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Estratto del documento

IL DNA RICOMBINANTE NON SERVE SOLO PER STUDIARE I GENI: PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL'INGEGNERIA GENETICA

A cosa possono servire le proteine ricombinanti?

  • PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO.
  • PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (ENZIMI).
  • PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI.
  • REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.

Sistemi di espressione:

  • Procariotici (E.Coli)
  • Eucariotici:
    • Saccharomyces Cerevisiae
    • Pichia Pastoris
    • Cellule di insetto (Baculovirus)
    • Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.)
    • Animali transgenici
    • Piante transgeniche

MANIPOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI

Fattori da considerare:

  • PROMOTORE
  • SEQUENZE LEGANTI I RIBOSOMI (6-8 nt seq. di Shine Dalgarno)
  • NUMERO COPIE DEL GENE CLONATO
  • LOCALIZZAZIONE FINALE PROTEINA
  • STABILITÀ PROTEINA IN CELLULA OSPITE

GENI IN PROCARIOTI POSSONO AVERE:

  • ESPRESSIONE COSTITUTIVA
  • ESPRESSIONE REGOLATA (es. lac operon)

NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO...

UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI UNA PRODUZIONE CONTINUA PROVOCA: - INIBIZIONE FUNZIONI CELLULA - PERDITA ENERGIA - PERDITA PLASMIDE PROTEINE DI FUSIONE PER EVITARE DEGRADAZIONE DI PICCOLE PROTEINE ETEROLOGHE, QUESTE VENGONO PRODOTTE COME PROTEINE DI FUSIONE CON UNA PROTEINA STABILE DELL'ORGANISMO OSPITE. I DUE cDNA DEVONO ESSERE FUSI MANTENENDO LA CORRETTA CORNICE DI LETTURA cDNA di interesse MCS MBP o GST PROMOTORE REGOLABILE cDNA di interesse GST o MBP UTILIZZATE PER PURIFICAZIONE MCS MBP o GST SITO DI TAGLIO PER PROTEASI PROTEINA DI INTERESSE INDUZIONE DI ESPRESSIONE PROTEINA DI TRASFORMAZIONE IN FUSIONE BATTERI (PROMOTORI REGOLABILI) Promotore gene "lac" MalE Proteina di fusione MBP pMAL cDNA di interesse - Resina con legato maltosio Eluizione Proteina di fusione purificata PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO IN PROCARIOTI: Vantaggi - SISTEMI DI ESPRESSIONE MOLTO SEMPLICI DA MANIPOLARE - PRODUZIONE DI PROTEINE IN GRANDI QUANTITÀ E A BASSO COSTO - RISCHIO CONTAMINAZIONE VIRALE NULLO - RISCHIO

ALLERGIE RIDOTTO RISPETTO ALLA PURIFICAZIONE DIPROTEINE ETEROLOGHE (vengono prodotte proteine umane)

Problemi

  • E’ DIFFICILE OTTENERE PROTEINE CHE MANTENGONO LA CONFORMAZIONE NATIVA DELLE PROTEINE UMANE (i sistemi di folding dei batteri sono molto meno sofisticati che negli eucarioti)
  • I BATTERI NON MANCANO DI ADEGUATI SISTEMI DI MODIFICAZIONE POST-TRADUZIONALE (glicosilazione, clivaggio proteolitici, fosforilazione, aggiunta di lipidi). IMPORTANTI CONSEGUENZE SULLA ATTIVITÀ BIOLOGICA E SULLA ANTIGENICITÀ

Il problema del ‘folding’

Il problema delle modificazioni post-traduzionali

SINTESI INSULINA IN CELLULA PANCREATICA

CATENA A 30 aa Unite da ponti S-S

CATENA B 21 aa

ESONE 2

ESONE 1

PREPROINSULINA PEPTIDE SEGNALE

PROINSULINA

FORMA S-S IN APPARATO DEL GOLGI

UN ENZIMA RIMUOVE 33aa

A INSULINA

BC

PRODUZIONE DI INSULINA UMANA IN E. coli

  • 70 MAIALI PER 1 PAZIENTE PER UN ANNO
  • SI PUÒ PRODURRE INSULINA UMANA NEI BATTERI?
  • E. Coli NON SA

MODIFICARE premRNA EUCARIOTICIE PRODURRE MODIFICHE POST-TRADUZIONALIPRODUZIONE DI INSULINARICOMBINANTE IN BATTERI-Plasimidi separati codificano perCatena A e B-promotore trp e alcuni codoni iniziali trp-seq per il trp sono eliminate contrattamento con bromuro di cianato-catene mescolate assieme e tramite unprocesso chimico si formano legami S-

PRODUZIONE ORMONE DELLACRESCITA UMANO IN E. Coli-Peptide di 191 aa-Carenza provoca nanismo ipofisario-GH da animali non è efficace sull'uomo-80 ipofisi di cadaveri umani per un paziente per un anno (altorischio infezioni - CJ)

PRODUZIONE DI GHRICOMIBINATE IN BATTERIMANIPOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA INCELLULE EUCARIOTICHEVantaggi rispetto a sistemi procariotici-FOMAZIONE CORRETTA DI PONTI DISOLFURO-FOLDING CORRETTO-TAGLIO PROTEOLITICO DA PRECURSORE-GLICOSILAZIONE-MODIFICAZIONE DI aa (FORSFORILAZIONE,ACETILAZIONE, MIRISTILAZIONE, ecc.)

Dettagli
Publisher
cecilialll
A.A. 2012-2013
23 pagine
2 download
SSD Scienze biologiche BIO/11 Biologia molecolare
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cecilialll di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli studi di Torino o del prof Di Cunto Ferdinando.