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Bioraffinerie

Appunti di Bioraffinerie basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Marinelli dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Bioraffinerie docente Prof. F. Marinelli

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pathway rende possibile l’uso dell’idrogeno come un donatore di elettroni e il

diossido di carbonio come accettore. La CO è ridotta in monossido di carbonio.

2

Questo passaggio è svolto dall’enzima CO deidrogenasi; questo enzima è in

grado di legare il CO e un gruppo metile. L’enzima con adeso il CO lega un

gruppo metile portato da una proteina detta corrinoide. Una volta che si forma

questo complesso, si ha la formazione del legame tra il CO e il gruppo metile. Il

gruppo metile deriva dal metabolismo energetico. In seguito a questo legame

si ha l’immissione di CoA con la formazione di acetil-CoA. L’acetil-CoA è poi

utilizzato per costruire scheletri carboniosi mediante la gluconeogenesi, in cui

si formano composti a 3, 4, 5 e 6 atomi di carbonio al fine di produrre

nucleotidi, amminoacidi, zuccheri strutturali. In questa via sono impiegati due

enzimi: la CO deidrogenasi e l’acetil-CoA sintasi; questi enzimi sono

solitamente uniti in un complesso enzimatico. Questo complesso è molto

studiato in quanto è in grado di formare legami C-C. La monossido di carbonio

deidrogenasi ha un atomo di nichel il quale è in grado di legare gruppi metili.

Questa via è presente anche in altri organismi come i clostridi in cui viene

impiegata come via catabolica.

La metanogenesi è strettamente correlata con la via dell’acetil-Coa.

Ciò lo si è capito usando metanogeni fatti crescere su metanolo marcato.

Quando gli Archea vivono usando il metanolo possiedono già i gruppi metilici

pronti. Il metile è legato alla proteina corrinoide e può essere sia mandato alla

metanogenesi (al fine di produrre energia) sia verso un pathway opposto alla

metanogenesi allo scopo di produrre il gruppo carbonile dell’acetato, ovvero

l’anidride carbonica la quale è usata nella via dell’acetil-CoA (al fine di produrre

monomeri per l’anabolismo).

Metanogenesi

Gli Archaea possono crescere su diversi substrati. Possono crescere sui

substrati più estremi, H + CO , e attuano un modello metabolico che è la

2 2

chemioautotrofia, fissano la CO con la via dell’acetil_CoA, grazie alla

2

monossido di carbonio deidrogenasi, poi possono fare la gluconeogenesi. Per

avere energia e quindi arrivano al gruppo metile che poi viene convertito in

metano.

Quando crescono su metanolo, su una sorgente con un C organico, questo

Cosa succede quando crescono su

permette di capire il metabolismo.

metanolo? Il metanolo si lega alla proteina Corr (corrinoide) e il gruppo metile

deve andare alla metanogenesi, sempre accompagnato dai cofattori tipici della

metanogenesi perché questo è l’unico passaggio in cui si produce ATP, si

utilizza il potere riducente, permette la fosforilazione in anaerobiosi tramite

gradiente protonico e c’è un‘ATPasi che forma una molecola di ATP. L’altro CH 3

fa i passaggi inversi della metanogenesi, sono reazioni reversibili e vanno in un

senso o nell’altro a seconda del substrato. Il metile viene legato alla

Qual è il vantaggio?

metanopterina, poi lo lega al metanofurano e si forma CO .

2

Si produce potere riducente, abbiamo bisogno di energia e di potere riducente

per fare l’anabolismo -> per fare gli scheletri del carbonio. Questi

11

microrganismi altamente specializzati hanno la capacità di andare nei due

sensi.

Nella metanogenesi il donatore di elettroni è l’H e tutto gli steps di questa sono

reversibili tranne l’ultimo che genera l’ATP. Quando si genera CO , si può fare il

2

passaggio successivo -> fissano la CO formano il gruppo carbonilico dell’acido

2

acetico (serve per fare la gluconeogenesi) e la fissano sulla CO deidrogenasi.

Poi la legano al metile che arriva legato alla proteina Corr e poi si forma

acetil_CoA e si ha poi la biosintesi della biomassa.

Il terzo gruppo di microrganismi, che cresce più lentamente tra i metanogeni,

Quando consumano acetato cosa fanno?

sa consumare l’acetato. L’acetato

viene legato ad ATP e CoA ed è già pronto per la biosintesi (gluconeogenesi di

acetato). Questi sono chemioeterotrofi perché usano l’acetato come fonte di

energia e di carbonio. L’acetato si può scomporre sulla CO deidrogenasi, il

gruppo metile viene ripreso dalla proteina Corr e va alla metanogenesi (unico

modo per fare energia), invece il gruppo carbonilico deve essere ossidato, da

CO diventa CO e attraverso questa ossidazione produce potere riducente.

2

Questi microrganismi producono metano e CO . Sono gli unici che producono

2

CO sono i metanogeni che vivono su acetato, sono chemioeterotrofi ->

2

crescono più lentamente perché la quantità di energia libera è più bassa, in più

producono CO perché hanno bisogno di ossidare il gruppo carbonile

2

dell’acetato per produrre potere riducente.

Riassumendo: ci sono dei modelli chemioautotrofi (quando crescono su CO e

2

H ) e chemioeterotrofi quando crescono su acetato. Il punto è il passaggio dal

2

metile al metano, producono sempre il metano, ma ovviamente in differenti

quantità a seconda del tipo di bilanciamento che hanno -> è il prodotto del loro

metabolismo energetico.

I metanogeni rappresentano l’ultimo anello della catena nel digestore

anaerobico. Questi tipi di substrati vengono prodotti dalle fasi precedenti ->

fermentatori primari e secondari. Questi sono in grado di utilizzare dei

monomeri e fare la fermentazione (primaria e secondaria) e fare l’acetogenesi.

Quando prendiamo questi microrganismi fermentanti hanno la capacità di

produrre acidi organici a catena più lunga dell’acetato e dell’etanolo. Cosa

succede quando ai metanogenesi arrivano altri acidi organici a più di 2C?

questi microrganismi non li sanno utilizzare. Invece una buona parte del

carbonio che fluisce nel digestore anaerobico passa attraverso un pool di

Ma

composti (lattato, propionato, butirrato, pool delle fermentazioni primarie).

come vengono convertiti e dove vanno a finire questi acidi organici che non

sono l’acetato? ma come avviene la loro

Si sa che vengono formati dei primari,

conversione in acetato, H e CO ? Non si capiva perché non si isolavano

2 2

microrganismi che sono in grado di fermentare questi composti. Questi

microrganismi non sono coltivabili con le tecniche che conosciamo! Quindi non

riusciamo neanche a classificarli! Sono chiamati microrganismi sintrof, non

sono isolabili con le tecniche classiche della microbiologia. 12

I sintrofi sono stati scoperti prima a livello del DNA e poi si cerca di capire il

metabolismo al fine di poterli coltivare, visto che non possono essere coltivati

nelle condizioni normali.

Rivedendo la situazione del digestore che si sta complicando. Si parte da

polimeri complessi che possono essere i vari scarti agricoli e alimentari, questi

vengono idrolizzati da microrganismi con enzimi idrolitici (idrolisi a monomeri)

-> i monomeri (zuccheri e aa) vengono fermentati, i fermentanti primari

producono acetato, H + CO e una serie di intermedi a catena superiore a 2C.

2 2

l’acetato può essere utilizzato dai metanogeni e dare CH e CO , anche H +

4 2 2

CO può essere utilizzato dai metanogeni (con velocità e rese diverse perché i

2

metanogeni sono favoriti se c’è H + CO perché è una reazione esoergonica, è

2 2

più lenta con l’acetato e poi i metanogeni sono sensibili al pH acido). È un

equilibrio delicatissimo perché ci sono un sacco di acidi in giro, compreso

l’acetato che viene utilizzato più lentamente perché la reazione è meno

favorita.

L’ossidazione degli intermedi ad H + CO e acido acetico non permette la

2 2

produzione di abbastanza ATP. Per isolare questi microrganismi li piastro sugli

intermedi e non si ha una reazione esoergonica -> non si possono isolare con

questi substrati.

Le fermentazioni primarie (da glucosio ad acetato H + CO , a butirrato H +

2 2 2

CO queste reazioni sono esoergoniche. Le fermentazioni secondarie (butirrato

2

ad acetato e H , propionato ad acetato, H + CO , etanolo ad acetato e H ) sono

2 2 2 2

scarsamente esoergoniche. Questi microrganismi non possono vivere senza

qualcuno che consuma i prodotti della fermentazione -> SINTROFIA.

