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Appunti di genetica umana basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Morozzi dell’università degli Studi di Milano - Unimi, facoltà di Medicina e Chirurgia, Corso di laurea in biotecnologie mediche. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Genetica umana e medica docente Prof. A. Marozzi

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Possono raggiungere un elevato numero di copie (sequenze Alu e LINE-1)

La maggior parte dei geni codifica per polipeptidi ma esistono anche geni che codificano per molecole mature di RNA

con diverse funzioni. L'RNA non codificante in biologia molecolare è

RNA un trascritto genico che non va incontro a traduzione; ciò

significa che il gene che codifica per tale RNA non codifica per

536 una proteina ma semplicemente per una molecola di RNA (e

quindi non un mRNA, perché altrimenti andrebbe incontro a

1500 500 traduzione). L'RNA non codificante può svolgere diverse

200 funzioni: può essere un RNA ribosomiale (rRNA), RNA

100

200 transfer (tRNA) oppure può essere un componente di

complessi enzimatici implicati nei processi di trascrizione,

r RNA t RNA replicazione, splicing e in altri processi riguardanti l'espressione

miRNA snRNA genica. Fra l'RNA non codificante si possono citare i long non

snoRNA RNA antisenso coding RNA (NcRNA), che sono trascritti lunghi più di 200

nucleotidi che non codificano per proteine . Tali RNA sono

oggetto di ricerca odierna e sembrano essere coinvolti in molti meccanismi biologici: splicing, stoccaggio di mi-RNA,

processi trascrizionali e post-trascrizionali, e tutta una serie di patologie ad essi associate. In particolare, riferendosi a

meccanismi epigenetici, sono in grado di reclutare DNA-metiltransferasi e modificare in questo modo il pattern

epigenetico a vari livelli.

Possiamo codificarli in varie classi:

- coinvolti in sintesi proteica: rRNA, tRNA, rRNA

- coinvolti in maturazione RNA: snRNA,…

- coinvolti nella regolazione genica

1. Long ncRNAs

antisenso (down regolazione)

modificati e vanno a regolare altri geni, inattivazione dell’X (xist e tsix)

2. miRNA (down regolazione) 13

14

Le sequenze ripetute

1. INTERSPERSE

Il DNA ripetuto intersperso è formato singole unità sparse nel genoma e viene suddiviso in quattro classi:

- LTR, tra cui ricordiamo ERV, di lunghezza media 1.3Kb

- Trasposoni a DNA

- Short Interspersed Nuclear Elements (SINE) tra cui le Alu (300bp) e le sequenze MIR.

- Long interspersed Nuclear Elements (LINE), tra cui ricordiamo LINE-1 (famiglia KPN) di lunghezza completa 6.1Kb, ma

le dimensioni medie sono di 0.8Kb. 14 Elementi trasponibili

Possono essere di due tipi:

Trasposoni: trasposti tramite DNA. Avvengono

più raramente, sono sequenze di DNA mobile che

possono migrare in posizioni differenti nel genoma

e da essi derivano la gran parte delle sequenze

intersperse non codificanti.

Opposti ai trasposoni ci sono i retrotrasposoni,

frammenti di DNA capaci

di trascriversi autonomamente in un intermedio ad

RNA e conseguentemente replicarsi in diverse

posizioni all'interno del genoma.

La differenza sostanziale tra questi due è che i

trasposoni a DNA sono un evento molto raro nel

genoma umano. Esso non prevede duplicazione,

ma spostamento. E’ una trasposizione di tipo

conservativo, mentre i retrotrasposoni prevedono

una trasposizione replicativa.

La retrotrasposizione è un evento molto frequente

nel genoma.

I retrotrasposoni (a RNA) sono classificabili in due grosse classi:

una classe incapace di codificare la trascrittasi inversa e che sfrutta la trascrittasi inveesa di altre sequenze per

potersi espandere nel genoma (famiglia non virale) e gli pseudogeni che derivano da retrotrasposizione appartengono

a questa famiglia.

Una sequenza Alu è una breve sequenza interspersa di DNA (SINE) originariamente caratterizzata come sito di

taglio riconosciuto dall'endonucleasi Alu, un enzima di restrizione.

Queste sequenze derivano dall'RNA con un promotore interno per Pol III. Si stima che le sequenze Alu presenti nel

genoma umano siano più di un milione e che quindi rappresentino il 10.7% del genoma umano totale.

una classe capace di codificare la trascrittasi inversa, una famiglia virale.

Può retrotrasporre tutte le sequenze presenti nel genoma.

All’interno di questa classe ci sono a sua volta due ramificazioni:

1. Famiglia con LTR, derivanti da retrovirus

Gli elementi LTR (6‐7kb) presentano analogie con i retrovirus.

retrovirus: costituito da LTR (Long Terminal Repeat) alle estremità,

sequenze al 5’ e al 3’ e tre geni: gag (capside), pol(retrotrascrizione),

env (envelope).

Nel genoma abbiamo un 8% di questa tipologia o parzialmente difettivi.

Portano a famiglie HERV o RTLV.

2. Famiglia senza LTR, ‘virus-like’ , porta alle famiglie LINE ed è caratterizzata dall’assenza di sequenze LTR.

Esse hanno un altro tipo di promotore e due soli ORF, di cui uno per la trascrittasi inversa.

Le sequenze LINE rappresentano il 21% e sono molto

diverse dalle sequenze SINE.

I retrotrasposoni privi di LTR : possono risultare

autonomi (LINE-1) o non autonomi (ALU e SVA)

LINE: Line-1 ha due esoni e possiede 5’ e 3’ UTR.

Ci sono sequenze ripetute indirette TDR, che

permettono l’allineamento sul genoma e, tramite

tagli, di inserire sequenze all’interno del genoma

stesso.

SINE: comprende Alu (280bp), che ha una coda poliA

e due monomeri.

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E le SVA (3Kpb), che contengono un elemento di minisatellite, che rappresenta sequenze ripetute in tandem: è una

miscellanea.

Possiamo affermare che le sequenze LINE sono autonome, mentre SINE e gli pseudogeni processati derivano

dall’azione delle LINE.

Hanno tutte:

- TDS, code che permettono di muoversi

- Poli A, da cui comincia la retrotrascrizione

Le sequenze LINE

sono moltissime nel genoma e la caratteristica della struttura delle LINE, in particolare dell’elemento consenso

LINE-1 della famiglia KPN, è di avere due ORF:

ORF1 che codifica per la proteina p40, che è una proteina RNA binding protein

ORF2 che possiede un dominio esonucleasico e uno con attività di trascrittasi inversa.

Nell’elemento consenso LINE-1 è contenuto il promotore per la Polimerasi II, quindi possono essere espresse.

All’altra estremità c’è una coda di poli A.

Una volta espresse si possono spostare all’interno del genoma, dove si riproducono tali e quali e si spostano in zone

ricche di A o T in modo che si appaino.

