Esercitazione di laboratorio di microbiologia

Esercitazione di laboratorio di microbiologia

Step di un’indagine diagnostica diretta per sospetta infezione

1. Coltura

Questo step è il principio base di una diagnosi diretta. Sarà una coltura cellulare nel caso in cui si tratti di virus oppure una coltura batterica in agar che fornirà tutti i nutrienti necessari ai microorganismi per crescere, svilupparsi e riprodursi. La coltura ci dà microorganismi vivi e vitali. Esiste poi un metodo chiamato PCR (polymerase chain reaction) che individua “pezzi” di organismo come ad esempio il DNA. È molto veloce ma non fornisce organismi vivi e vitali, solo dei “pezzi”.

2. Colorazione di gram

La differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di peptidoglicano contenuto nella parete cellulare:

• I Gram-positivi presentano amminozuccheri ai quali sono legate corte catene di amminoacidi, che conferiscono stabilità e consistenza a tale strato;
• I Gram-negativi presentano invece una parete più sottile, ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.

I gram positivi si colorano di blu e non di rosso perché nel momento in cui io decoloro, il colorante penetrato dentro la cellula, essendoci una spessa parete batterica, non riesco a decolorare. I gram negativi, avendo una parete sottile, riesco a decolorare e quando poi aggiungo il rosso verranno colorati. I gram positivi assorbono la colorazione blu, i gram negativi assorbono la colorazione rossa.

Verso sul vetrino il cristal violetto, risciacquo, verso sul vetrino il lugol e risciacquo, verso poi l’acetone: a questo punto la parte esterna dei Gram-, costituita da un doppio strato lipidico e lipopolisaccaridi legata al colorante, verrà solvatata dall'etanolo, lasciando lo strato di peptidoglicano sottostante. La parete dei Gram+ invece, formata da uno spesso strato di peptidoglicano, non verrà solvatata e rimarrà legata al cristal violetto, risciacquo e infine verso la safranina.

Nel 99,9% dei casi ci troviamo davanti a batteri gram +/-. Non rispondono a questo metodo:

• Il Micobatterio: bacillo gram variabile;
• Il Micoplasma: aerobi obbligati o aerobi/anaerobi facoltativi, sono le più piccole cellule capaci di vita autonoma (con un diametro di 0,2-0,3 μm) e hanno la particolarità di non essere dotati di parete cellulare; la loro membrana cellulare è lipoproteica trilaminare e ricca di steroli, caso unico fra le cellule batteriche;
• La Leptospira.

3. Osservazione microscopica

In questa fase vado ad osservare forma e colore dei microorganismi, quindi la mia diagnosi viene indirizzata verso un tipo di organismo e con dei test successivi si va a...