Appunti genetica umana

SINE

La famiglia che più rappresenta questa classe di sequenze è la sequenza Alu.

Probabilmente la sequenza Alu deriva per retrotrasposizione dal gene dell’RNA 7SL, trascritto dalla RNA PolIII;

Alu è una sequenza piccola e corta e, se taglio con l’enzima di restrizione Alu per poi ibridarlo, avrò un’ibridazione

continua. Ogni 4Kb circa c’è una sequenza Alu.

Queste sequenze sono ricche in GC e sono localizzate nelle bande G chiare metafasiche.

La tipica sequenza Alu è un dimero ripetuto in tandem di 130 bp; nella regione terminale è presente una corta

sequenza ricca in residui A.

Tra i due dimeri vi è una asimmetria dovuta all’inserzione di un elemento di 32 nt all’interno della seconda

ripetizione.

La tipica sequenza Alu è lunga 280 nucleotidi, formando da un dimero, c’è un inserimento nel monomero destro di 32

bp.

Le sequenze Alu sono prive del promotore, che non è espresso.

Il fatto che siano estremamente presenti nel genoma ha ipotizzato che i promotori si disappaino, essendo

responsabili di meccanismi di duplicazione dei geni.

Alu sono presenti solo nei primati, non ci sono ad esempio nel topo.

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Gli elementi Alu sono classificati in sottofamiglie che si

differenziano per l’epoca della loro integrazione nel

genoma, dalle più antiche Sx, K alla più recenti (Yc1 etc).

Danni genomici indotti da Alu Numerose patologie sono provocate dall'integrazione

casuale di Alu (Neurofibromatosi o emofilia, ad

esempio), che interrompe il frame degli esoni, o da

crossing over ineguale (diabete di tipo II, sindrome di

Lesch–Nyhan, malattia di Tay–Sachs, ipercolesterolemia

familiare, α-talassemia..) per appaiamento erroneo di

sequenze Alu e si può generare una copia in cui si

perdono esoni o copie in cui l’esone è duplicato..

SVA (SINE/VNTR/Alu)

Sono molto più grandi, 1.3Kb, hanno una struttura Alu-Like, ovvero dimero Alu, ma hanno anche sequenze ripetute in

tandem e strutture simile a strutture virale (HERV-like). 17

2. RIPETUTE IN TANDEM

Sono sequenze molto importati perché alcune svolgono un ruolo strutturale fondamentale all’interno di cromosomi,

altre sono state invece molto utilizzate grazie alle loro caratteristiche per la diagnostica molecolare, questo perché

alcune di queste famiglie sono alla base di una serie di polimorfismi all’interno del genoma.

DNA ripetuto in tandem DNA ripetuto intersperso

Quello ripetuto in tandem ha un’unità di ripetizione variabile, dove il monomero può andare da 2 a 200 nucleotidi.

Prevalentemente l’eterocromatina costitutiva è formata da DNA ripetuto in tandem.

I blocchi possono essere presenti su più cromosomi.

Com’è stato scoperto il DNA satellite?

Il nome "DNA satellite" si riferisce a come ripetizioni di una breve DNA sequenza tendono a

produrre una frequenza diversa dei nucleotidi adenina, citosina, guanina e timina, e quindi

avere una densità diversa del DNA tale da formare una seconda o "banda satellitare" quando

il DNA genomico è separato su un gradiente di densità.

Nell’esperimento gli acidi nucleici sono stati coperti con un gradiente di cesio, un sistema in

cui il DNA si mescola a del cesio e viene poi sottoposto a una centrifugazione molto forte. Il

DNA si posizionerà in funzione al peso delle basi che lo compongono.

Mescolando il DNA con EtBr e con una successiva visione a lampada UV risultavano tre

bande ricche in AT (1, 2, 3, sequenze ripetute) che galleggiavano sulla banda principale.

Classi principali di DNA ripetuto in tandem: classificazione in base alla grandezza totale del blocco ripetuto

1# DNA satellite, presente a livello del centromero, spesso in blocchi lunghi. Di questi fanno parte:

α

- satellite (alfoide) ha un monomero di 171 nucleotidi, è presente su tutti i cromosomi

β

- satellite: ha un monomero di 68 nucleotidi e non è presente su tutti i cromosomi, ma solo su quelli acrocentrici, e

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sui cromosomi 1, 9 e Y.

- satellite 1 piccoli, in tutte regioni di eterocromatina

- satelliti 2 e 3 piccoli, in tutte le regioni di eterocromatina β-satellite

I cromosomi acrocentrici possiedono il a fiancheggiare la parte di DNA

corrispondente al DNA per l’rRNA, che prende il nome di stalk.

Come fa a essere trascritto questo DNA per l’rRNA essendo in ambiente molto condensato?

Il centromero in linea di massima non viene trascritto, ma lo stalk sì.

β-satellite

Il forma una sorta di barriera permettendo la trascrizione dell’rRNA.

α-satelliti (DNA alfoide)

Il monomero è evidenziato dal taglio di enzima di restrizione EcoRI

Il numero di monomeri dipende dai siti per l’enzima di restrizione EcoRI.

L’alfoide, pur avendo un monomero di 171 nucleotidi, è cromosoma specifico.

Se li allineiamo possiamo evidenziare che ogni cromosoma non è perfettamente uguale, ma

avrà consensus diverse.

Sarà possibile quindi utilizzare sonde alfoide-specifiche per evidenziare il cromosoma X, marcandolo.

Gli unici alfoidi non specifici sono gli acrocentrici, questi cromosomi condividono l’alfoide anche ad alta stringenza

(cromosoma 13 e 21)

Elementi essenziali di un cromosoma

1. Il centromero

Definizione storica: Flemming nell’800 lo definisce come la costrizione primaria del cromosoma, che era visibile

citologicamente.