Si autoreplicano.

Trovare nel genom una sequenza intera LINE-1 (KPN) da 6.1 Kb è molto difficile, soprattutto perché la

retrotrascrittasi fa fatica a trascriverlo tutto, quindi più spesso si hanno pezzi più corti di KPN.

Sono molto presenti all’interno dei geni, in particolare nelle regioni a livello degli introni

Una sequenza LINE è in grado di fare exon shuffling, ovvero sono i grado di trasportare gli esoni da un gene a un

altro in modo tale da permettere l'assemblaggio delle diverse unità funzionali di una proteina in nuove combinazioni

evolutivamente vantaggiose.

Se una LINE è presente dentro l’introne di un gene si esprime e, trascrivendosi, incontra un esone. Ciò che si ottiene è

un gene che contiene esone di un altro gene. Può essere pericoloso, potenzialità patogenetica. Oppure si può

produrre proteina con nuove caratteristiche.

Sono localizzati nelle bande G scure metafasiche.

SINE

La famiglia che più rappresenta questa classe di sequenze è la sequenza Alu.

Probabilmente la sequenza Alu deriva per retrotrasposizione dal gene dell’RNA 7SL, trascritto dalla RNA PolIII;

Alu è una sequenza piccola e corta e, se taglio con l’enzima di restrizione Alu per poi ibridarlo, avrò un’ibridazione

continua. Ogni 4Kb circa c’è una sequenza Alu.

Queste sequenze sono ricche in GC e sono localizzate nelle bande G chiare metafasiche.

La tipica sequenza Alu è un dimero ripetuto in tandem di 130 bp; nella regione terminale è presente una corta

sequenza ricca in residui A.

Tra i due dimeri vi è una asimmetria dovuta all’inserzione di un elemento di 32 nt all’interno della seconda

ripetizione.

La tipica sequenza Alu è lunga 280 nucleotidi, formando da un dimero, c’è un inserimento nel monomero destro di 32

bp.

Le sequenze Alu sono prive del promotore, che non è espresso.

Il fatto che siano estremamente presenti nel genoma ha ipotizzato che i promotori si disappaino, essendo

responsabili di meccanismi di duplicazione dei geni.

Alu sono presenti solo nei primati, non ci sono ad esempio nel topo.

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Gli elementi Alu sono classificati in sottofamiglie che si

differenziano per l’epoca della loro integrazione nel

genoma, dalle più antiche Sx, K alla più recenti (Yc1 etc).

Danni genomici indotti da Alu Numerose patologie sono provocate dall'integrazione

casuale di Alu (Neurofibromatosi o emofilia, ad

esempio), che interrompe il frame degli esoni, o da

crossing over ineguale (diabete di tipo II, sindrome di

Lesch–Nyhan, malattia di Tay–Sachs, ipercolesterolemia

familiare, α-talassemia..) per appaiamento erroneo di

sequenze Alu e si può generare una copia in cui si

perdono esoni o copie in cui l’esone è duplicato..

SVA (SINE/VNTR/Alu)

Sono molto più grandi, 1.3Kb, hanno una struttura Alu-Like, ovvero dimero Alu, ma hanno anche sequenze ripetute in

tandem e strutture simile a strutture virale (HERV-like). 17

2. RIPETUTE IN TANDEM

Sono sequenze molto importati perché alcune svolgono un ruolo strutturale fondamentale all’interno di cromosomi,

altre sono state invece molto utilizzate grazie alle loro caratteristiche per la diagnostica molecolare, questo perché

alcune di queste famiglie sono alla base di una serie di polimorfismi all’interno del genoma.

DNA ripetuto in tandem DNA ripetuto intersperso

Quello ripetuto in tandem ha un’unità di ripetizione variabile, dove il monomero può andare da 2 a 200 nucleotidi.

Prevalentemente l’eterocromatina costitutiva è formata da DNA ripetuto in tandem.

I blocchi possono essere presenti su più cromosomi.

Com’è stato scoperto il DNA satellite?

Il nome "DNA satellite" si riferisce a come ripetizioni di una breve DNA sequenza tendono a

produrre una frequenza diversa dei nucleotidi adenina, citosina, guanina e timina, e quindi

avere una densità diversa del DNA tale da formare una seconda o "banda satellitare" quando

il DNA genomico è separato su un gradiente di densità.

Nell’esperimento gli acidi nucleici sono stati coperti con un gradiente di cesio, un sistema in

cui il DNA si mescola a del cesio e viene poi sottoposto a una centrifugazione molto forte. Il

DNA si posizionerà in funzione al peso delle basi che lo compongono.

Mescolando il DNA con EtBr e con una successiva visione a lampada UV risultavano tre

bande ricche in AT (1, 2, 3, sequenze ripetute) che galleggiavano sulla banda principale.

Classi principali di DNA ripetuto in tandem: classificazione in base alla grandezza totale del blocco ripetuto

1# DNA satellite, presente a livello del centromero, spesso in blocchi lunghi. Di questi fanno parte:

α

- satellite (alfoide) ha un monomero di 171 nucleotidi, è presente su tutti i cromosomi

β

- satellite: ha un monomero di 68 nucleotidi e non è presente su tutti i cromosomi, ma solo su quelli acrocentrici, e

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sui cromosomi 1, 9 e Y.

- satellite 1 piccoli, in tutte regioni di eterocromatina

- satelliti 2 e 3 piccoli, in tutte le regioni di eterocromatina β-satellite

I cromosomi acrocentrici possiedono il a fiancheggiare la parte di DNA

corrispondente al DNA per l’rRNA, che prende il nome di stalk.

Come fa a essere trascritto questo DNA per l’rRNA essendo in ambiente molto condensato?

Il centromero in linea di massima non viene trascritto, ma lo stalk sì.

β-satellite

Il forma una sorta di barriera permettendo la trascrizione dell’rRNA.

α-satelliti (DNA alfoide)

Il monomero è evidenziato dal taglio di enzima di restrizione EcoRI

Il numero di monomeri dipende dai siti per l’enzima di restrizione EcoRI.

L’alfoide, pur avendo un monomero di 171 nucleotidi, è cromosoma specifico.

Se li allineiamo possiamo evidenziare che ogni cromosoma non è perfettamente uguale, ma

avrà consensus diverse.

Sarà possibile quindi utilizzare sonde alfoide-specifiche per evidenziare il cromosoma X, marcandolo.

Gli unici alfoidi non specifici sono gli acrocentrici, questi cromosomi condividono l’alfoide anche ad alta stringenza

(cromosoma 13 e 21)

Elementi essenziali di un cromosoma

1. Il centromero

Definizione storica: Flemming nell’800 lo definisce come la costrizione primaria del cromosoma, che era visibile

citologicamente.

Definizione genetica: 1900. E’ definito come regione cromosomica essenziale per la corretta segregazione dei

cromosomi che non presenta ricombinazione meiotica.

