Biologia della cellula

Biologia della cellula

Processi di sviluppo

Prof. Perroteau

Anno 2014/2015

I processi che riguardano lo sviluppo a partire dalla cellula uovo fecondata fino alla nascita ed oltre sono complessi. Durante lo sviluppo, si ricorre agli aspetti della biologia cellulare:

• Differenziamento: dal singolo uovo fecondato si origina un numero enorme di tipi cellulari con le più disparate funzioni. Lo sviluppo embrionale non è lo stesso in tutti gli organismi.
• Morfogenesi: le cellule si organizzano in tessuti ed organi piuttosto che essere distribuite in modo casuale.
• Accrescimento: le cellule che si stanno dividendo hanno perfettamente presente quando smettere di farlo. La divisione cellulare è strettamente regolata.
• Riproduzione: l'uovo e lo spermatozoo sono quelle cellule ad alta specializzazione che garantiscono la trasmissione alla generazione successiva delle informazioni.

L'ambiente influenza lo sviluppo. Il gene reporter identifica una specifica regione. Viene utilizzato per dire che un promotore è attivo.

Genetica dello sviluppo

Il controllo esercitato dai geni sullo sviluppo embrionale è fondamentale. Le mutazioni possono essere di tipo dominante o recessivo.

Embriologia sperimentale

Studia i meccanismi alla base dei processi ontogenici turbandone il naturale corso mediante manipolazioni embrionali. Le tecniche più moderne permettono di fare più manipolazioni, come:

• Overpressione genica (pasting): modificare la quantità di una molecola che viene espressa.
• Know dow genico (cutting): eliminare parte dell'informazione genica.
• Know in: introduzione di una mutazione.
• Painting: embrione chimera (contenuto cellulare misto). Le cellule di donatore e ricevente sono geneticamente differenti. Trapianto di cellule di quaglia in embrione di pollo.

Riguarda anche la produzione di animali trasgenici. Con questi esperimenti posso iniettare sequenze in più.

Differenziamento cellulare

Techniche di biomolecolare: PCR.

Ligandi solubili o legati alla membrana

Ligandi solubili:

• Sinaptica
• Paracrina
• Endocrina
• Autocrina (stessa tipologia di cellule che emette il segnale)

I solubili possono stabilire dei gradienti che diminuiscono mano a mano che si allontanano dal segnale.

Comunicazioni attraverso fattori che rimangono associati alla membrana:

• Justacrina
• Recettori intracellulari (il ligando entra nella cellula)
• Situati sulla superficie della membrana (il ligando non entra nella cellula)

Recettori intracellulari:

• Recettori nucleari che regolano la trascrizione e sono:
  • Ormoni steroidei: l'ormone entra nella cellula, si lega al recettore e viaggia verso il nucleo.
  • Ormoni tiroidei: sono già associati agli elementi di risposta ma non sono attivi.
  • Acido retinoico: importante nello sviluppo embrionale.

Di membrana:

• Canali ionici: regolati in diverso modo e partecipano alla segnalazione cellulare.
• GPCR: associati alla proteina G.
• Recettori enzimatici.
• Recettori associati ad enzimi.
• Recettori attivati attraverso tagli proteolitici.

Canali ionici

I canali ionici sono regolati da fattori come:

• Ligando extra/intra cellulare.
• Canali sensibili ad un intervento meccanico.

GPCR

Hanno due caratteristiche principali:

• Interazione con la membrana cellulare
• Associazione delle proteine G trimeriche perché presentano 3 subunità: alfa, beta e gamma. L'attivazione corrisponde all'attivazione del GTP che porta alla separazione della subunità alfa dalla beta e gamma. Il GTP con l'idrolisi diventa GDP meno 2 molecole di fosfato.

In base alla loro struttura molecolare si dividono in 4 tipologie:

• Tipo 1: entrambi servono ad ottenere l'adenilato ciclasi che porta all'AMP ciclico.
• GS: adenilato ciclasi, CAMPup, PKA CREB.
• Golf: cellule olfattive con subunità alfa situate nell'epitelio olfattivo, sono dei neuroni: adenilato ciclasi, CAMPup, canali ionici.
• Tipo 2: GI: subunità beta e gamma, canali ionici. PLC-beta (fosfolipasi c che tagliano i fosfolipidi di membrana).
• Tipo 3: GQ: subunità alfa, PLC-beta (attraverso la subunità Q attivo la PLC beta).
• Tipo 4: G12/13: regolano altre proteine G monomeriche (hanno solo la subunità alfa).

