono gli antigeni A e B. Inizialmente si sintetizza un precursore detto sostanza H: un glicolipide associato alla membrana eritrocitaria. IA e IB codificano per una glicosiltransferasi che aggiunge uno zucchero alla sostanza H. Gli individui ii non possiedono quella transferasi e quindi la sostanza H resta immutata. Questa è la ragione della dominanza di IA e IB su i. Se IA è presente la sostanza H è trasformata in A, se IB è presente invece è trasformata in B. Se il genotipo è IA/IB l’eritrocita presenta entrambi gli antigeni che danno come gruppo sanguigno il tipo AB. L’allele i si è generato a seguito di una mutazione perdita-di-funzione di uno dei due alleli dominanti. In base all’antigene espresso il corpo produce anticorpi contro gli antigeni non espressi, questo è alla base delle classi di compatibilità per le trasfusioni di sangue. Esiste inoltre un gene H, con alleli H o h, che presiede alla produzione della sostanza H. Rari individui hh non producono la sostanza H e generano il gruppo sanguigno noto come “Bombay” che si presenta come un particolare tipo 0. La presenza di hh condiziona qualsiasi altro genotipo del gene I poiché non è presente lo scheletro molecolare su cui i prodotti di I agiscono. Si ha quindi una epistasi recessiva hh (mutazione perdita-di-funzione) su IA e IB. Con il genotipo Bombay è possibile che dall’incrocio di individui con gruppo A e 0 esca una F1 con gruppo AB, la spiegazione risiede proprio nei genotipi: IA/- HH x IB/- hh (fenotipo 0 per epistasi) -> F1: IA/IB Hh che mostra fenotipo AB.

Penetranza: frequenza con cui un dato genotipo dà luogo al suo fenotipo. La penetranza del 100% è detta completa, altrimenti si dice incompleta.

Espressività: grado con cui un genotipo si manifesta in un dato fenotipo (da 0 a 100%).

Gene modificatore: gene che influenza positivamente o negativamente l’azione di altri geni.

Esempio pollo: F- provoca l’arricciamento delle penne. Tuttavia, se è presente il gene mf in omozigosi recessiva l’effetto di arricciamento di F- viene inibito.

Esempio topo: CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) in omozigosi mutato da fibrosi cistica (cftr- / cftr-): questa mutazione perdita-di-funzione incorre per gene knock-out. CFTR codifica un canale ionico di membrana e la perdita del suo prodotto è deleteria in primis per l’epitelio gastrointestinale, il cui danneggiamento è la causa di morte precoce per fibrosi cistica sia nei topi che nell’uomo. Anche l’epitelio polmonare è danneggiato da cftr- / cftr- e questo provoca la proliferazione di batteri patogeni nelle vie respiratorie. Gli scienziati si sono però accorti che in alcuni casi di omozigosi recessiva la sopravvivenza era prolungata, e che questo accadeva in ¼ dei casi di malattia. Si avanzò l’ipotesi che ci fosse un gene modificatore responsabile della sopravvivenza e che esso aveva due alleli: A e A*. Nel caso in cui ci sia omozigosi in A* si ha l’allungamento della vita. Grazie ad un test-cross in F1 (ctfr- ctfr- / AA*) si trovò esattamente la proporzione 1:4 di individui con vita allungata. Successivamente si scoprì che il gene modificatore codifica per un canale Cl alternativo che mitiga il difetto prodotto dalla fibrosi cistica.

Crossing-over e mappe genetiche

Crossing-over: durante la profase I i cromatidi di due cromosomi omologhi si appaiano a formare tetradi in cui si scambiano materiale genetico. Geni sullo stesso cromosoma tendono ad essere ereditati insieme e ciò evidenzia il loro linkage che li rende geneticamente concatenati. Nella meiosi, si può avere il crossing-over a livello dei chiasmi: luogo in cui lo scambio di materiale è avvenuto. La comparsa di ricombinanti genetici è associata proprio a questo evento.

Barbara McClintock studiò il colore (c) e la cerosità (w) delle cariossidi di Zea mays. Incrociò numerosi individui con c e w mutati che si trovano su cromosomi fisicamente alterati, osservabili al microscopio. Questo fa sì che si possa seguire visivamente il prodotto del crossing-over e da queste osservazioni McClintock correlò per la prima volta la ricombinazione con il crossing-over.

Geni concatenati: geni che non segregano indipendentemente perché stanno sullo stesso cromosoma. Questi geni mostrano una concatenazione completa. In questo caso F1 ha solo due varianti genotipiche.

Nella realtà la concatenazione completa è rara. La segregazione di F1xF1 dava una F2 intermedia come risultati tra concatenazione e segregazione indipendente. La F2 aveva rapporti diversi dal mendeliano 9:3:3:1. L’unica classe fenotipica che ha il genotipo univoco è l’individuo doppiamente recessivo che origina solo da gameti recessivi. Dal rapporto tra questi individui rispetto a tutti gli altri fenotipi si può ottenere una frequenza di ricombinazione allelica. Non essendo del 50% (probabilità mendeliana senza crossing-over) si deduce che 50% - x% = frequenza di crossing-over.

Progenie parentale: F1 mostra un fenotipo uguale a quello parentale.

Progenie ricombinante: F1 mostra fenotipi diversi da quelli parentali.

Thomas Morgan studiò D.melanogaster ed in particolare i geni per il colore degli occhi e per le ali:

• pr -> occhio porpora
• pr+ -> wild type occhio rosso
• vg -> ali vestigiali
• vg+ -> wild type ali normali

Inizialmente incrociò due individui omozigoti rispettivamente per pr/vg e per pr+/vg+ a dare una F1 che incrociò ulteriormente con individuo omozigote recessivo pr/pr vg/vg. La F2 presentava 1300 pr+/vg+, 1200 pr/vg e 150 pr+/vg e pr/vg+. Il reincrocio di F1 con l’omozigote recessivo ha il vantaggio che il fenotipo della progenie corrisponde al genotipo del genitore eterozigote.

Il secondo esperimento coinvolgeva geni del cromosoma sessuale X: w (occhio bianco) e m (ali piccole) entrambi in forma mutante rispetto ai wild type w+ e m+. Il primo incrocio fu tra una femmina (wm/wm) e un maschio (w+m+/Y). Nella F1 il maschio non potrà che essere wm (mutante) e la femmina non potrà che essere w+m+ / wm (wild type). L’incrocio F1 x F1 dà come risultato nel 37% dei casi dei fenotipi nuovi con individui con una sola caratteristica mutata.

Il terzo esperimento metteva in rapporto i geni w/w+ con una nuova coppia: y+ (corpo grigio) e y (corpo giallo). Secondo quanto visto nel secondo esperimento ci si aspetterebbe una percentuale di ricombinazione del 37%, tuttavia in questo caso solo 1.3% degli individui era ricombinante. Da questi due esperimenti si deduce che: la frequenza di ricombinanti (p) è caratteristica per ogni specifica coppia di geni.

Associazioni CIS: le due varianti recessive sono sullo stesso gene.

Associazione TRANS: le due varianti recessive sono su geni diversi.

Si ipotizzò quindi che la frequenza di ricombinazione riflettesse la distanza di mappa e che i geni si trovino su una struttura lineare su cui poter misurare la distanza lineare tra coppie.

Dagli esperimenti di Morgan si può dedurre che w e m sono geni lontani, mentre w e y sono geni vicini. Successivamente si introdusse una misura di tale distanza come: 1% ricombinazione = 1 centiMorgan (cM) = 1 unità di mappa (UM).