Definizione odierna: è definito come sito della formazione del cinetocore; permette l’attacco delle fibre del fuso al

cromosoma ed è responsabile dell’appaiamento dei cromatidi fratelli.

Una volta attaccato permette di dividere i cromosomi omologhi nella meiosi, mitosi.. Rappresenta uno dei checkpoint.

È fatto da tre regioni: - Dominio di appaiamento: permette ai cromatidi fratelli di stare

uniti e permette durante l’anafase che si separino. Qui ci sono sei

proteine (proteine centromeriche chiamate CENP): INCENP, Aurora B,

Survivina, Borealina, CSC1, TD60.

Le prime tre formano un complesso fondamentale sia nella

condensazione dei cromosomi sia nella citochinesi permettendo la

divisione.

- Dominio del cinetocore: il cinetocore è formato da due piastre,

interna ed esterna, che hanno le seguenti funzioni:

19 Piastra interna a diretto contatto con il dominio

centrale;

Piastra esterna a contatto con fibre del fuso.

A seconda del tipo di regione che si sta analizzando si

avranno proteine diverse:

1.CENP-A che è sulla piastra interna e prende

contatto con dominio centrale.

2. CENP-C si lega ai microtubuli, è come se fosse un

appiccichino

- Dominio centrale contiene tutto il DNA alfoide di

ogni centromero e il DNA satellite 1, 2, 3, in più a

livello dei cromosomi acrocentrici + 1,3 + 9 e y beta

satellite

Il DNA alfa ha sequenza consenso che permettono il

legame con proteina CENP-B.

2. I telomeri

Mantengono l’integrità strutturale del cromosoma

Danno informazione sull’età, le cellule vecchie hanno telomeri corti, Dolly è morta perché aveva telomeri troppo

corti, derivando da cellula somatica e non embrionale.

La telomerasi non è attiva nelle cellule somatiche, la sua riattivazione comporta proliferazione incontrollata

Grazie alla telomerasi abbiamo TTAGGG ripetuta n volte che è un mini satellite.

Nelle cellule germinali la telomerasi funziona.

Ci sono sequenze che sono marcatori di ogni telomero.

Ogni telomero ha sequenze particolari terminali di circa 10-40Kb che permettono di distinguere il telomero del

cromosoma 1, ad esempio, rispetto al telomero del

cromosoma 5.

Le regioni peritelomeriche sono quelle più ricche di geni,

ma sono in tendenza di accorciamento.

Perché sono di più in fondo piuttosto che in mezzo? Perché

non sono sequenze di eterocromatina, sono più accessibili.

Vicino al centromero sono sempre più compattate e non

accessibili.

Origini di replicazione: agiscono in cis, localizzate nelle immediate vicinanze dei punti in cui inizia la sintesi del DNA.

Li hanno scoperti utilizzando un plasmide con pezzi di DNA di lievito mutante e si è osservato che si replicavano solo

quelli contenenti la sequenza core.

Il lievito è stato possibile mediante test genici isolare delle sequenze a replicazione autonoma ARS.

Se riesco a produrre un cromosoma e replicare, riuscendo a mettere il plasmide è possibile supplementare malattie

dove manca qualcosa e la replicazione produce la proteina, ma come costruire un centromero, dato che gli ORI sono

di lievito e non si sa se funzionano nell’uomo? In vitro con monomeri che si concatenano più volte.

2# Minisatellliti

Da 0.1 a 20Kb.

famiglie telomeriche: 3-20Kb di unità ripetutete in tandem di 6 nucleotidi TTAGGG che vengono aggiunti da

telomerasi.

famiglie ipervariabili: VNTR. Sono sequenze altamente polimorfiche organizzate in 1000 schieramenti di corte

unitàè ripetute in tandem.

Le unità ripetute variano considerevolmente per dimensioni, ma hanno una sequenze centrale comune detta core.

Costituiscono uno dei marcatori più utili in genetica, in cui si ha un monomero che va da 9 a 64 nt e sono polimorfiche

della ripetizione. 20

Utile per il fingerprint a DNA.

Usando, ad esempio, una sonda ripetuta (AGAGGTGGGCAGGTGG), corrispondente al monomero

presente in più di 60 loci (o posizioni del genoma), tagliando con l’enzima HinF1 si tagliano tutti .

Analizzando due gemelli omozigoti avranno uguale lettura, con frammenti di peso esattamente

uguali.

Analizzando padre e figlio questi due condivideranno il 50% delle bande, perché il restante 50%

deriva dalla madre.

E’ il miglior sistema di organizzazione perché sono 60 loci.

Bisogna poi fare la Southern Blot, utilizzare tanto DNA e la marcatura di sonde, più atrli passaggi.

E’ una tecnica precisa ma che è stata abbandonata per l’elevato costo.

3# Microsatelliti o Simple Sequence Repeats (SRR)

Uguali a VNTR. Sono piccoli schieramenti ripetuti lungo tutto il genoma, di cui rappresentano il 2%.

Sono altamente polimorfici, in quanto abbiamo per ogni locus tantissimi alleli che differiscono per pochi alleli

100 nucleotidi, da 1 a 6 nucleotidi di unità di ripetizione. 21

Browser UCSC: è un browser che dà informazioni su DNA/RNA, ottenendo una rappresentazione grafica di

una regione del genoma

Sequenze EST: derivanti da sequenziamento da librerie di cDNA. Per sapere da che tessuto viene espresso

un certo gene si utilizza EST come sonda. Al giorno d’oggi non serve più perché tutto il genoma è stato

sequenziato.

Insulator: regioni di DNA con funzioni di spaziatori, essi interagiscono con gli enhancer e ne facilitano

l’azione. Sono inoltre regioni con funzione regolatoria.

Con UCSC si predice la regione, per verificare che essa sia giusta si fa un saggio della doppia luciferasi.

La nostra sequenza in teoria dovrebbe regolare il promotore.

Pertanto metto il promotore con il gene della luciferasi.

Ho un polilinker in cui clono la sequenza regolatoria a monte del promotore; in questo modo osservo se

induce/inibisce la trascrizione.

L’insulator da solo inbisce, ma nel contesto genomico con anche le sequenze, esso funziona da enhancer.

Nelle alte cellule inibisce sempre.

E’ dunque una regione regolatoria tessuto specifica.

- Un altro dato ottenibile dalla banca dati è lo stato di conservazione, più una regione è conservata più ha

un’attività importante in termini regolatori.

- E’ possibile valutare che tipi di sequenze ripetute si hanno

Saggi luciferasici: fatti con promotore di tipo virale

_____________________________________________________

Il nucleo

Il nucleo è sede di processi fondamentali catalizzati da apparati proteici organizzati.

Ogni cromosoma ha una propria localizzazione all’interno del nucleo e ciò comporta una conseguenza sull’espressione

dei geni in essi contenuti.

L’involucro nucleare è composto da due membrane concentriche, tra cui abbiamo lo spazio perinucleare.