Per il passaggio da GTP a GDP è necessaria la proteine GEF che promuove lo scambio di un nucleotide.

Recettori ad attività enzimatica

I recettori ad attività enzimatica si dividono in:

• Tipo 1: ad attività tirosina chinasi. Si attivano attraverso una trasfosforilazione. Sono molecole dimeriche. Basta far avvicinare i 2 recettori per renderli attivi. La fosforilazione permette ai recettori di legare altre molecole. I domini messi in evidenza sono: SH2 che lega le porzioni tirosina fosforilate ed SH3 che lega i legami ricchi di prolina.
• Tipo 2: serina, treonina tirosina chinasi. Le molecole attivate possono essere:
  • Con attività enzimatica (PLC-gamma).
  • Senza attività enzimatica.

• Proteine:
  • ARF: regola il movimento delle vescicole.
  • RAB: regola il trasporto.
  • RAN: mediano il trasporto dal nucleo al citoplasma.
  • STKR: fattore di crescita trasformante.
  • TFGB: recettori.

Recettori senza attività enzimatica

Questi recettori associano attività enzimatica:

• Integrine (fak): tirosina chinasi che viene associata all'interazione con molecole che legano le integrine.
• Citochinine: vie di trasduzione dirette.

Recettori WNT

Hanno tre tipi di regolazione:

• Via canonica.
• Via della beta catenina.
• Citoscheletro.

Questi recettori regolano la trascrizione di determinati geni (NfkB), hanno sette domini transmembranari ma non sono accoppiati a proteine G, la via canonica è un elemento nuovo. Le caderine sono molecole che permettono l'interazione omofilica. Nella beta catenina, se associate alla catenine, rimangono localizzate nello spazio submembranare. Se la beta catenina è libera funziona come regolatore della trascrizione. I geni attivati da WNT non sono attivati ma silenziati.

La fecondazione

Tratteremo un aspetto di:

• Combinazione genica.
• Riproduzione.

Bisogna capire quali sono gli elementi importanti:

• Deve avvenire un contatto fra lo spermatozoo e l'oocita della stessa specie.
• Regolazione dell'interazione tra oocita e spermatozoo che evita che ci sia la fecondazione da più spermatozoi (polispermie).
• Fusione di materiale genetico che proviene da un nucleo maschile e femminile a ricostituire quello che diventerà il patrimonio genetico.
• Attivazione del metabolismo che fa sì che da quel momento in poi inizierà il ciclo di divisione.

Utilizziamo il modello del riccio di mare. L'oocita è una cellula molto più grande rispetto alle cellule somatiche. Dal punto di vista citoplasmatico è una cellula molto particolare ed ha una grandezza maggiore perché ha accumulato una certa quantità di molecole non sintetizzate. Il riccio si mantiene molto in laboratorio (mantenendolo in acqua di mare). Si possono distinguerei maschi dalle femmine dai gameti che si trovano in posizioni centrale (gialli femminili, bianchi maschili). Attorno all'uovo è presente uno strato gelatinoso che sarà molto importante come fonte di attrazione molecolare per gli spermatozoi. Nello spazio sub corticale ci sono numerosi mitocondri e granuli corticali. Essi contengono molti enzimi e un insieme di polisaccaridi (prima che ci sia la fecondazione).

La componente citoplasmatica contiene (cellula uovo):

• Molte proteine.
• Ribosomi e tRNA importanti per la fase dello sviluppo.
• mRNA.

Le proteine prodotte saranno di origine materna. Il nucleo della cellula uovo (oocita) Nel caso del riccio di mare questo oocita è già fermo. Nel caso in cui vediamo i tre lobi polari vuol dire che esso ha terminato la meiosi ed è quindi pronto per la fecondazione.

Lo spermatozoo è un corpo cellulare ridotto ad essere un contenitore che ha materiale genetico, una testa che ha acrosoma, membrana cellulare e nucleo, un flagello che ha un assonema e i mitocondri. Nell'acrosoma troveremo l'insieme delle proteine fondamentali per poter superare questi diversi strati che inglobano la cellula uovo e al di sotto di questa zona troviamo le molecole BIN e DIN indispensabili per il riconoscimento specifico.

