Biologia molecolare - produzione di proteine per mezzo dell'ingegneria genetica

Il DNA ricombinante non serve solo per studiare i geni

Produzione di proteine per mezzo dell'ingegneria genetica

A cosa possono servire le proteine ricombinanti?

• Proteine di interesse terapeutico.
• Proteine di interesse commerciale (enzimi).
• Proteine da utilizzare come antigeni per la produzione di anticorpi policlonali e monoclonali.
• Reagenti per la ricerca di base e applicata.

Sistemi di espressione

• Procariotici (E. coli)
• Eucariotici:
  • Saccharomyces cerevisiae
  • Pichia pastoris
  • Cellule di insetto (baculovirus)
  • Cellule di mammifero in coltura (CHO, ecc.)
  • Animali transgenici
  • Piante transgeniche

Manipolazione dell'espressione genica nei procarioti

Fattori da considerare:

• Promotore
• Sequenze leganti i ribosomi (6-8 nt seq. di Shine-Dalgarno)
• Numero copie del gene clonato
• Localizzazione finale proteina
• Stabilità proteina in cellula ospite

Geni in procarioti possono avere:

• Espressione costitutiva
• Espressione regolata (es. lac operon)

Nella produzione di proteine eterologhe in batteri vengono utilizzati spesso promotori forti e regolabili. Una produzione continua provoca:

• Inibizione funzioni cellula
• Perdita energia
• Perdita plasmide

Proteine di fusione

Per evitare degradazione di piccole proteine eterologhe, queste vengono prodotte come proteine di fusione con una proteina stabile dell’organismo ospite. I due cDNA devono essere fusi mantenendo la corretta cornice di lettura.

Esempio di cDNA di interesse:

• MCS MBP o GST

Promotore regolabile cDNA di interesse GST o MBP, utilizzate per purificazione MCS MBP o GST sito di taglio per proteasi proteina di interesse.

Induzione di espressione proteina di trasformazione in fusione batteri (promotori regolabili):

• Promotore gene “lac”
• MalE Proteina di fusione MBP pMAL cDNA di interesse
• Resina con legato maltosio
• Eluizione proteina di fusione purificata

Proteine di interesse terapeutico in procarioti

Vantaggi:

• Sistemi di espressione molto semplici da manipolare
• Produzione di proteine in grandi quantità e a basso costo
• Rischio contaminazione virale nullo
• Rischio allergie ridotto rispetto alla purificazione di proteine eterologhe (vengono prodotte proteine umane)

Problemi:

• È difficile ottenere proteine che mantengono la conformazione nativa delle proteine umane (i sistemi di folding dei batteri sono molto meno sofisticati che negli eucarioti)