La sintrofa: è una cooperazione metabolica. Il microrganismo da solo non

riesce a vivere, ha bisogno di vivere in accoppiamento obbligato con qualcun

altro, una specie vive grazie alla collaborazione metabolica con un’altra specie,

l’associazione è dipendente da vari fattori. In questo caso l’unione di alcuni

microrganismi permette di metabolizzare un composto che da solo non

potrebbe essere metabolizzato. Nel digestore anaerobico i batteri che

producono acetato e gli Archaea metanogeni sono due gruppi di microrganismi

che devono vivere in sintrofia. I sintrofi hanno bisogno di vivere insieme ai

metanogeni perché gli sottraggono i prodotti di reazione, in questo modo

spostano di poco l’equilibrio della reazione, fanno sì che la reazione avvenga.

Lo spostamento dell’equilibrio di una reazione, da endoergonica ad esoergonica

e viceversa, dipende anche dalla concentrazione dei substrati e dei prodotti,

ma in questo caso le reazioni di produzione e di sottrazione sono presenti in

due microrganismi differenti. Viene sottratto H perché i metanogeni lo

2

utilizzano per produrre potere riducente.

La reale energia liberata dalla reazione dipende dal ΔG° e dipende dalla

concentrazione dei prodotti e dei reagenti. La quantità di ATP che si forma

dipende dal ΔG. Se accoppiassimo una reazione che ha ΔG° positivo (non

avviene in concentrazioni equimolari) se le accoppiamo con reazioni delle

metanogenesi dà che l’equilibrio di reazione produce un processo globale con

13

ΔG° negativo e quindi nel complesso si ottiene un processo esoergonico, per

produrre ATP. Si parla di consorzi di sintrofia obbligati.

L’ipotesi (che poi è stata dimostrata) è che i sintrofi (che producono propionato

e usano acetato) devono vivere in prossimità fisica con i metanogeni perché il

Syntrophobacter

trasferimento avviene con vicinanza fisica. Un esempio è

fumaroxidans, è in grado di metabolizzare il fumarato, ha una forma

bastoncellare che rimane attaccata durante la divisione cellulare e si formano i

filamenti. Sono state fatte delle analisi, come si presenta un grumo di digestore

anerobico, massa informe. Sono stati identificati i microrganismi sintrofi che

sono proprio appiccicati tra di loro proprio per fare l’interazione fisica, per

permettere il trasferimento di idrogeno.

I batteri sintrofi sono fermentatori secondari, sono anaerobi obbligati, formano

spore, sono Gram + con basso contenuto di GC e appartengono alla classe

Clostridia. Sono in grado di ossidare gli acidi organici saturi e insaturi

producendo idrogeno e CO .

2

Wolfei che è in grado di utilizzare il butirrato per produrre acetato H e CO .

2 2

Vive su butirrato e fa delle reazioni inverse della fermentazione classica

acetonbutilica, in questa fermentazione si utilizza il glucosio per produrre

acetato, butirrato, etanolo, acetone. Uno dei prodotti intermedi di questa

fermentazione è l’acetoacetil_CoA poi si hanno reazioni ossidative che

generano potere riducente. Si fanno delle razioni contro gradiente ed è

possibile solo perché si genera H che viene consumato. Butirrato ->

2

butirril_CoA -> crotonil_CoA -> 3-idrossibutirril_CoA -> acetoacetil_CoA. Il

butirrato viene scomposto attraverso 2 steps di ossidazione in acetato.

L’acetoacetil_CoA viene scisso e un acetil_CoA viene utilizzato per produrre

acetato che torna ad essere come cofattore per le ossidoriduzioni necessarie,

invece l’altro acetil_CoA viene utilizzato per produrre acetato attivato e ATP. Se

faccio crescere questo microrganismo sul crotonato che è un prodotto

intermedio riesco ad avere una coltura pura. Utilizzando dei substrati

intermedi, non fisiologici (non è prodotto da nessuno il crotonato). Il

crotonil_CoA verrà in parte utilizzato per la produzione di butirrato (usando H2)

e in parte producendo acetoacetil_CoA (producendo H2). Usando crotonato è

possibile produrre 2 molecole di acetato e una molecola di butirrato, senza

avere intoppi con la produzione di H2.

Consumatori di idrogeno

Archaea metanogenici e batteri omoacetogenici (fanno l’acetogenesi,

producono solo acetato) e batteri solfato-riduttori, questi competono con i

metanogeni per il consumo di idrogeno. Se nell’ingresso dei substrati con dei

composti a concentrazione elevate di solfati il digestore anaerobico non

produce più metano o di pessima qualità. Bisogna stare molto attenti

all’ingresso dei composti solforati. Ma questi substrati sono molto comuni

perché sono ad esempio presenti nei fertilizzanti, quindi vengono utilizzati in

agricoltura. Quando ci sono questi substrati si selezionano dei microrganismi

che sono in grado di utilizzare i solforati. 14

Respirazione anaerobica -> è una forma di respirazione in cui l’accettore

finale di elettroni è un composto diverso dall’ossigeno e diverso dall’intermedio

metabolico organico -> ci sono vari tipi di respirazione anaerobica. Quando il

microrganismo scarica elettroni su CO per produrre metano è una sorta di

2

respirazione anaerobica, solo se guardiamo dove si scaricano gli elettroni,

donatore di elettroni in questo processo è l’H . Usano il solfato come accettore

2

di elettroni e producono acido solfidrico e si usa come potere riducente H ,

2

quindi sono dei competitori con i metanogeni ma “respirano” cose differenti. Il

solfato è un accettore migliore di elettroni del carbonato.

Gli omoacetogenici riescono ad utilizzare H e CO producendo acido acetico,

2 2

cosa molto strana perché quando si parla di batteri che usano questi substrati

parliamo di chemioautotrofia. L’acido acetico è una scomposizione del

metabolismo primario delle fermentazioni primarie. L’acetogenesi è un

processo competitivo con la metanogenesi, in questa ho H O e acido acetico.

2

Bioraffinerie: idea di utilizzare tutte le componenti di una biomassa per usare

tutti i componenti ed essere autosufficienti anche in termini di energia. Si

valorizzano tutte le tipologie di risorse.

Bruciamo le risorse fossili, creiamo CO ma le piante non riescono a

2

fotosintetizzarla tutta perché il bilancio è pesantemente alterato. Il ciclo del

carbonio è molto alterato. Gli scarti delle olive vengono stoccati dopo le prime

due spremiture i contadini le interrano, ma le concentrazioni elevate dei

composti tossici delle olive possono entrare nelle falde acquifere e portare a

danni. Quindi si cerca di togliere da questa biomassa l’alta concentrazione

fenolica -> si manda la frazione da cui hanno rimossi i fenoli nel digestore

anaerobica, quindi in sostanza viene trattata come biomassa. La tecnologia

entra nel momento in cui si cerca di togliere i fenoli.

Consumatori di H 2 L’idrogeno può essere utilizzato dai metanogeni per

fare metano e questo drena tutto il sistema perché

crea lo sbilanciamento che permette la sintrofia. I

metanogeni sottraggono idrogeno al sistema e

permettono ai sintrofi di fare reazioni che non

sarebbero possibili senza la cooperazione

metabolica. Nel digestore anaerobico ci sono delle

competizioni dei metanogeni che sono un anello

Chi compete con i

relativamente fragile. 15

metanogeni? I sulfatoreduttori, questo tipo di respirazione anaerobica, se sono

presenti solfati nelle biomasse viene favorita per lo scarico del potere

riducente. Il potere riducente viene scaricato su SO e si ottiene H S ed è una

42- 2

reazione abbastanza favorita. Questa reazione è favorita rispetto alla

respirazione di CO .

2

Altri competitori: omoacetogeni. Ci sono dei batteri che sono in grado di usare

CO o la sua forma idratata come accettore di elettroni e l’H come donatore di

2 2

elettroni formando acido acetico -> acetogenesi, dal punto di vista dell’energia

rilasciata in ogni reazione non presenta un’elevata quantità di energia libera.

Quando aumenta troppo l’acido acetico i primi che ne soffrono sono i

Clostridia. Clostridia

metanogeni. Batteri della classe I sono chemioeterotrofi

fermentanti obbligati. Questi batteri hanno come base la chemioautotrofia in

alcune condizioni. Tutti i clostridi producono acetato. Fermentazione

acetonbutilica: da glucosio a piruvato, ma non scaricano il potere riducente sul

piruvato, si produce acetato da piruvato usando un enzima particolare e si

parla di reazione fosforoclastica del piruvato, reazione associata ad una

ferrodossina reduttasi e si produce H2. La caratteristica particolare di tutti i

clostridi è che fanno questa scissione fosforoclastica del piruvato, da qui si

forma acetil_CoA, CO e proteina ridotta (ferrodossina reduttasi) che tramite

2

associazione con una idrogenasi (si scaricano gli elettroni su H del mezzo) si

+

produce H . L’acetato viene attivato e per produrre energia si scambia

2

acetil_CoA con acetil_P. quando scarico potere riducente (scarico elettroni) in

questo caso non posso dire che è una fermentazione in senso stretto, perché

l’accettore di elettroni è un H (composto inorganico), in questo caso di

+

scissione l’accettore di elettroni è un composto inorganico, non è un intermedio

metabolico.