Fecondazione specie specifica

Chemiotassi

L'oocita attrae spermatozoi a sé grazie al rilascio di molecole. Abbiamo quindi una fase di attrazione in cui vediamo gli spermatozoi che confluiscono proprio verso l'oocita. Successivamente avremo poi una fase di riconoscimento, il rilascio degli enzimi permette di passare attraverso questo strato gelificato. Si avrà poi l'entrata e il diretto contatto con la membrana dell'oocita. Una volta avvenuto il contatto sarà importante che il primo spermatozoo che ha effettuato il contatto faccia capire agli altri spermatozoi di non entrare per evitare la polispermia.

La chemiotassi: il rilascio di molecole da parte di una fonte (oocita) provoca un gradiente. Lo spermatozoo sarà in grado di seguire il gradiente di concentrazione che sarà più alto vicino all'oocita e diminuirà mano a mano che ci si allontana. Per poter attraversare lo strato gelatinoso, lo spermatozoo deve digerire parte di questa struttura fino ad arrivare alla membrana plasmatica.

La reazione acrosomale permette alla testa dello spermatozoo di rilasciare enzimi che idrolizzano le particelle dello strato gelificato (insieme di zuccheri che sono specie specifici). Questa reazione avviene solo tra specie uguali e in tempi diversi:

• Fusione delle vescicole con le membrane dello spermatozoo che porta al rilascio degli enzimi che possono distruggere le molecole dello strato gelificato e permettere allo spermatozoo di attraversarlo.

Quindi siamo entrati (grazie alla bindina) nell'involucro vitellino. Cosa rende l'oocita inibitorio dall'essere penetrato da altri spermatozoi? Il fuso mitotico è di origine paterna. Quindi i centrioli provengono dallo spermatozoo.

Prevenzione alla polispermia

Basta solo che due spermatozoi entrino per notare che lo sviluppo si blocca e non va a buon fine. C'è un sovrannumero di centrioli e cromosomi e questo porta a delle divisioni aderenti e dopo pochi cicli si ha una disgregazione cellulare che porta alla morte dell'embrione. Ci sono due meccanismi che evitano la polispermia:

• Una modifica di tipo elettrico.
• Delle reazione che vedranno coinvolti i granuli corticali.

Quando c'è il legame dello spermio con l'oocita c'è un cambiamento del potenziale di membrana che diventa positivo; si ha quindi un ingresso di Na. Facendo questo cambiamento di potenziale diventerà impossibile il fatto che un altro spermio possa fondere la sua membrana con quella dell'oocita.

Il secondo meccanismo vede coinvolti i granuli corticali. Ci sarà un cambiamento a livello dello strato esterno che diventerà una protezione rispetto ad una eventuale fecondazione da parte di altri spermatozoi. Lo strato si svilupperà intorno all'uovo. Questa reazione parte da dove è avvenuta la fecondazione. La fusione delle membrane fa sì che vengano rilasciati un certo numero di proteasi e diversi polisaccaridi nello spazio tra la membrana plasmatica e l'involucro gelatinoso. Tutti questi polisaccaridi hanno grande affinità con l'acqua, quindi appena vengono rilasciati richiamano tantissime molecole di acqua per far eliminare l'involucro gelatinoso. Attraverso questa reazione l'uovo si libera di questo involucro che conteneva tutti gli spermatozoi.

Il punto di entrata dello spermatozoo è il punto in cui si propaga l'ondata di calcio. Il rilascio di calcio fa distaccare così le pareti della membrana. In alcuni casi possiamo avere una riprogrammazione quindi solo le cellule specificate possono subire un differenziamento reversibile.

Se le cellule fossero state determinate avrebbero mantenuto, almeno in parte, le caratteristiche che avrebbero avuto se fossero rimaste nella posizione in cui le avremmo prelevate. Per arrivare a questo stadio di differenziamento ci saranno cellule che modificheranno l'espressione delle proteine fino ad arrivare ad avere un fenotipo differenziato.

Influenze esterne sullo sviluppo

La simmetria si manifesta precocemente all'interno dello zigote. Le influenze esterne saranno sulla comunicazione cellulare sia di tipo justacrino, paracrino che endocrino. L'autocrino si vede in altre fasi.

La simmetria di localizzazione è retta dalla regolazione delle proteine di trasporto che mediano l'interazione con il citoscheletro sottostante. La simmetria di distribuzione citoplasmatica viene mantenuta quando si passa alla divisione cellulare. Questa divisione può mantenere la polarità presente nella cellula madre e propaga questa asimmetria di distribuzione nelle cellule figlie.

Oltre al fatto di avere una distribuzione qualitativa dei messaggeri e delle proteine, possiamo avere un'asimmetria nelle dimensione delle due cellule prodotte. Osserviamo delle differenze da un punto di vista morfologico.