Le membrane si uniscono a livello dei pori nucleari. La membrana più interna è direttamente connessa con una

struttura presente sulla superficie interna della membrana, la lamina nucleare; quella più esterna è invece a contatto

con il reticolo endoplasmatico (RE). Tra le funzioni del poro quella principale è quella deputata al trasporto; in

particolare, si occupa del trasporto di ioni e piccole molecole, ma anche di

trasporto attivo e selettivo per alte sostanze e proteine.

Inoltre, esprimiamo geni che vengono trascritti e vanno nel citoplasma,

dove sono tradotti in proteine e spesso poi rientrano nel nucleo.

La lamina nucleare è composta da tre lamine molto importanti, che costituiscono una rete di proteine insolubili adesa

al versante nucleoplasmatico:

- Sono di tre tipi: A, B, C

- Dal momento che formano una rete sono un sostegno per il nucleo e, interagendo con i telomeri, mantengono i

cromosomi nelle corrette posizioni 22

- Sono piccole (60-70Kd)

- Sono presenti in bassa percentuale dal punto di vista eucariotico ma, essendo conservate, hanno una funzione

fondamentale

- La loro fosforilazione rappresenta uno degli step fondamentali in mitosi e meiosi, in particolare nella distruzione

della membrana nucleare

- Esistono delle patologie dette laminopatie, tra cui la distrofia muscolare Emery-Dreifuss e la sindrome di Progeria.

Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome

La progeria è una sorta di invecchiamento precoce ed è un malattia con incisione

1:8.000.000, pertanto è una malattia molto rara.

Questa malattia è dovuta una mutazione nella lamina A. Ciò comporta un accumulo della

lamina A che rimane in una forma farnesilica e ne consegue un’alterazione strutturale

della lamina, che conduce a una fragilità di quest’ultima, portando a una maggior

probabilità di rottura della membrana.

I cromosomi non sono posizionati inoltre in una maniera corretta e, poiché tutte le

cellule sono colpite, i bambini invecchiano molto precocemente.

I nuclear bodies

All’interno del nucleo sono presenti sub-organizzazioni a domini, detti nuclear bodies; essi sono rappresentati da

organelli quali i nucleoli, i corpi di Cajal, i granuli intercromatinici o speckles…

La loro caratteristica principale è che sono sprovvisti di membrana, diversamente da tutti i compartimenti

citoplasmatici. Non avendo le membrane sono strutture molto dinamiche e si formano /sformano a seconda dei

bisogni della cellula.

All’interno del nucleo ci sono foci nucleari, accumuli di RNA proteine, che si formano e si disgregano continuamente.

Utilizzando anticorpi diretti contro alcuni componenti di determinati organelli è possibile vederli.

La funzione di questi organuli è quella di concentrare in un piccolo spazio una serie di reagenti/substrati, in modo che

le reazioni avvengano più velocemente, ottenendo così un guadagno energetico.

NB: Cajal body/Speackle/PML

Ci sono tre metodi di formazione per i corpi nucleari:

- Modello stocastico: i componenti si assemblano in ordine casuale.

- Modello combinato/misto: ordinato iniziale e poi casuale.

- Modello ordinato: è gerarchico e sequenziale, i componenti si legano sempre nello stesso ordine; in particolare si ha

prima l’arrivo dell’RNA, poi delle proteine e via dicendo. 23

Nucleolo E’ formato dai bracci corti dei cromosomi acrocentrici.

I bracci possiedono un insieme di proteine utili per la trascrizione e per la

modificazione del DNA.

Il nucleolo è formato da due componenti:

Centro fibrillare, composto dal cito fibrillare, che rappresenta il DNA da

trascrivere, e dalla componente densa fibrillare, dove ci sono le proteine per

l’editing di mRNA. Nel confine tra il cito fibrillare e la componente densa fibrillare il DNA viene trascritto.

Componente granulare dove avviene il pre assemblaggio delle subunità ribosomiali.

Nel nucleolo avviene:

I. La trascrizione dell’rDNA, che avviene nei cromosomi e porta all’rRNA;ù

II. La maturazione rRNA da un unico trascritto che viene escisso e modificato (editato) in alcuni specifici nucleotidi da

snoRNP.

III. L’assemblaggio dell’rRNA e proteine per dare le due subunità ribosomiali.

Corpi di Cajal

Sono corpi di RNA e proteine e contengono colina. Essi sono i siti dove snRNA e snoRNA subiscono modificazioni e

sono assemblati completamente a proteine.

Qui è dove si genera il complesso dello spliceosoma.

Speckles o granuli intercromatinici

Sono regioni associate irregolari, detti speckles o macchioline o granuli intercromatinici.

Essi sono ben evidenti nel momento in cui si indirizzano anticorpi fluorescenti verso fattori proteici coinvolti nello

slicing del pre-mRNA, poiché si nota una distribuzione non uniforme, bensì concentrata in 20-50 domini.

Gli speckles vengono visti come depositi dinamici che forniscono i fattori di splicing già finiti e pronti per l’uso

necessari a siti di trascrizione vicini.

Ci sono molte malattie che colpiscono i nuclear bodies: mutazioni dei geni coinvolti in tali strutture, che codificano per

fattori di nuclear bodies.

Il nucleo ha quindi strutture molto organizzate, capaci di formarsi e disorganizzarsi in maniera veloce.

L’interno del nucleo conterebbe questi aggregati proteici, detti trascription factory, aggregati proteici che

aggregandosi in uno spazio minimale permettono l’espressione di più geni in contemporanea.

In patologia che compromette posizionamento di organuli e cromosomi ci può essere modificazione del pattern di

geni perché sono modificate le trascription factory. 24

I comparti spaziali hanno una distribuzione:

Non casuale, ma dipendente dal set di proteine nucleari

Dinamica, perché può variare in rapporto agli stimoli cellulari, allos tato di sviluppo, alla condizione

fisiologica/patologica.

Architettura del nucleo intrafasico

Durante l’interfase, quando non possiamo vedere i cromosomi nella loro struttura, questi sono organizzati

spazialmente in modo preciso o casuale? E’ un argomento studiato dalla topologia nucleare.

Si è visto che i cromosomi occupano uno spazio ben definito, detto territorio

cromosomico.

Lo spostamento di un cromosoma da casa può comportare gravi

conseguenze.

La loro scoperta risale al 2001, quando furono condotti esperimenti in vivo

su cellule di criceto irraggiate con un laser. Se la distribuzione dei cromosomi

fosse stata casuale, al primo irraggiamento si sarebbero dovute avere

distruzione di tot cromosomi, al secondo sarebbero cambiare e al terzo

nuovamente.

Ciò che si è visto è che irraggiando la stessa cellula in tempi diversi o diverse

cellule si ottenevano sempre colpiti gli stessi cromosomi.

Utilizzando sonde cromosoma-specifiche è possibile evidenziare i CT.

I CT sono caratteristici delle cellule eucariotiche, negli eucarioti inferiori (lieviti) sono

assenti.