I due piruvato divento 2 acetil_CoA, 2 H e 2 CO . Gli omoacetogeni usano la via

2 2

dell’acetil_CoA, si formano 2 acetato e si fa una terza mole di acetato da 2 H e

2

2 CO -> diventano chemioautotrofi perché fissano la CO che hanno appena

2 2

prodotto con il metabolismo chemioeterotrofo. Fermentano gli zuccheri ad

acetato, ma possono ossidare la CO usano l’H come donatore di elettroni e si

2 2

produce acetato attraverso la via dell’acetil_CoA. Da glucosio hanno 2 piruvati

e producono 2 acetil_CoA e producono 2 acetati, poi 4 H vanno a ridurre CO ->

2

una diventa il gruppo metile e l’altra diventa il gruppo carbonile e si forma la

terza mole di acetato.

I metili sono legati al THF (tetraidrofolato). Gli Archaea metanogeni hanno dei

cofattori differenti. Nel THF arrivano ad essere il gruppo metile dell’acetato. 16

Quando si ha una quantità elevata di acidi o si aumenta la T per far sì che

l’acido venga utilizzato dagli Archaea, si può anche ridurre l’importo di

nutrienti. Altro intervento che si fa è quello di aggiungere microrganismi, si ha

un kit per proteggere il bioreattore quando questo va in acidosi. Si fanno degli

inoculi, aggiungendo quando il digestore anaerobico va in acidosi per cercare di

riprendere l’equilibrio verso la formazione di metano, questo vuol dire evitare

l’accumulo di acidi organici. Clostridium

Fermentazione dell’acetobutanolo, è la più nota perché il

acetonbutilico è stato isolato ed è in grado di fermentare e produrre acetone e

butanolo. Dall’acetone si produce la glicerina. Butanolo = composto chimico

essenziale per i pneumatici, per le plastiche. La cosa importante è la natura

eterofermentante di questo microrganismi. Capacità di eterofermentare è un

grosso limite per la chimica di fermentazione classica (per fare il

monoprodotto). Per produrre energia effettuano la fosforilazione a livello del

substrato. L’equilibrio dei prodotti dipende dall’equilibrio ossido-riduttivo. La

varietà dei prodotti dipende dai ceppi, dal substrato e dalle condizioni di

coltura. I sintrofi sanno usare il butirrato e andare a produrre l’acetato che

serve per fare la biomassa, quindi vanno all’inverso delle ultime reazioni.

Reazione di Stikland: importanti

per la digestione dei substrati

proteolitici. Accoppiano l’utilizzo di

due aminoacidi. 30/03/2017

In questo gruppo di anaerobi

obbligati, sporigeni, a basso

contenuto di GC, Gram +, possono

avere produzioni di acidi organici,

possono essere omoacetogeni,

possono essere anche sintrofi. I

17

Clostridia quindi sono molto importanti, sono un gruppo batterico molto

adattato a questo ambiente e condivide una forma di autotrofia con i

metanogeni. Sono importanti nelle fasi primarie di fermentazione la presenza di

altri due gruppi microbici che hanno comportamento diverso con l’ossigeno ->

Clostridia

servono per far vivere i e i metanogeni.

Flessibilità e cooperazione all’interno del consorzio, per comportamenti diversi

nei confronti dell’ossigeno e possono vivere nelle prime fasi perché possono

aiutare a consumare l’ossigeno presente oppure ad attivare il processo in

presenza di ossigeno -> batteri lattici ed enterobatteri.

Batteri lattici

Non vengono avvelenati dall’ossigeno, ma non

lo utilizzano, sono aerotolleranti e fermentanti

stretti. Sono chemioeterotrofi, producono

intermedi del metabolismo attraverso la

degradazione dei carboidrati. Scaricano gli

elettroni su intermedi del metabolismo, sono

fermentanti stretti, sull’acido piruvico

producendo acido lattico. Utilizzano solo

accettori di elettroni che fanno parte del

metabolismo intermedio. Non possono

utilizzare l’ossigeno come accettore di

elettroni, non respirano l’ossigeno e neanche

altri substrati organici. Hanno enzimi che

detossificano eventuali ROS. Sono

microrganismi molto importanti perché sono

gli agenti di tutte le fermentazioni lattiche. Vengono utilizzati anche

nell’industria dei probiotici, producono anche delle batteriocine che aiutano nel

mantenere il microbiota intestinale. In natura vivono negli ambienti anaerobi,

anche se non sono avvelenati dall’ossigeno, vivono nei comparti intestinali.

Sono in grado di degradare i compisti nel digestore anaerobico anche se sono

presenti tracce di ossigeno. Producono acido lattico, uno di quei composti che

vanno a formare il pool utilizzato dai sintrofi.

Dal punto di vista fermentativo si dividono in:

Omolattici

 Eterolattici

 Omolattici facoltativi, gruppo particolare a seconda del substrato e in

 genere vivono nell’intestino, quindi sono importanti dal punto di vista

clinico, della fisiologia.

Omolattici: batteri lattici che trasformano tutto il glucosio in acido lattico.

Glicolisi del tutto normale, da 1 mole di glucosio si formano 2 moli di piruvato.

Scindere il glucosio attivato dal fosfato in 3C + 3C, questo enzima c’è solo negli

omofermentanti -> ALDOLASI. 18

Eterofermentanti: non hanno l’aldolasi quindi usano la via dei pentoso fosfati,

attraverso questa si generano gli scheletri del carbonio a 5C, si generano quelli

a 4C,

servono per creare gli zuccheri degli acidi nucleici, quelli a 4C servono per gli

aa aromatici (serve per l’anabolismo in sostanza). Decarbossilano il glucosio, lo

trasformano in un composto a 5C e poi lo dividono in 3C + 2C. Acetil_P può

diventare acetato e ATP, oppure se serve scaricare ancora potere riducente,

diventa acetato -> acetaldeide -> etanolo. Questa fermentazione generare

lattato, acetato o etanolo -> sono tutti substrati che i sintrofi utilizzano.

Enterobatteri

Aerobi facoltativi, sono chemioeterotrofi respiranti che possono condurre sia il

metabolismo ossidativo che quello fermentativo. Consumano ossigeno ->

hanno ruolo chiave nel digestore perché consumano ossigeno. Hanno un ruolo

importante nelle fermentazioni primarie. Questi prodotti della fermentazione

non servono per l’industria della fermentazione, vengono studiate ora perché

contribuiscono al microbiota industriale. 2 tipologie di fermentazione: acido

mista, produce una serie di composti acidi e questi composti non hanno una

rilevanza come prodotti di interesse industriale. Hanno la glicolisi classica e

arrivano a piruvato, poi

viene convertito in una

serie di acidi, sono

eterofermentanti, non

hanno solo un modo di

scaricare potere riducente,

possono scaricare sul

lattato (se hanno lattato

deidrogenasi), possono

decarbossilare il piruvato

dando origine a CO e

2

acetil_CoA. Quest’ultimo

se diventa accettore di elettroni diventa acetaldeide ed etanolo oppure

19

attraverso acetil_P producendo ATP si ha

l’acetato. Possono decarbossilare l’acetato

ottenendo formiato che viene scomposto e si

ottengono CO e H . Può avvenire una reazione

2 2

E. coli

anaplerotica, dato che ha il ciclo di

Krebs, ha gli enzimi per l’anabolismo oltre che

per il catabolismo. Il piruvato viene carbossilato

e viene reintrodotto come ossalacetato. In

questo caso abbiamo la reazione anaplerotica,

carbossilazione del piruvato in succinato,

reazione che viene con scarsa frequenza.

Enzima nuovo: complesso della formiato-

idrogeno liasi, è in grado di decomporre il

formiato in CO e H in condizioni anaerobiche,

2 2

il complesso è formato da due attività

enzimatiche separate -> formiato deidrogenasi

e idrogenasi.

Quando vanno in anaerobiosi avviene la

fermentazione del 2,3-butandiolo. Da piruvato

si ha produzione di etanolo, lattato, acetato, succinato, CO + H (sempre da

2 2

formiato liasi), 2,3-butandolo + CO -> complesso enzimatico addizionale. Il

2

bilancio di questa fermentazione tende al neutro perché prevalgono la

formazione di 2,3-butandiolo ed etanolo.