Se riprendiamo il riccio di mare, nei primi tre cicli di divisione, le cellule sono quantitativamente di dimensioni equivalenti e si parla di mesomeri. Quando proseguiamo la divisione (fino a 8 cellule) le dimensioni rimarranno uguali. Se andiamo avanti avremo divisioni asimmetriche da un punto di vista quantitativo ma soprattutto da un punto di vista citoplasmatico. Se sul polo animale continuiamo ad avere mesomeri uguali, sul polo vegetativo la situazione sarà diversa. Quindi avremo macromeri (hanno mantenuto una quantità di citoplasma maggiore rispetto ai micromeri) e micromeri.

Proseguendo con le divisioni manteniamo questa struttura del polo animale macromerica. Nel polo vegetativo i macromeri vanno incontro a divisione asimmetrica e in punta troveremo sempre i micromeri. I micromeri, viscosamente e dimensionalmente sono diversi rispetto ai mesomeri. Una differenza sta nel fatto che hanno una specificazione autonoma e se isolati continuano a formare strutture che dovevano formare rimanendo all'interno della blastociste stessa. In compenso, loro influenzeranno le altre molecole.

Sulla specificazione delle cellule del polo vegetativo un ruolo importante è quello delle beta catenina:

• È un fattore trascrizionale ed è la molecola responsabile della specificazione dei micromeri e della loro capacità di indurre le cellule vicine a dar origine a strutture endodermiche e mesodermiche.
• Determina gli assi corporei.

I micromeri sono cellule che troviamo alla punta del polo vegetativo e sono suddivisi in micromeri grandi o piccoli. Possiamo tracciare, con le divisioni delle cellule successive, quali cellule derivano da quale divisione fino a capire quale tessuto verrà prodotto da queste stesse cellule figlie. Le cellule del polo animale ci porteranno ad avere le cellule dell'ectoderma (orale e aborale) del riccio di mare. I micromeri grandi portano a quello che sarà il celoma (parte digestiva).

Si possono fare delle manipolazioni. Possiamo fare cambiamenti a livello molecolare. Se guardiamo le marcature più scure, esse identificano lo strato sottostante al polo vegetativo e la distribuzione della beta catenina. A 16 cellule la marcatura della beta catenina si concentra sui micromeri sul fondo della blastociste.

Manipolazioni e sviluppo embrionale

Una manipolazione può essere:

• Cambiare la concentrazione ionica e alterare i passaggi, in modo tale che la beta catenina venga lasciata non distrutta e possa essere trasportata nei nuclei e non soltanto nelle cellule specifiche. In questo caso non abbiamo uno sviluppo che permetta di avere tutte le strutture, ma abbiamo uno sviluppo anomalo perché non c'è più l'asimmetria e le cellule diventano tutte organizzatrici, questo fa sì che non ci sia più lo sviluppo normale. Lo stesso se si fa l'inverso, quindi se si impedisce la specificazione del polo vegetativo. Le cellule continuano a essere micromeri piccoli ma non c'è più la comunicazione, abbiamo alterato così lo sviluppo embrionale.

Una distribuzione asimmetrica potrebbe non avere niente a che vedere con la specificazione delle cellule vegetative. Il nematode è un altro modello sperimentale. Gli studi che sono stati fatti sui nematodi riguardano il ruolo della morte cellulare nello sviluppo embrionale. Cellula per cellula è stato possibile capire quali cellule vanno incontro a morte. In questo caso passiamo tramite una prima fase, la segmentazione, dove c'è la riduzione del volume cellulare. Il piano in cui avviene questa fase è diverso dal riccio di mare. Se ci concentriamo sulle prime fasi dello sviluppo embrionale vediamo come abbiamo subito delle distribuzioni asimmetriche delle parti anteriore e posteriore. Attraverso la distribuzione asimmetrica dei granuli P, possiamo seguire quello che ci identificherà le cellule germinali del nematode. La localizzazione dei granuli P corrisponde alla localizzazione delle cellule germinali nel nematode.

Nel secondo ciclo solo una delle cellule figlie ha ereditato i granuli P. Continuando avremmo un ciclo di divisione dove avremmo la produzione di cellule muscolari e di cellule della linea della cellula germinali. Quindi tutte le cellule germinali derivano dallo stesso blastomero, cioè quello che aveva ereditato i granuli P. Molto precocemente queste cellule sono separate da tutte le cellule somatiche del nematode.