Questi territori sono conservati nell’evoluzione; ad esempio il cromosoma 18 è povero in

geni ed è più esterno al nucleo, il cromosoma 19 è molto più interno quindi è ricco di

geni.

Il cromosoma 19 è conservato dai primati all’uomo: quelli ricchi in geni sono più centrali,

quelli con pochi geni sono più esterni. Questo in modo che possano interagire tra loro

quelli ricchi in geni.

I territori cromosomici occupano posizioni probabilistiche e non assolute nel nucleo. L’architettura genomica deve

essere interpretata alla luce della sua natura dinamica, cioè la mobilità cromatinica.

In altre parole, l’esatta localizzazione spaziale di una porzione genomica potrebbe non essere importante quanto il

tempo in cui rimane in quella posizione. 25

I cromosomi hanno diverso compattamento, regioni più eterocromatiche sono fatte da una sorta di ansa, il

cromosoma può occupare quindi una posizione ma ha anse che vengono estruse dove ci sono geni espresse in quel

momento affinché interagiscano con altri cromosomi.

E’ importante il tempo in cui le anse rimarranno esposte, in base a queste ci sarà espressione.

Regolazione dell’espressione dei geni

nei loops cromatinici

Gene Kissing e Attivazione trascrizionale:

Gene Kissing e Repressione trascrizionale:

Se ho traslocazione il kissing è interrotto gravi ripercussioni sull’espressione genica

26

Negli anni ’80 Victor Mc Kusick ha iniziato la catalogazione delle malattie ereditarie sul cartaceo; successivamente esso

è stato messo online.

Questo catalogo rappresenta il punto fondamentale delle malattie.

Problemi relativi alla interpretazione di un albero genealogico:

1. Allele recessivo molto frequente

2. Penetranza

3. Espressività

4. Manifestazione tardiva

5. Mutazione de novo

6. Eterogeneità genetica

7. Fenocopie

8. Esclusione di paternità

1. La pseudodominanza

Quando un allele è molto trasmesso si parla di pseudodominanza.

Esempio 1: il gruppo sanguigno 0 è il gruppo sanguigno più

presente nella popolazione caucasica, il che significa che c’è un alto

tasso di eterozigoti nella popolazione.

Esempio 2: rappresenta l’alcaptonuria, una malattia metabolica abbastanza frequente nella popolazione.

In una prima analisi Garrod definì per questa malattia un andamento

autosomico recessivo. In realtà una parte della famiglia pareva avere

un andamento autosomico dominante.

Se ciò avviene significa normalmente che ci sono due geni coinvolti

nella malattia che danno fenotipo comune.

Analizzando meglio si è però osservato che in questo caso c’è stato un

imprinting tra consanguinei, che prende il nome di effetto della

consanguineità (omozigote ed eterozigote) ed è questo che ha

determinato la malattia.

Per definire una condizione di pseudodominanza è necessario sapere

quanto è la frequenza di una mutazione a livello della popolazione, dove l’autosomica recessiva deve permettere

all’individuo di riprodursi.

Nelle malattia dominanti (preferenzialmente) ci sono una serie di condizioni che possono disturbare l’interpretazione

degli alberi genealogici:

- Espressività variabile

- Penetranza ridotta

- Insorgenza tardiva

- Nuova mutazione

- Mosaicismo di tipo germinale

Le malattie dominanti sono più influenzate da queste condizioni rispetto a quelle recessive perché nelle dominanti

basta un solo allele mutato per avere una malattia e questo può essere influenzato da altri geni wild type, che

possono incidere sull’espressione; invece in quelle recessive deve esserci una doppia presenza del gene e quindi la

presenza di altri geni è minore. 27

2.La penetranza

E’ la forza con cui una mutazione si manifesta, la frequenza con cui un gene (dominante o recessivo) si manifesta nel

fenotipo degli individui con un dato genotipo che mostrano il fenotipo corrispondente.

E’ una caratteristica prevalente dei dominanti.

Non si basa sul singolo individuo ma su una popolazione di individui.

La penetranza dipende sia dal genotipo (interazione con altri geni) che dall’ambiente e può essere completa o

incompleta.

Prendendo un certo numero di individui aventi la stessa mutazione, se essa è penetrante, tutti devono manifestare la

stessa malattia, in tal caso ci sarà una penetranza completa del 100% degli eterozigoti.

Prendendo lo stesso numero di individui con la mutazione del gene A, 70 manifestano e 30 non manifestano (ma sono

portatori), significa che la penetranza della malattia è ridotta e non completa, avrà penetranza incompleta del 70%.

Non tutti i portatori dell’allele mutato dimostrano la malattia, ma possono trasmetterla.

Esempio: ectrodattilia

Il soggetto malato genera due figli affetti e tre figli sani. Due dei tre figli sani hanno

progenie malata: sono definiti soggetti non penetranti.

Perché accade questa cosa?

2 e 4 si incrociano con un soggetto sano, ma hanno un background tale che la loro mutazione non sia penetrante. La

progenie di 2 nasce da fusione di due genotipi diversi, verosimilmente il genotipo paterno ha permesso l’espressione

di quel gene mutato, quindi ciò significa che la malattia non è monogenica, ma probabilmente l’interazione di un allele

mutato con la presenza di altri geni può concorrere all’insorgenza della malattia.

3. L’espressività

E’ il grado di espressione genotipica di un certo carattere in un individuo.

Non tutti gli individui che presentano la malattia presenteranno tutti i segni allo stesso modo.

L’espressività può essere uniforme o variabile.

Ci sono dei geni, nel beagle ad esempio, che controllano le macchie il che comporta cani più/meno colorati.

Nell’espressività variabile bisogna introdurre il concetto di sindrome.

→ Sindromi: malattie dovute alla mutazione di un singolo gene. Sono caratterizzanti individui che presentano sia

anomalie fenotipiche esterne (facciali) sia una serie di altri sintomi legati presumibilmente al pattern di espressione

dei geni.

Sono individui che presentano più segni o sintomi.

Esempio: Neurofibromatosi di tipo I.

Dovuta alla mutazione del gene NF-1 che comporta una sindrome.

Essa comporta tre sintomi, che possono presentarsi da soli, in coppia o tutti insieme, il che neurofibromi multipli

cutanei, macchie singole o multiple color caffè latte e la presenza di noduli nell’iride detti noduli di Lisch.

I neurofibromi possono variare da molto piccoli a molto grossi e sono accompagnati da una serie di altre patologie,

quali meningiomi, gliomi, neurinomi dell’acustico tumori dei nervi periferici, tumori del SNC, ipertensione, glicemia e,

in alcuni casi, anche ritardo mentale. In tal caso sarà difficile diagnosticare la gravità della malattia, che ha un ampio

spettro. Esempio: Sindrome di Waardenburg (WS)

Presenta tre sintomi: colori di occhi diversi, riduzione dell’udito, ciuffo

di capelli bianchi.