Definizione genetica: 1900. E’ definito come regione cromosomica essenziale per la corretta segregazione dei

cromosomi che non presenta ricombinazione meiotica.

Definizione odierna: è definito come sito della formazione del cinetocore; permette l’attacco delle fibre del fuso al

cromosoma ed è responsabile dell’appaiamento dei cromatidi fratelli.

Una volta attaccato permette di dividere i cromosomi omologhi nella meiosi, mitosi.. Rappresenta uno dei checkpoint.

È fatto da tre regioni: - Dominio di appaiamento: permette ai cromatidi fratelli di stare

uniti e permette durante l’anafase che si separino. Qui ci sono sei

proteine (proteine centromeriche chiamate CENP): INCENP, Aurora B,

Survivina, Borealina, CSC1, TD60.

Le prime tre formano un complesso fondamentale sia nella

condensazione dei cromosomi sia nella citochinesi permettendo la

divisione.

- Dominio del cinetocore: il cinetocore è formato da due piastre,

interna ed esterna, che hanno le seguenti funzioni:

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centrale;

Piastra esterna a contatto con fibre del fuso.

A seconda del tipo di regione che si sta analizzando si

avranno proteine diverse:

1.CENP-A che è sulla piastra interna e prende

contatto con dominio centrale.

2. CENP-C si lega ai microtubuli, è come se fosse un

appiccichino

- Dominio centrale contiene tutto il DNA alfoide di

ogni centromero e il DNA satellite 1, 2, 3, in più a

livello dei cromosomi acrocentrici + 1,3 + 9 e y beta

satellite

Il DNA alfa ha sequenza consenso che permettono il

legame con proteina CENP-B.

2. I telomeri

Mantengono l’integrità strutturale del cromosoma

Danno informazione sull’età, le cellule vecchie hanno telomeri corti, Dolly è morta perché aveva telomeri troppo

corti, derivando da cellula somatica e non embrionale.

La telomerasi non è attiva nelle cellule somatiche, la sua riattivazione comporta proliferazione incontrollata

Grazie alla telomerasi abbiamo TTAGGG ripetuta n volte che è un mini satellite.

Nelle cellule germinali la telomerasi funziona.

Ci sono sequenze che sono marcatori di ogni telomero.

Ogni telomero ha sequenze particolari terminali di circa 10-40Kb che permettono di distinguere il telomero del

cromosoma 1, ad esempio, rispetto al telomero del

cromosoma 5.

Le regioni peritelomeriche sono quelle più ricche di geni,

ma sono in tendenza di accorciamento.

Perché sono di più in fondo piuttosto che in mezzo? Perché

non sono sequenze di eterocromatina, sono più accessibili.

Vicino al centromero sono sempre più compattate e non

accessibili.

Origini di replicazione: agiscono in cis, localizzate nelle immediate vicinanze dei punti in cui inizia la sintesi del DNA.

Li hanno scoperti utilizzando un plasmide con pezzi di DNA di lievito mutante e si è osservato che si replicavano solo

quelli contenenti la sequenza core.

Il lievito è stato possibile mediante test genici isolare delle sequenze a replicazione autonoma ARS.

Se riesco a produrre un cromosoma e replicare, riuscendo a mettere il plasmide è possibile supplementare malattie

dove manca qualcosa e la replicazione produce la proteina, ma come costruire un centromero, dato che gli ORI sono

di lievito e non si sa se funzionano nell’uomo? In vitro con monomeri che si concatenano più volte.

2# Minisatellliti

Da 0.1 a 20Kb.

famiglie telomeriche: 3-20Kb di unità ripetutete in tandem di 6 nucleotidi TTAGGG che vengono aggiunti da

telomerasi.

famiglie ipervariabili: VNTR. Sono sequenze altamente polimorfiche organizzate in 1000 schieramenti di corte

unitàè ripetute in tandem.

Le unità ripetute variano considerevolmente per dimensioni, ma hanno una sequenze centrale comune detta core.

Costituiscono uno dei marcatori più utili in genetica, in cui si ha un monomero che va da 9 a 64 nt e sono polimorfiche

della ripetizione. 20

Utile per il fingerprint a DNA.

Usando, ad esempio, una sonda ripetuta (AGAGGTGGGCAGGTGG), corrispondente al monomero

presente in più di 60 loci (o posizioni del genoma), tagliando con l’enzima HinF1 si tagliano tutti .

Analizzando due gemelli omozigoti avranno uguale lettura, con frammenti di peso esattamente

uguali.

Analizzando padre e figlio questi due condivideranno il 50% delle bande, perché il restante 50%

deriva dalla madre.

E’ il miglior sistema di organizzazione perché sono 60 loci.

Bisogna poi fare la Southern Blot, utilizzare tanto DNA e la marcatura di sonde, più atrli passaggi.

E’ una tecnica precisa ma che è stata abbandonata per l’elevato costo.

3# Microsatelliti o Simple Sequence Repeats (SRR)

Uguali a VNTR. Sono piccoli schieramenti ripetuti lungo tutto il genoma, di cui rappresentano il 2%.

Sono altamente polimorfici, in quanto abbiamo per ogni locus tantissimi alleli che differiscono per pochi alleli

100 nucleotidi, da 1 a 6 nucleotidi di unità di ripetizione. 21

Browser UCSC: è un browser che dà informazioni su DNA/RNA, ottenendo una rappresentazione grafica di

una regione del genoma

Sequenze EST: derivanti da sequenziamento da librerie di cDNA. Per sapere da che tessuto viene espresso

un certo gene si utilizza EST come sonda. Al giorno d’oggi non serve più perché tutto il genoma è stato

sequenziato.<