Da due piruvati, uno dei due si lega alle TPP, viene decarbossilato condensando

ad un’altra mole di piruvato. Si ha la formazione quindi α-acetolattato -> da

questa si ha la formazione di acetoina e infine si ha la produzione di 2,3-

E. coli

butandiolo. Uno dei prodotti critici quando si usa per le proteine

ricombinanti è l’acetato. Quando si ha la produzione di acetato per l’insulina da

E. coli o comunque altre proteine ricombinanti, si ha troppa produzione di

E. coli

acetato perché fa la fermentazione acido mista. Ad alta densità di lavoro

va in anaerobiosi e produce acetato che è tossico -> si è pensato di introdurre

geneticamente la via del 2,3-butandiolo nei ceppi ricombinanti di E. coli così si

ha una diminuzione della produzione di acetato. Adesso è stato ingegnerizzato

20

E. coli per produrre 1,4-butandiolo che viene utilizzato per la produzione delle

plastiche.

Idrolisi in anaerobiosi Clostridi

Poche specie appartenenti ai hanno la capacità di attaccare la

cellulosa. Enterobatteri buoni produttori di lipasi e proteasi, quest’ultime

Streptococcus

prodotte anche dai clostridi. L’amilasi viene prodotta da e

Bacteroides.

BIO-PRODUZIONE DI IDROGENO

L’idrogeno viene considerato una forma di energia pulita, unica forma di

energia in cui non c’è il carbonio. Produzione fotobiologica dell’idrogeno dalla

fotosintesi, forma più pulita e ideale della produzione di bio-idrogeno.

L’idrogeno può essere utilizzato per il trasporto, è molto versatile, utilizzazione

efficace, compatibilità con l ‘ambiente, sicurezza, ma non è economico.

Gassifcazione del carbone

Fatta con un processo chimico, processo più consolidato per produrre idrogeno

molecolare, ma è troppo economicamente pesante produrre idrogeno

molecolare anche con questo sistema abiologico. Si utilizza un vapore acqueo

ad altissima pressione e a temperature molto alte, si ha la gassificazione del

carbone ad alte T. Si forma un composto chiamato Syngas.

Coal + O + H O → H + 3CO

2 2 2

Può avvenire anche la water gas shift reaction

CO + H O → CO + H

2 2 2

L’acqua si scinde e si formano gli idrogeni e un ossigeno va a fissare la CO .

2

Svantaggi:

High temperature

 Production of Syngas (H + CO)

 2

Ash

 Environmental pollution

 Pure oxygen consumption

Recentemente si è iniziato anche a gassificare la biomassa, non è una reale

combustione perché avviene in presenza di ossigeno -> trasformazione

obbligata della biomassa in gas.

La produzione biologica di idrogeno è ancora nella fase di laboratorio, il

downstream è semplice, le colture sono tipicamente miste, il valore

dell’idrogeno è poco superiore rispetto a quello del metano.

Processi che utilizzano l’idrogeno a livello biologico: 21

Dark fermentation -> produzione di idrogeno, avviene al buio, nel

 digestore anaerobico

Biophotolysis

 Photofermentation

 Microbial electrolysis cell

Dark fermentation e photofermentation

Più studiati nei termini di applicabilità, si adattano per utilizzare composti

organici di scarico per produrre idrogeno biologico perché si fermenta (processo

chemioeterotrofo). Rese di formazione di idrogeno molto basse, ci si aspetto

che con l’improvement e ingegneria genetica si possano aumentare le rese per

poter utilizzare i rifiuti.

6 -> Scomposizione di una mole di glucosio di H e CO .

2 2

5 -> Fase di produzione di H e fase di produzione di metano.

2

Produzione di idrogeno: ci sono vari processi, in particolare la DARK

FERMENTATION schema sintetico con cui i microrganismi possono produrre

l’idrogeno molecolare. Processo a due fasi -> Reazione 5: prima fase

acidogenica (molecola di glucosio trasformata in acido acetico + H + CO ,

2 2

questi possono essere i substrati della fase successiva della metanogenesi);

nella seconda fase si ha la produzione di CH . I batteri responsabili di questa

4

reazione sono i batteri fermentativi (producono sempre H2 + CH COOH + CO )

3 2

e gli Archaea (producono sempre CH + CO ).

4 2

La completa scomposizione del glucosio in CO + H avviene nella reazione 6

2 2

(High-yield dark fermentation), ma è un concetto “ideale”, serve un’adeguata

tecnologia per far sì che avvenga.

Ci sono due gruppi che sono in grado di produrre idrogeno: 22

Batteri che appartengono ai Clostridia che fermentano gli esosi in acido e

 alcol producendo CO e H , sono in grado di fermentare anche gli aa con

2 2

la reazione di Stickland in acetato, ammonio e H .

2

Enterobatteri, fermentano gli esosi in etanolo, 2,3-butandiolo, succinato,

 lattato, acetato, acido formico, CO e H . Hanno due fermentazione: acido

2 2

mista e 2,3-butandiolo.

Clostridia: Gram +, producono una grande quantità di idrogeno in coltura

mista, in condizioni mesofile o termofile con un range di pH che va da 5.0 a 6.5.

I clostridi producono H tramite una reazione reversibile catalizzata

2

dall’idrogenasi e questa reazione è importante per il raggiungimento

dell’equilibrio redox della fermentazione. La formazione di H è inibita dalla

2

pressione parziale dell’H -> questo può limitare la conversione del substrato e

2

la crescita e i batteri possono rispondere con uno switch in un differente

metabolismo per raggiungere un equilibrio redox.

Attraverso questo metabolismo producono ATP e scaricano il potere riducente,

in questo modo rigenerano il potere ossidante per fare i primi steps della

glicolisi. I clostridi hanno sempre questa reazione, quello che succede dopo

dipende dalla specie (pacchetto enzimatico), dal terreno, dalle condizioni di

fermentazioni, dal bilancio ossidoriduttivo. L’idrogenasi è

reversibile in quanto l’H può diventare un donatore di

2

elettroni o un accettore di elettroni. La riduzione della

ferrodossina è importante, perché cede gli elettroni alla

idrogenasi, lo studio della ferrodossina (elemento chiave

in tutte le catene di elettroni) è fondamentale così come

lo è il suo ciclo di ossidoriduzione. La ferrodossina può

accettare elettroni anche dall’NADH che si forma durante

la glicolisi. Normalmente l’H quando si forma, siccome la

2

reazione è reversibile, l’andamento della reazione dipende dalla concentrazione

del prodotto. Se abbassiamo la pressione parziale di H riusciamo a fare in

2

modo che i primi HADH scarichino il potere riducente sulla ferrodossina che a

sua volta lo scaricherà sull’idrogenasi. In questo modo si può aumentare la resa

di H . Il sistema usato per fare questo si chiama gas stripping: se metto un

2

flusso di N che fa sì che spiazzi gli altri gas; man mano che l’H viene prodotto,

2 2

il flusso di azoto che si applica al fermentatore fa uscire l’H . In sostanza si

2

toglie l’H in maniera artificiale, si va a competere con i consumatori di

2

idrogeno (omoacetogeni, solfatoriduttori, Archaea metanogeni).

Enterobatteri: formano H esclusivamente quando agisce il complesso

2

enzimatico formiato-idrogeno-liasi che degrada il formato in assenza di

ossigeno. Consiste di due attività enzimatiche separate, non è legato al bilancio

ossidoriduttivo, è un sistema di detossificazione perché l’acido formico è

E. coli

tossico. Fondamentale perché non ha la possibilità di indurre un

differenziamento morfologico che porta ad una fase di latenza (la spora) quindi

E. coli.

questo processo serve per proteggere L’idrolisi del formiato è

irreversibile e non è soggetta alla pressione parziale di H . Sono batteri

2

anaerobi facoltativi, possono usare l’ossigeno, quando finisce iniziano a

23

produrre l’idrogeno -> ma la resa di idrogeno su un esoso è più bassa rispetto a

quella dei Clostridi. Quindi si deve lavorare su mutanti di enterobatteri al fine di

produrre 3 moli di idrogeno per mole di esoso consumato, cercando di far

Enterobacter cloaceae

produrre meno acidi e alcoli. ha rese maggiori rispetto

agli altri microrganismi.

Questi gruppi hanno la possibilità di produrre idrogeno molecolare:

Ruminococcus sp.

 Selenomonas ruminantium

 Citrobacter freundii

 Acetobacterium woodii

 Trichomonas brockii

 Syntrophomonas wolfei -> riesce a produrre H dagli acidi organici

 2

Reattori in continuo arricchendo in batteri

fermentativi. Reattore allestito per

produrre maggiormente H2. Per convertire

un sistema in continuo alimentato da

rifiuto organici, bisogna arricchire in

fermentati per avere una maggior

produzione di H2. Processi fatti a livello di

impianto in laboratorio o all’impianto

Come vengono fatti questi

pilota.

processi? Ci sono dei trattamenti classici,

ad esempio ripetere dei trattamenti a calore (70-90°C), in questo modo si

uccide il resto della popolazione, quella che non forma spore e quindi

arricchiamo di microrganismi fermentanti. La maggior parte dei batteri enterici

e clostridi hanno un ottimo di temperatura tra i 30 e 37°C, facendo uno shock

di temperatura si favoriscono gli sporigeni. Altro metodo: aggiungere

concentrazioni di zuccheri molto alte, in questo modo si favorisce la

fermentazione (il contrario di quando nel reattore si va in acidosi e i

metanogeni ne soffrono). Altri metodi: aumentare il pH o si possono aggiungere

inibitori della metanogenesi, bloccano il sistema energetico dei metanogeni.