La sordità è quasi sempre presente.

28

Esempio: camptodattilia Comporta il mignolo immobile e piegato a causa

di una attaccatura irregolare dei muscoli alle

ossa del mignolo.

L’individuo non-penetrante è il III. 4

La penetranza in questa famiglia è il numero di

soggetti portatori in totale rispetto a quelli che

esprimono la malattia diviso quelli che hanno la

mutazione → 8/9 = 88%(compreso il 4)

Fattori influenzanti la penetranza e l’espressività di un gene:

- geni modificatori

- fattori ambientali: a contatto con un qualche tipo di agente → espressione

- variazioni alleliche: un certo tipo di allele in un altro gene può variare l’espressione del gene mutante

- interazioni con l’ambiente cellulare e ambiente esterno

Esempio di gene modificatore: DFNB26 modifica la penetranza. (DFN definisce la sordità)

Questo gene è stato studiato in una famiglia in cui fondamentalmente 141 individui (famiglia molto grande) erano

affetti dalla malattia. E’ una condizione recessiva, dove altri 6 individui, pur essendo omozigoti non manifestavano la

malattia, questo perché un altro gene DFNM1 costituiva un allele dominante che poteva influenzare l’espressione dei

due alleli omozigoti. In tal caso questo gene influenza in modo soppressivo, non permettendo lo sviluppo della

malattia.

4. Età di insorgenza

Ci sono una serie di malattie che derivano da accumulo (es: Corea di Huntington, malattia degenerativa), che porta

alla morte cellulare.

Non sono malattie congenite perché, in alcuni casi, è necessario un arco temporale per permettere l’accumulo delle

sostanze. La mutazione non è quindi manifestata alla nascita, ma dopo un lasso di tempo.

Esistono quindi malattie che si sviluppano a insorgenza tardiva e hanno 50% delle probabilità di trasmettere l’allele

mutato alla progenie. Esempio: corea di Huntington, si

manifesta tra i 30 e i 60 anni.

La possibilità di sviluppare la malattia

per un portatore della mutazione

aumenta con l’aumentare degli anni.

Sono malattie dinamiche, dovute

all’espansione di triplette presenti

all’interno del gene e spesso, da una

generazione all’altra, si assiste

all’ampliamento della tripletta.

Si sfocia in un fenomeno di espansione, quindi l’allele sarà più ‘tossico’, che

comporterà l’insorgenza in tempi più brevi.

La probabilità del figlio di un eterozigote per la corea di Hungtinton ha la

probabilità di sviluppare l’allele mutato per il 50%, se non la sviluppa entro tot anni più avanzerà meno probabilità ci

saranno di svilupparla perché non l’ha presa.

Nel grafico a destra A=probabilità che un portatore sviluppi la malattia a una data età

B=rischio che il figlio sano di un genitore affetto possegga il gene e una data età

29

Esempio 2: rene policistico

5. Mutazione de novo

Sono condizioni che, in genere, interessano solo le mutazioni dominanti.

Sono famiglie in cui la malattia è assente ma, occasionalmente, l’individuo che nasce è malato.

Talvolta, anche a livello di gameti, può avvenire che si generi contemporaneamente una linea cellulare di gameti

normali e gameti mutati. In questo caso il rischio di ricorrenza esiste.

In questo caso il rischio di avere un altro figlio affetto è praticamente nullo, a meno che non si tratti di mosaicismo

germinale.

Sono più colpiti dalle mutazioni de novo i maschi o le femmine?

Dal punto di vista del ovogenesi femminile ci sono 22 divisioni mitotiche; questo crea il pool iniziale, nascendo con 3

milioni di follicoli bloccati in meiosi. Da allora ci sono solo riduzioni di numero.

Sono bloccati in meiosi I, a ogni ovulazione si sbloccano e questo aspetto è correlato ad aspetti di non disgiunzione

cromosomica.

Al contrario, un uomo ha mitosi per tutta la vita. Ha inizialmente 30 divisioni mitotiche in fase fetale e avrà, in pubertà,

20-25 divisioni mitotiche per anno, fino a entrare nella meiosi. -9

Dato il numero elevato di mitosi nel maschio c’è un tasso di mutazione di 10 .

A 25 anni ci sono 275 mitosi.

-9

300 x 10 comporteranno 180 mutazioni.

Buona parte delle mutazioni è dovuta al fatto che il gene è altamente mutabile.

Ciò che influenza, in generale, la mutabilità di un gene e quindi il suo tasso di mutazione sono, ad esempio: sequenze

metilabili ricche in CG, lunghezza del gene, pressione selettiva ridotta di un determinato gene…et al.

Donna: maggior tasso di mutazione per non disgiunzione

Uomo: maggior tasso di mutazioni de novo

In genere se la fitness (il numero di discendenti di un individuo affetto che raggiunge l’età riproduttiva rispetto a una

popolazione controllo) è uguale a zero → mutazione de novo

Mosaicismo genomico: un essere umano, genomi multipli Lo sviluppo umano richiede molte divisioni

cellulari; le cellule (blu) possono accumulare

mutazioni in ogni momento (verde, viola e

rosso). Alcune mutazioni diminuiscono la fitness

cellulare e vengono eliminate (croce rossa).

Altre sopravvivono e contribuiscono al

mosaicismo tissutale, che può avere funzioni

fisiologiche e patologiche.

Analizzando un soggetto in diverse cellule si nota che esistono mutazioni solo di un determinato tessuto e non di un

altro e che alcune vengono eliminate, altre invece mantenute (possono essere silenti o meno).

E’ importante valutare la possibilità che anche le gonadi possano essere colpite da una situazione di mosaicismo, che

non sarà di tipo somatico ma germinale.

IL MOSAICISMO GERMINALE

Delle 20 mitosi prima delle pubertà può accadere che per un errore di replicazione nasca una mutazione, che

comporterà la copresenza di due popolazioni cellulari: una popolazione cellulare con mutazione e una senza

mutazione. Se le cellule mutate sono in prevalenza rispetto a quelle wild type si possono manifestare segni clinici della

malattia. La mutazione è insorta durante lo sviluppo embrionale. Più precocemente insorge maggiore sarà il numero

di cellule mutate. 30

A seconda dello stato di sviluppo più grave sarà l’effetto.

Esempio: uomo si sposa con due donne diverse e dà due figli malati.

Si pensa possa esserci un mosaicismo germinale, il che significa che a livello del padre

c’è una popolazione di spermatozoi che porta una mutazione.

Analizzare il mosaicismo germinale degli uomini significa analizzare lo sperma.

In una donna, invece, bisognerebbe prelevare le ovaie e anche poiché ogni follicolo

ovarico dà origine a una cellula uovo, non è possibile farlo

Esempio: mutazione caratterizzata da inserzione di 9 nucleotidi.

Si analizza il padre: il sangue non ha mutazione

Si analizza la madre e la sorella che sono normali.

I due figli maschi risultano eterozigoti, hanno un allele da 73 e un

allele da 62: è una condizione dominante.

Poiché la madre non è portatrice sono state due modificazioni de

novo?

Si cerca di escludere prima il mosaicismo germinale del padre: si analizza lo sperma e si nota una popolazione minore

con una banda per 73 e una normale da 62.

Nel caso di un carattere con eredità autosomica dominante, in quali casi un individuo può avere genitori sani?

→ de novo

→ penetranza incompleta

→ comparsa ritardata

→ padre presunto non è biologico

6. Eterogeneità genetica

Fenotipi uguali o molto simili possono essere eterminanti da meccanismi genetici diversi

A. Eterogeneità allelica – aleli diversi mutati

Sono alleli diversi mutati dello stesso gene che determinano lo stesso fenotipo.

Diversamente da malattie come l’anemia falciforme, dove la mutazione che determina la malattie fa capo a solo un

amminoacido(da acido glutammico a valina), ci sono malattie che derivano da più di una mutazione..

Esempio: il gene della fibrosi cistica è il

gene molto lungo CFTR, che comporta una

stessa malattia ma in alcuni casi c’è un

affetto meno importante, in altri casi più

importante.

E’ importante correlare gli alleli mutati col

fenotipo del paziente: più il gene è grande

più la possibilità di mutazione sul gene è

elevato (più possibilità di errori)

Esempio: Fenilchetonuria, dovuta alla distribuzione delle mutazioni della fenilalanina idrossilasi.

Ci sono 13 esoni, ci sono diverse e multiple mutazioni.

A volte la mutazione di madre e madre comporta un eterozigote composto, dove la mutazione più

grave può influenzare quello meno grave e viceversa.

Quando i due genitori concepiscono un figlio ci sarà una condizione autosomica recessiva, ma in realtà

sono eterozigoti composti. 31

B. Eterogeneità di locus – geni diversi mutati: geni diversi la cui mutazione dà origine più o meno allo stesso fenotipo.

Ci sono casi con più di 10 geni coinvolti, in tal caso è importante definire la modalità di trasmissione della malattia, in

base alla quale si potrà definire qual è il gene coinvolto.

C. Eterogeneità fenotipica: condizione per cui mutazioni diversse nello stesso gene danno origine a malattie di gravità

diverse

Esempio è la distrofina, che comporta una patologia più o meno grave.

Mutazioni che, pur essendo delezioni molto grosse, mantengono il frame e producono distrofina mantenuta si ha la

distrofia di Becker, che colpisce il cingolo scapolare.

Al contrario, mutazioni che non mantengono il frame portano alla forma severa di Duchenne, caratterizzata dalla

distrofia che parte dalle gambe e salgono fino ad arrivare alla muscolatura respiratoria, provocando la morte.

Esempio: mutazione del gene RET, oncogene codificante per una tirosin chinasi.

Mutazioni distribuite lungo tutto il gene, ma che non coinvolgono esoni particolari, causano una malattia detta

Sindrome di Hirsprung, malattia congenita caratterizzata dalla mancanza di gangli a livello intestinali, che comportano

una dilatazione intestinale massiva.

La mutazione invece a carico di altri due esoni, che determinano una sostituzione delle cisteina codificata in questi due

esoni e causano una dimerizzazione della proteine e un’attività costituitiva della tirosin chinasi (continua a

funzionare).

Queste mutazioni causano l’unica forma di carcinoma familiare dovuta alla mutazione di un oncogene.

Questo perché, solitamente, le mutazioni somatiche degli oncogeni portano alla morte.

RET deriva invece dal sistema enterocromaffine e ha quindi espressione limitata in certi livelli, il che fa sì che a livello

embrionale non viene eliminata.

RET modificato causa MEN IIA (Coinvolgimento calcinoma midollare della tiroide, ovvero cellule C, iperplasia delle

paratiroidi e in alcuni casi tumore a carico delle midollari del surrene)

Variazione fenotipica in malattia mendeliana A livello interfamiliare: Un individuo ha

mutazione e un altro ne ha un’altra → nasce

malato

A livello intrafamiliare: la stessa mutazione può

essere influenzata da geni modificatori. Essi

possono avere alleli diversi, quindi può esserci

influenza in enso positivo, negativo o la

mutazione viene influenzata dall’allele dell’altro

genitore.

Una modificazione epigenetica può oppure

portare a un silenziamento della mutazione e

quindi alla mancanza dell’effetto sul fenotipo.

Infine, ci possono essere influenze esterne ambientali/medicinali/chimiche, che determinano l’espressione della

malattia. 32

8. Complementazione

Complementazione: restaurarsi della funzione biologica, quando due mutazioni che causano ciascuna perdita della

funzione si trovano nello stesso genoma o nella stessa cellula.

Esempio: albinismo – recessivo 33

7. Fenocopie

La fenocopia è la copia di un fenotipo determinato geneticamente, ma che, invece di essere determinato da fattori

genetici, è determinato da fattori ambientali.

Esempio: malformazioni causate da agenti chimici o da virus.

I caratteri fenotipici che si osservano nelle fenocopie non sono ereditari.

Meccanismi atipici di ereditarietà

Malattie monogeniche: il gene mutato è un carattere monogenico, una malattia in qualche modo codificata da un

solo gene.

→Ci sono malattie dove è necessario che ci siano due o più varianti di geni diversi per ottenere il fenotipo: si parla di

ereditarietà digenica (due alleli) o polifenica (tre o più alleli mutati)

Un gene, inoltre, dipende dal genitore che lo trasmette.

→L’imprinting genomico prevede geni posizionati su geni autosomici e, a seconda se derivi da maschio o da femmina,

si esprimeranno: espressione monoallelica.

→C’è inoltre l’ereditarietà mitocondriale, che dipende dai caratteri materni.

A. EREDITÀ OLIGOGENICA

Il fenotipo è determinato da due alleli mutati in due loci diversi.

Eredità digenica:

→ talvolta è sinergica, ovvero entrambe le mutazioni concorrono all’espressione del genotipo.

→ talvolta ha effetto additivo, le due mutazioni si sommano, dando origine a un fenotipo aggravato dalla presenza

della mutazione sul secondo locus.

1. Effetto sinergico

Esempio retinite pigmentosa, si manifesta in individui doppi eterozigoti (AaBb), devono esserci le mutazioni sia per

ROM1 sia per RDS.

E’ sufficiente uno dei geni mutanti per uno dei due loci. I geni ROM1 e il gene per la periferina (RDS) codificano per i

fotorecettori.

Esempio 2: Sindrome di Bardet Biedl (BBS)

E’ dovuta a un’alterazione delle ciglia e quindi di tutte le strutture cellulari rappresentanti ciglia, caratterizzata da

obesità, dismorfismi facciali, polidattilia, retinite pigmentosa, deficit cognitivo, patologia renale.