Sono studi a livello pilota, studi che permettono di capire se si può fare la dark

fermentation più per produrre idrogeno che metano.

Si possono anche addizionare delle colture pure (a livello di laboratorio), sono

Thermotoga spp.

stati isolati i Batteri che operano a 70°C e permettono quindi

di alzare la temperatura nel digestore. Sono usati anche metodi di

immobilizzazione della biomassa, di gas stripping e di fermentazione in

continuo.

Ci sono alcuni problemi pratici di questi processi:

Si formano idrogeno, metano, anidride carbonica e anche H S

 2

Il feed stock che entra contiene diversi microrganismi

 24

Fermentazione produce una grande quantità di acido organico che è

 tossico per i batteri, quando l’acidità scende sotto certi livelli i batteri

sporificano e quindi non agiscono più

Ad oggi si considera la produzione di idrogeno come un pretrattamento per la

metanogenesi -> la produzione di idrogeno viene accoppiata alla

metanogenesi. Si accoppia la produzione di idrogeno, come un pretrattamento

per la produzione di idrogeno ed acidi, poi gli acidi producono metano e da

questo si ha di nuovo H e CO .

2 2

Oppure si accoppia la dark

fermentation con la

photofermentation, in cui i batteri

fotoeterotrofi mangiano acidi

organici e possono produrre una

certa quantità di H .

2

Thermotoga

Nella prima fase si ha la produzione di idrogeno, viene fermentato in un primo

reattore, poi questo reattore viene passato in una condizione successiva in cui

riesce a produrre metano (shift alla fermentazione acidogenica).

Thermotoga maritima: ipertermofilo anaerobico marina che metabolizza

carboidrati semplici e complessi e li fermenta in lattato, acetato, H e CO .

2 2

Lento consumatore di glucosio, cresce lentamente e produce biomassa povera.

Pyrococcus furiosus: ipertermofilo euriarchaeota marino, vive sopra gli 80°C, in

ambienti con una pressione submarina molto elevata. Anaerobio obbligato,

metabolizza proteine, maltosio e usa S come accettore di elettroni producendo

0

H S. Può fermentare il piruvato in H , CO e acetato. Produce idrogeno a 80°C,

2 2 2 Pyrococcus

viene accoppiato in vitro il complesso di della idrogenasi con il

Thermotoga.

complesso enzimatico della glucosio deidrogenasi di Facendo

questo accoppiamento è possibile scomporre il glucosio in H e CO , ma è solo

2 2

a livello teorico.

Produzione di idrogeno con la luce -> BIOFOTOLISI DIRETTA o

fotofermentazione.

Biofotolisi diretta: può energicamente pulito, si scompone l’acqua in presenza

di luce producendo H e O . La fotolisi dell’acqua è stata studiata anche dal

2 2 Si possono trovare sistemi biologici che fanno la

punto di vista chimico e fisico.

fotolisi dell’acqua? Sì, c’è un punto del processo fotosintetico dove avviene la

scissione dell’acqua.

Fotosintesi 2H O -> 4H + 4 e + O Produzione di idrogeno 4H + 4

+ - +

2 2

e -> 2H

- 2

Dove avviene la scomposizione dell’acqua nella fotosintesi? Nel fotosistema II.

Cosa succede nella fotosintesi agli elettroni e ai protoni? Prendono due strade

diverse: i protoni creano il gradiente chemiosmotico che consente la

produzione di ATP, invece gli elettroni vanno nella catena di trasporto degli

25

elettroni. Punto che viene chiamato scomposizione dell’acqua grazie

all’energia della luce, ma poi protoni ed

elettroni prendono due strade differenti, se

non andassero per strade diverse si

avrebbe la produzione di idrogeno.

Fotosintesi ossigenica fatta da alghe,

piante, cianobatteri. Nelle piante il sistema

è associato ai cloroplasti, nei cianobatteri è

associato alle membrane cellulari. I

cianobatteri sono quelli che hanno generato ossigeno nell’atmosfera. In questi

organismi avviene la scomposizione dell’acqua al fotosistema II. Fissazione

della CO , avviene con reazioni indipendenti dalla luce, attraverso la RuBisCO.

2

Cianobatteri

I cianobatteri sono microrganismi fotosintetici pigmentati che ottengono

energia attraverso la fotosintesi clorofilliana. Possiedono membrane cellulari

coinvolte in modo da amplificarne la superficie il più possibile. Caratteristica

importante è che oltre a fare la fotosintesi ossigenica fanno anche la fissazione

dell’azoto. Trasformare N in ammoniaca, in NH . I cianobatteri sono

2 3

microrganismi con varie strutture cellulari, spesso vivono in forma

pluricellulare, si formano catene, strutture flagellate, hanno anche una capsula

polisaccaridica che avvolge queste strutture pluricellulari. Spesso hanno delle

cellule specializzate per fissare l’azoto -> eterocisti. I cianobatteri vengono

utilizzati per produrre tossine. La fissazione dell’azoto avviene nelle eterocisti, è

un processo di riduzione. Avviene nelle eterocisti perché la fissazione dell’azoto

è inibita dall’ossigeno, le nitrogenasi vengono bloccate dall’ossigeno. La

nitrogenasi è un enzima che è sensibile all’ossigeno, la reazione di produzione

dell’azoto avviene dentro questo eterocisti che sono schermate dalla struttura

di parete dalla presenza di ossigeno. La nitrogenasi inoltre richiede l’ATP.

Possono utilizzare anche le alghe, macro e micro, gruppo molto complesso dal

punto di vista tassonomico. Le microalghe sono unicellulari che possono vivere

singolarmente o in catene o in gruppi. Le dimensioni possono variare da specie

a specie da pochi micrometri ad un centinaio di micrometri. La biodiversità

delle alghe è enorme e rappresentano una vera risorsa.

Le microalghe e i cianobatteri hanno la

capacità di produrre H -> possono fare

2

l’operazione di condensazione andando a

produrre H e CO , in condizioni anomale.

2 2 26

Nelle microalghe e nei cianobatteri il normale processo fotoautotrofo è

schematizzato dalla reazione della fotosintesi.

In condizioni particolari di stress, in condizioni anaerobiche, le microalghe

possono produrre una piccola quantità di H usando la luce come fonte di

2

energia. Si usa l’idrogenasi che è sensibile all’ossigeno ed è un prodotto della

fotosintesi. La ferrodossina ridotta cede gli elettroni al NAPDH che serve per la

sintesi dei carboidrati, per la fissazione della CO che viene ridotta e nel mentre

2

si forma ATP. In condizioni particolari l’idrogenasi serve come valvola di scarico.

Quando si è in anaerobiosi, quando c’è luce e un eccesso di potere riducente,

bassa pressione parziale di H , la ferrodossina invece di cedere gli elettroni sul

2

NADPH li cede per scaricare il potere riducente, l’idrogenasi prende gli elettroni

dalla ferrodossina e li scarica sull’H del mezzo. È una perdita per il

+

microrganismo però, ma per far continuare il ciclo delle ossidoriduzioni è

fondamentale. È un’equazione transiente per definizione, quando c’è id nuovo

ossigeno questo inibisce l’idrogenasi. Questo sistema serve per compensare

momenti di stress. Le efficienze fotochimiche della produzione fotoautotrofica

di idrogeno è tra il 3 e il 10%, quando l’ossigeno è totalmente e

immediatamente rimosso. In altri processi è circa del 1-2%.

Chlamydomonas reinhardtii,

È stato sequenziato il genoma di una microalga,

che funge come modello, analizzando i cromosomi si è visto che ci sono due

(hyd1 hyd2)

geni e per due idrogenasi e l’espressione di questi geni è indotta in

anaerobiosi, hanno quindi un controllo genico in anaerobiosi -> si cerca di

vedere se si possono creare delle ricombinanti meno sensibili all’ossigeno. È

un’alga molto semplice con un ciclo alternato di riproduzione sessuata e

asessuata, ha un unico grosso cloroplasto (a forma di cavallo) dove avviene la

fotosintesi ossigenica. Quest’alga è uniflagellare flagellata.

FOTOFERMENTAZIONE

Altro sistema biologico di produzione di

idrogeno da organismi fotosintesi che

però è legata ad una fotoeterotrofia. Ci sono due modelli metabolici di

riferimento: chemioeterotrofia e fotoautotrofia. Questi due modelli si incrociano

negli Archaea come chemioautotrofia (quando fanno la terza mole di acetato

da H e CO ). Nei batteri purpurei c’è il metabolismo fotofermentante ed è stato

2 2 trovato anche nelle microalghe, sono

caratterizzata da una plasticità

metabolica. 27

Prendono l’energia dalla luce, ma gli scheletri del carbonio e il potere riducente

dal materiale organico -> fotoeterotrofia.

Conversione di materiale organico a bioidrogeno che viene prodotta da un

diverso gruppo di batteri fotosintetici. È

differente dalla fermentazione dark perché

avviene solo in presenza di luce. Questo

tipo di fermentazione si basa sull’utilizzo di

materiale organico, producendo CO e H .

2 2

Questa fermentazione viene fatta dai

batteri rossi non sulfurei, sono

proteobatteri, capaci di produrre energia

attraverso la fotosintesi ->

Rhodospirillaceae -> pigmentati da

particolari batterioclorofille e fanno la fotosintesi anossigenica che avviene

sulle membrane cellulari che sono ripiegate in maniera abbondante per

formare i tubi o strati per aumentare l’area di assorbimento. Non producono

ossigeno perché non è i donatori di elettroni sono gli acidi organici e non

l’acqua. Questo gruppo fissa anche l’azoto. La fissazione dell’azoto quindi viene

fatta dai cianobatteri (fotosintetici ossigenici) e questi batteri purpurei

Rhodobacter capsulatus

(fotosintetici anossigenici). contiene una grande

quantità di membrane, all’interno

delle vescicole è contenuto il polimero

di riserva -> poliidrossibutirrato che

Dove si trovano nella colonna d’acqua

serve per produrre le bioplastiche. ? Si

trovano negli strati dove arriva la luce già filtrata. Hanno una fotosintesi

diversa, si basa sull’utilizzo di un solo fotosistema, il sistema di uscita di

elettroni è disaccoppiato, gli elettroni vengono riciclati costantemente, si crea il

gradiente chemiosmotico e si genera ATP. La luce serve per far continuare

Da dove arrivano gli scheletri

questo circolo la cui funzione è generare l’ATP.

del carbonio e di elettroni per il potere riducente? Dall’ossidazione dell’acetato

che produce elettroni, CO e scheletri del carbonio dalla gluconeogenesi. Il

2

sistema di ossidazione e quello di generazione di ATP sono separati.

Quando devono fissare l’azoto tolgono gli elettroni dal sistema fotoossigenico,

quando non c’è ammonio disponibile nel mezzo sono in grado di fissare l’azoto.

L’azoto è fissato da una nitrogenasi ->

è inibita dall’ossigeno, prende gli

elettroni e li scarica sull’N . La

2

ferrodossina (trasportatore chiave di

elettroni) cede gli elettroni ad una

nitrogenasi che prende l’N 2

dell’atmosfera e lo riduce in NH , se

3

facciamo avvenire questo sistema in

assenza di azoto atmosferico o di

substrati dell’azoto, la nitrogenasi non

avendo l’accettore di elettroni di N 2

scarica gli elettroni su ciò che trova -> 28

H e produce H . Questo avviene quando c’è una carenza di NH organico ed

+ 2 3

inorganico -> sistema per produrre H dai

2

fotofermentanti, è uno stress metabolico

indotto. Gli elettroni vanno rimessi nel

circolo e questi avvengono

dall’ossidazione dei composti organici. La

produzione di ATP richiede energia ma è

parzialmente compensata dal fatto che

questi batteri usano l’intero spettro della

luce, meglio rispetto alle alghe verdi e

alle piante -> producono tanta ATP sfruttando tutte le lunghezze d’onda della

luce. Le efficienze fotochimiche sono circa 1-2% nel processo fotoautotrofo e

massimo 10% nel processo fotoeterotrofo.

BIOFOTOLISI INDIRETTA nelle microalghe verdi

Separare i vari processi nel tempo e/o nello spazio. In una fase c’è la

fotosintesi ossigenica con formazione dei carboidrati, seconda fase di

produzione di acido acetico dai carboidrati prodotti dalla fotosintesi ossigenica

(fermentazione dark) (l’H viene recuperato), terza fase fotofermentazione (in

2

presenza di nuovo di luce). Sono più stadi fatti dallo stesso microrganismo con

particolari capacità oppure fatti da microrganismi diversi.

Prima parte del processo: sistema illuminato e areato, dove avviene la

fotosintesi ossigenica. Poi la biomassa viene trasferita in un reattore che può

essere un fotobioreattore o un reattore classico dark di digestione anaerobica e

può avvenire la scissione dei carboidrati in

acetato. O questo reattore viene illuminato

oppure la biomassa viene trasferita in un

fotobioreattore perché la terza fase prevede

la luce.

Fissazione azoto nei cianobatteri -> Può permettere di produrre H invece che

2

NH . Oppure si accoppiano due

3

fermentazioni: dark fermentazione

e fermentazione alla luce. Si

prendono le biomasse di scarto, si

fa la dark fermentation, si

distruggono i polisaccaridi al fine di

avere il pool di acidi organici per

produrre H e CO e questi acidi

2 2

organici vengono mandati in un

fotofermentatore per produrre H e

2

CO . Poi bisogna separare H e CO -> c’è un separatore di gas che permette di

2 2 2

ottenere idrogeno puro.

WATER GAS SHIFT REACTION 29

Importante per la produzione chimica di idrogeno. CO + H O -> CO + H

2 2 2

ΔG°’= -20 kJ

Questa reazione è dovuta alla capacitò biologica di microrganismi -> abbattere CO è

stata scoperta in molti microrganismi nei batteri fermentanti che in quelli fotosintetici.

Questa reazione è associata al processo chimico di gassificazione.

In molti di questi processi chimici si forma il CO come sottoprodotto. Molti

microrganismi riescono ad ossidare CO a CO producendo idrogeno -> sono

2

microrganismi tassonomicamente diversi. Il limite di questo processo è la

solubilità dei due gas in acqua che è ancora più bassa rispetto a quella

dell’ossigeno. Sono coinvolte 3 proteine in questo processo:

CO deidrogenasi, indotta dalla presenza di CO

 Idrogenasi, indotta dalla presenza di CO

 Ferrodossina

Studio sulla CO e cloramfenicolo sulla produzione di H . Se l’assimilazione della

2

CO non avviene in presenza di cloramfenicolo afferma che serve la sintesi

proteica per il consumo di CO e di conseguenza per la produzione di H .

2

Si utilizzano i microbi per produrre elettricità -> fuel cell. È una tecnologia in

studio, non ancora matura per un’applicazione industriale, è uno di quei settori

che viene più studiato ultimamente, è un fenomeno abbastanza nuovo. Fuel

cell è un sistema che usa l’idrogeno e l’ossigeno per creare elettricità

attraverso un processo elettrochimico. Consiste in due elettrodi: anodo e

catodo che sono messi a sandwich in una soluzione e sono separati da una

membrana che permette il passaggio di alcuni degli elettroliti rispetto ad altri.

Quando l’idrogeno arriva all’anodo è separato da un catalizzatore e gli atomi di

idrogeno si separano in protoni ed elettroni che prendono diverse strade verso

il catodo. L’idrogeno è la fonte di energia che viene scomposta da un

catalizzatore al polo positivo. Gli elettroni vanno ad un circuito esterno, gli

elettroni invece passano attraverso una membrana elettrolitica, si riuniscono

con l’ossigeno e si formano acqua e calore. La fuel cell è basata sulla

separazione di un anodo e di un catodo da una membrana elettrolitica che ha

30

una selettività. Viene immesso idrogeno all’anodo, l’idrogeno viene scomposto

all’anodo e il concetto è che gli elettroni passano attraverso un circuito esterno

invece i protoni passano attraverso la membrana. Il passaggio esterno è un

flusso esterno di elettroni -> la corrente elettrica. Se a questo flusso associamo

una lampadina o condensatore questi si vanno a caricare. Gli elettroni si

riuniscono al catodo con l’ossigeno e si produce acqua e calore. La membrana

elettrolitica non permette il passaggio degli elettroni i quali sono forzati al

flusso esterno, devono passare tramite via elettrica per raggiungere l’altra

parte della cella. È un sistema che converte l’energia chimica in energia

elettrica senza le inefficienze che normalmente arrivano dalla combustione di

un carburante per produrre elettricità. Quindi sono un sistema di energia pulito

perché non abbiamo emissioni. Ci sono due tipi di celle:

1. Contiene una membrana elettrolitica, membrana selettiva che separa

l’elettrolita -> polymer electrolyte membrane, metodo migliore per capire

come funziona una fuel cell classica

2. Fuel cell alcalina -> passano gli OH attraverso la membrana e la

condensazione della molecola d’acqua viene fatta all’anodo, usata per

processi simili a quelli delle pile

In una microbial fuel cell il sistema è organizzato alla stessa maniera, ma

all’anodo c’è una popolazione microbica che forma un biofilm sull’anodo.

Questa popolazione microbica è capace di attuare questa separazione di

protoni ed elettroni. Gli elettroni vengono ceduti all’anodo, direttamente,

passano attraverso il circuito esterno e si ricondensano con gli H+ al catodo

formando l’acqua. Quindi il concetto è lo stesso della fuel cell con la membrana

elettrolitica. Il punto biologico del sistema è che si ha una cessione di elettroni

attraverso un processo biologico; all’anodo si forma un biofilm che è in grado di

31

cedere elettroni ad un supporto metallico. Questa popolazione lavora in

anaerobiosi, mentre l’aerobiosi è necessaria al catodo. Sono microrganismi

anaerobici che sanno crescere su un anodo e sanno generare energia elettrica.

Cosa succede nella popolazione microbica? Uno dei microrganismi chiave in

questa popolazione mista (perché si usano acque di rifiuto) che riesce a

Geobacter

trasferire gli elettroni ad un metallo è -> è adeso all’anodo, si

formano biofilm, si è visto che è l’anello della popolazione mista che riesce a

fare questo trasferimento di elettroni al metallo che costituisce l’anodo non è in

grado di usare carboidrati complessi, utilizza sostanzialmente acetato. Isolando

Geobacter, si è visto che questi non hanno la glicolisi classica, ma sanno usare

i piccoli acidi organici, quindi nella popolazione ci deve essere qualcuno che gli

prepara l’acido acetico. Si è andati a scoprire dei batteri chiamati elettrigeni.

Geobacter scompone l’acetato in CO , protoni ed elettroni, è in grado di

2

fermentare l’acetato, quindi è un chemioeterotrofo, anaerobio. Quello che fa

questo microrganismo è una forma di anaerobic respiration -> quando gli

elettroni non vengono ceduti all’ossigeno, ma neanche ad un intermedio

metabolico, vengono ceduti ad un composto inorganico di varia natura.

Geobacter è un Gram negativo, ha una catena di trasporto di elettroni in cui

l’accettore finale di elettroni (invece che essere ossigeno, un composto

Geobacter,

organico, H ) è un metallo. In questa popolazione, è un

+

chemioeterotrofo che usa l’acetato e poi è in grado di respirare l’acetato e

siccome lo ossida produce H+ ed elettroni, gli elettroni vengono ceduti al

catodo. Geobacter

Esistono due modelli dei batteri elettrigeni. ha una serie di proteine

periplasmatiche che sono tipicamente nello spazio tra le due membrane, tra cui

alcuni citocromi-C like che funzionano come metallo reduttasi, che alla fine

hanno la capacità di cedere gli elettroni al metallo. Si chiamano Geo- perché

sono microrganismi che vivono nella terra, dove c’è una componente metallica,

e scaricano gli elettroni usando questi componenti metallici.

Shewanella

Altro modello: Gram negativi, appartiene al genere che possono

trasportare gli elettroni ai metalli tramite

l’electron-shuttle, sistemi solubili con i

gruppi chinonici, i quali funzionano da

trasportatori solubili, non serve l’adesione

della membrana peripaslamtica al metallo,

ci può essere la diffusione dei trasportatori

solubili.

Entrambi i modelli producono dei

nanowires -> prolungamenti che si

attaccano intorno al metallo per

aumentare la superficie di scambio. Sono

estensioni specializzate perché sono

ricche di citocromi-like e proteine

periplasmatiche. 32

Modello laboratorio: ci sono due

contenitori: da una parte anaerobiosi,

dall’altra aerobiosi, al centro c’è una

membrana selettiva, se a questo

sistema colleghiamo una resistenza

elettrica possiamo accendere ad

esempio una lampadina.

Primo modello: i microrganismi producono idrogeno vengono messi all’nodo

che poi viene scomposto in H ed elettroni, ma in realtà non è questo -> perché

+

comporta la presenza di un catalizzatore.

Modello b: Shewanella che attraverso la membrana cellulare forma dei

composti (rossi o verdi a seconda dello stato di ossidazione) che funzionano

come electron-shuttle. Composti identificati come trasportatori solubili sono dei

gruppi chinonici, in alcuni di questi microrganismi è stata riscontrata anche la

riboflavina, proteina importante. Sono prodotti che appartengono alla categoria

dei metaboliti secondari.

Modello c: Geobacter

di che richiede l’adesione all’anodo. Questi sono

microrganismi che riducono il ferro 3 nei sedimenti, in cui avviene

+

l’ossidazione del materiale organico, accoppiata con l’ossidazione del ferro 3 ,

+

questi non producono electron-shuttle, ma hanno bisogno di essere in contatto

diretto con il metallo da ridurre.

BIOPLASTICHE

Sono polimeri di monomeri di tipo chimico. Il polistirene ha

un anello aromatico (C H ). Queste plastiche non sono

6 5

biodegradabili, quando vengono introdotte nell’ambiente

non si ha modo di recuperarle se non con ricicli e fare

delle plastiche di seconda generazione, ma non si hanno

gli stessi composti chimici di partenza, viene riutilizzato

parzialmente il materiale. A causa di alcuni composti

chimici presenti nella plastica, la combustione di questa

comporta l’evaporazione di composti molto tossici. Il 4%

dell’uso del petrolio va nell’industria chimica per la produzione della plastica.

Ci sono 3 categorie di bioplastiche:

Derivano dalle fossil carbon source ma sono comunque biodegradabili,

 origine naturale, ma fatta attraverso un processo chimico. Bisogna tener

conto di cosa si intende pe biodegradabilità.

Polimeri che derivano dalla biomassa e sono biodegradabili, derivano

 dall’amido e dalla cellulosa, ma hanno un grosso problema di costo (ad

esempio se viene utilizzato l’amido), vengono utilizzate anche biomasse

derivate da microbi come ad esempio il polilattato e il

poliidrossialcanoato 33

Plastiche derivate da pomieri convertiti dalla biomassa, ma non è

 biodegradabile

La DuPont produce un copolimero di PDO (1,3 propandiolo) e un acido

terefatlico -> tutto sotto il nome di SORONA. Viene prodotto usando

propandiolo dai feed stocks petrolchimici.

Classico impianto chimico associato ad una raffineria -> che prende i monomeri

e produce la plastica SORONA. In questo processo, mentre all’inizio si prendeva

il propandiolo dal petrolio adesso si produce usando il glucosio o il glicerolo da

E. coli

un ceppo di modificato. Ma rimane comunque non biodegradabile. È

importante farlo dal glicerolo perché è un sottoprodotto della produzione di

biodiesel.

PTT: plastica non biodegradabile, è il politrimetilenetereftalato. Quello che la

DuPont ha introdotto per produrre questo polimero è che il propandiolo viene

prodotto da un sottoprodotto che è il glicerolo, quindi da biomassa. È una

plastica molto resistente al calore, allo stress meccanico, ma non è

biodegradabile. La DuPont ha prodotto questo monomero per via biologica. La

plastica viene polimerizzata attraverso un processo chimico, tramite impianti,

solo che un monomero viene prodotto per biomassa.

Altro caso: PLA (acido poli-lattico, poli-lattato), plastica biodegradabile, questa

plastica viene prodotta dalla fermentazione dell’amico soprattutto; viene

prodotto l’acido lattico, che è il monomero di questa bioplastica, poi viene

condensato/polimerizzato chimicamente, la

plastica che si produce però è biodegradabile.

Processo misto, ma a differenza della Sorona

questa plastica è biodegradabile. Viene

utilizzata per le vaschette di prodotti alimentari,

prodotta per produrre le cose da catering. Unico problema è che non è così

tanto resistente allo stress meccanico e stress termico. Il primo uso di questo

poli-lattato -> era stata proposta per le protesi mediche, quelle protesi che

devono essere riassorbite nel tempo. Viene utilizzato anche in alcune

34

applicazioni tessili (tovaglie, tovaglioli). Il

principale produttore è stata la Cargill. Tutt’ora il

50% del costo del prodotto è dovuto alla

produzione dell’acido lattico, si cerca di ridurre

questi costi. Viene prodotto dai microrganismi

che fanno la fermentazione lattica (da piruvato a

lattato, tramite riduzione). Possiamo avere L-

lattato o D-lattato a seconda dell’enzima che

utilizziamo. L’acido lattico viene utilizzato molto nella sua forma L. Per fare la

produzione di poli-lattato è importante che si parta dal lactide, ovvero

aggregazione spontanea di due molecole di lattato, tramite due legami estere,

il gruppo carbossile tende a legare l’OH dell’altra molecola. Questa struttura si

forma meglio e più velocemente se si ha o tutto D-lattato o tutto L-lattato,

perché così gli atomi si mettono nella posizione corretta. Poi il lactide viene

polimerizzato per formare PLA. Esistono più di 100 catalizzatori chimici che

possono catalizzare la formazione del PLA.

La fermentazione lattica è fatta da lattobacilli, ma hanno dei problemi durante

la fermentazione: Sono molto esigenti nutrizionalmente,

 vivono in ambiente ricco, hanno bisogno di

zuccheri (melasse, siero, latte), non hanno

capacità idrolitica. Hanno perso alcune

capacità sintetiche, molti aa non li sanno

fare, hanno bisogno di rifornimento di

vitamine. Quindi dobbiamo dargli zuccheri,

nitrogeno organico e vitamine

(principalmente la B)

Sono limitati dal loro prodotto, perché si fa

 la fermentazione? Perché i lattobacilli

producendo un pH difendono il loro territorio

dagli altri batteri. Quando producono tanto

acido lattico tendono al suicidio, quindi si è

cercato di isolare dei gruppi più resistenti al

pH acido, ma non è facile andare oltre

La fermentazione lattica è limitata dal prodotto

finale, si è utilizzato un lievito che di loro natura

non sanno fare l’acido lattico, ma vengono

utilizzati perché sanno usare terreni più semplici,

non hanno bisogno di aggiunte nutrizionali e sono più resistenti a pH molto

bassi (anche intorno a 1.5-2).

Sono stati screenati 12000 lieviti, si è andati a vedere quello che la natura

offre, ovvero gli specialisti metabolici, si va a vedere chi è già in grado di fare

questo lavoro. Sono stati screenati i lieviti per resistenza agli acidi organici e

termotolleranti. Sono stati scelti 9 potenziali ospiti eterologhi, ma questi sanno

35

fare la fermentazione alcolica, quando non c’è ossigeno il lievito shifta alla

fermentazione, quindi è un anaerobio facoltativo. Il piruvato viene trasformato

(se non va il metabolismo aerobio), accetta elettroni, produce acetaldeide e poi

diventa etanolo (riduzione da piruvato ad etanolo, il gruppo chetonico del

piruvato diventa da aldeide ad alcol). La Cargill ha fatto

un knock-out genico della piruvato decarbossilasi e ha

introdotto la lattato deidrogenasi [intervento di

ingegneria metabolica]. Dallo stesso pool prodotto

dagli enzimi glicolitici invece che produrre etanolo, si

produce lattato. Questa fermentazione, come tutte, serve per scaricare potere

riducente, perché serve di nuovo NADH per ricominciare il metabolismo. È stata

introdotta una lattato deidrogenasi eterologa. Una volta fatto l’ospite sono stati

fatti vari passaggi di mutagenesi, ingegneria metabolica e ottimizzazione di

processo.

PHA – Poliidrossialcanoati

Sono prodotti come polimeri direttamente dai microbi, non serve il processo di

polimerizzazione. Sono poliesteri che vengono prodotti in quanto tale dai

microrganismi. Si accumulano come composti di riserva nelle cellule

microbiche e si accumulano in una serie di microrganismi, non c’è

un’associazione tassonomica specifica, vengono accumulati in granuli nel

citoplasma. Questi granuli possono essere recuperati e se si trattano con una

certa delicatezza (motivo per cu aumenta il prezzo) possono dare dei filamenti

di poliestere che hanno le caratteristiche per essere utilizzate come plastiche

biodegradabili. Sono composti di acidi grassi idrossilati in posizione 3; quello

più utilizzato è il 3-poliidrossibutirrato (PHB), il più comune. Il gruppo OH in 3 va

a formare un legame con l’altro monomero. Possono avere tante unità o poche

unità, bisogna recuperarli con la lunghezza maggiore possibile -> problema di

downstream.

Si pensa che abbiano molte funzioni: di storage per il C e il potere riducente,

nel momento in cui si ha una situazione in cui il microrganismo soffre di limiti

nutrizionali. La funzione fisiologica è una funzione di conservazione. Il

microrganismo si più riempire di granuli che si vedono molto bene al

microscopio ottico perché sono rifrangenti. Sono riportate circa 150 strutture

differenti. La produzione di questi granuli è tassonomicamente distribuita.

Quando c’è un eccesso di C e quindi di potere riducente, ma c’è un limite

nutrizionale di N e P, si formano quindi i PHA, è un polimero di riserva. Devono

fare polimeri e non granuli perché se no scoppierebbero per pressione

osmotica. Essendo monomeri richiamerebbero una grande quantità di molecole

ci acqua e questo porterebbe allo scoppio della cellula. Questione di

scompenso nutrizionale, ma anche di voler approfittare di una situazione in cui

si ha un eccesso di determinati componenti e invece un difetto di altri

Cupriavidus necator,

componenti. Uno dei microrganismi più studiati è cresce

bene in terreni ricchi di idrocarburi. 36

phbA, phbB,

Ci sono 3 geni coinvolti:

phbC. Si parte dall’acetil_CoA, il primo

gene fa acetoacetil_CoA, condensa

due molecole di acetil_CoA. Il gruppo

chetonico viene ridotto dal prodotto

phbB,

del gene si scarica potere

riducente e si ha la produzione di 3-idrossibutirril_CoA. Poi interviene il terzo

gene che fa la polimerizzazione dei monomeri di PHB.

Ci devono essere degli enzimi che recuperano questi prodotti quando si ha la

condizione adeguata. C’è una poliidrossibutirrato depolimerasi, si forma il PHB

che viene convertito in acetoacetil_CoA che poi a sua volte viene convertito in

acetil_CoA. Esistono gli enzimi per la depolimerizzazione, si ricostruisce il

potere riducente e si riformano gli stessi prodotti. Gli enzimi della biosintesi

sono costitutivi, non hanno bisogno di segnali di induzione, solo eccesso di

acetil_CoA; invece gli enzimi per la depolimerizzazione si attivano quando c’è

un eccesso PHB. Il gene per la

depolimerizzazione è stato

phaZ.

chiamato Ralstonia eutropha

Sistema di Ci sono 3 ORF che

corrispondono ai 3 geni

che abbiamo visto. In

Pseudomonas ci sono due versioni della polimerasi, c’è anche

una serie di fasine che sono

proteine che hanno un ruolo

strutturale. nella formazione

del granulo.

Biogenesi del granulo

Le fasine sono proteine che si

legano alla catena di PHB che

viene formato e formano un granulo interno

(è idrofobico, le funzioni idrofiliche vengono

bloccate dal processo di polimerizzazione,

sono idrossiacidi) e lo dividono in strati di

confine tra interno idrofobico dove c’è il

polimero e l’esterno idrofilico che è il

citoplasma. I granuli possono avere un diametro da 100 ai 500 nm e il numero

dei granuli dipende dal numero delle fasine. La formazione è molto veloce,

entro 10 minuti dalle condizioni opportune si forma il primo granulo.

Modello 37

Nella membrana del granulo ci sono le fasine, ci sono i fosfolipidi, nel granulo

sono fissate la poliestere sintasi e la depolimerasi. Caratteristiche di una

membrana semplificata (pseudomembrana) perché le fasine fanno uno strato

lipidico intorno al granulo. Attraverso l’aspetto applicativo si è in qualche

maniera attaccato uno dei dogmi della microbiologia, ovvero che non esistono

granuli con membrane nei batteri, in realtà non è così vero.

Vantaggi dei biocombustibili:

Sono di origine vegetale e quindi non contribuiscono all’emissione di CO2

 nell’atmosfera

Non contengono zolfo, a differenza dei combustibili fossili

 Sono totalmente biodegradabili

 Evitano l’emissione di sostanza nocive associate alla combustione di

 combustibili fossili

La loro molecola contiene ossigeno, riducendo le emissioni di CO e altri

 prodotti combustibili

L’impulso è stato data dalla direttiva del 2003 per la produzione di

biocarburante, questa direttiva è stata sostituita dalla direttiva 2020

(raggiungimento di alcuni target entro nel 2020):

20% di riduzione dell’emissione di gas serra rispetto al livello del 1990

 20% di incremento nell’uso di energie rinnovabili complessivo nell’UE

 20% di riduzione del consumo energetico ottenibile attraverso il

 miglioramento dell’efficienza energetica

Inoltre sono stabili dei criteri di sostenibilità: le biomasse sono di origine

vegetale, ma le materie prime non possono essere prodotte senza il rispetto

delle buone pratiche agricole e senza il rispetto dei principi basilari del

mantenimento della biodiversità. Le materie prime non devono venire da

terreni che presentano un elevato valore di biodiversità. Le materie non devono

provenire da terreni che presentano un elevato stock di carbonio. Le materie

prime agricole coltivate nella Comunità devono ottenersi nel rispetto delle

buone pratiche agricole. La Comunità europea potrà concludere accordi

bilaterali o multilaterali con Paesi terzi per dimostrare che i biocarburanti

prodotti da materie prime coltivate in detti Paesi rispettino i criteri di

sostenibilità. 38


PAGINE

63

PESO

11.57 MB

AUTORE

elaisa9

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Esame: Bioraffinerie
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Bioraffinerie e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Marinelli Flavia.

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