In questo caso ci saranno mutazioni su due geni, ma in questo caso uno avrà entrambi gli aleli mutati, l’altro avrà un

allele mutato: sono tre gli alleli che intervengono.

Alla BBS sono correlati 16 loci.

Negli affetti ci sono tre geni interessati: BBS2, BBS4, BBS6. In questo caso ci saranno sempre tre alleli mutati.

2. Effetto additivo

Esempio 1: glaucoma giovanile (JOAG)

E’ l’ipertensione oculare che insorge generalmente in età adulta avanzata, talvolta però viene manifestata prima.

Ciò che determina questo fatto che quelli con esordio in età avanzata hanno una mutazione a carico di un gene,

Invece, chi la sviluppa precocemente, ha entrambi i geni mutati → è un effetto additivo.

B. IMPRINTING

La quasi totalità dei geni è biallelica, vale a dire che l’espressione di un gene non dipende dal sesso del genitore che lo

trasmette.

Ci sono tuttavia eccezioni:

→ cromosomi del sesso: emizigosi costitutiva XY, XX inattivazione dell’X ed emizigosi funzionale, nella quale si ha il

funzionamento di un solo allele che dipende dal genitore che si ha ereditato, il che può portare a varie patologie.

→ autosomi: imprinting genomico (emizigosi funzionale). L’allele che si esprime dipende dal genitore da cui deriva.

Ed esclusione allelica, in seguito a un riarrangiamento programmato del DNA nei linfociti B.

34

C. EREDITA’ MITOCONDRIALE

I mitocondri sono presenti ovunque tranne che i cheratinociti (possiedono un basso livello di ATP) e i globuli rossi.

Il mitocondrio è l’organulo fondamentale per la produzione di energia; da ciò risulta che gli organi che saranno

maggiormente colpiti da una malattia mitocondriale saranno tessuti ricchi di mitocondri: retina, cuore, cervello,

tessuti muscolari..

I mitocondri svolgono poi la funzione di sintesi per pirimidine, gruppi eme e sono importanti nel metabolismo del

glicerolo, a livello epatico sono importanti per la detossificazione dell’ammoniaca e, infine, nell’apoptosi.

Producono inoltre radicali liberi.

Pertanto se il mitocondrio non funzionerà ci sarà un maggior stress ossidativo.

Le malattie mitocondriali spesso innescano meccanismo di apoptosi cellulare.

Ogni mitocondrio contiene più copie di DNA mitocondriale, che è circolare, corto (16-17Kb), a doppio filamento, di cui

uno è definito H (Heavy), ricco di GC, l’altro è definito L (light) ed è ricco in AT.

Il contenuto di CG è attorno al 44%. Questo DNA è un DNA totalmente codificante: contiene geni

per 13 polipeptidi, 24 geni che codificano per RNA non

codificanti (di cui 22tRNA e 2rRNA).

I geni inoltre non sono interrotti: non ci sono introni.

I 13 geni codificanti codificano per polipeptidi appartenenti

alle subunità che intervengono nella fosforilazione

ossidativa: 7 appartengono al complesso I, 1 al complesso III,

3 al complesso IV e 2 al complesso V.

Gli altri sono codificati da geni a livello nucleare.

Il DNA mitocondriale è molteplice, ma ha un elevato tasso di mutazione perché:

- Non c’è sistema di riparo

- E’ un DNA libero della matrice mitocondriale, non ha gli istoni, non possiede una struttura di cromatina che protegge

- E’ sito in un ambiente ricco di radicali liberi

Il DNA mitocondriale deriva dalla madre, perché lo spermatozoo ha i mitocondri a livello della coda che ne

permettono il movimento.

Quando lo spermatozoo entra nell’uovo perde la coda e di conseguenza il mitocondrio.

L’eredità mitocondriale è quindi un’eredità materna: lo zigote riceve i mitocondri funzionali dall’ovocita.

A seconda del tessuto preso in considerazione ci sarà una percentuale di malattia più o meno affetto da una

particolare mutazione nel mitocondrio in base alla percentuale dei mitocondri stessi.

→ oocita: cellula che possiede più mitocondri delle altre cellule → 100.000/cellula perché ha bisogno di energia per lo

sviluppo

→ linfociti: 1000

→ cellule somatiche: 100-10.000

→ spermatozoi: poche centinaia

→ assenza di mitocondri nei globuli rossi e in alcune cellule della cute differenziate

Le malattie derivanti dal mitocondrio sono caratterizzate da una penetranza ridotta e da un’espressività

assolutamente variabile.

All’interno della stessa famiglia, quindi, ci sarà un largo spettro di gradi/assenza di malattia, in base al numero di

mitocondri coinvolti.

Nel mitocondrio, durante la replicazione, quando la cellula si divid, il tutto avviene casualmente seguendo la divisione

del citoplasma. 35

Questo genera, di conseguenza, si avranno diverse casistiche:

→ omoplasmia: ci sarà una divisione uguale tra DNA mutato

mitocondriale allele A e DNA non mutato mitocondriale con allele a

→ irreale

→ eteroplasmia: copresenza di DNA mutato mitocondriale e DNA non

mutato mitocondriale

Ci sarà un effetto soglia sopra il quale il numero di cellule mutate

influenzerà il fenotipo, che sarà più o meno grave.

Caratteristiche dell’eredità mitocondriale

- Possono essere affetti sia i maschi sia le femmine

- Solo le femmine possono trasmettere il carattere a tutti i suoi figli, sia maschi sia femmine → è un’eredità materna

- Il carattere non verrà mai trasmesso dai maschi

- C’è eterogenicità in base al numero di cellule mutate → una donna apparentemente normale può generare figli

malati se lo zigote deriva da un mitocondrio malata.

Cosa avviene nell’ovogenesi che permette che una donna sana porti a un individuo completamente malato?

Il motivo è ritrovabile nell’effetto a collo di bottiglia.

1.Nella cellula primordiale può capitare che il DNA mitocondriale muti

2. Quando si entra poi nello stato di ovocita primario c’è un evento di contrazione del numero di mitocondri, in questo

caso il DNA non viene ulteriormente amplificato ma diviso nelle cellule figlie, c’è allora una riduzione del numero di

mitocondri.

3. Si ottengono oociti con diversi numeri di mitocondri mutati.

4. Segue la maturazione in ovocita secondario e poi cellula uovo, durante la quale il DNA si moltiplica.

Si avranno quindi diversi follicoli: ci sarà quello più mitocondri mutati e quello con meno mitocondri mutati.

Esempio 1 Sindrome di MERRF: eterogeneità fenotipica

Una donna con miopatia e sordità dà origine a tre figlie molto gravi (sordità, miopatia più epilessia) e un figlio con le

stesse malattie più lievi.

Le malattie mitocondriali rappresentano un gruppo eterogeneo di sindromi cliniche accomunate da un deficit

energetico del metabolismo mitocondriale.

Nonostante il mitocondrio sia sede di varie vie metaboliche fondamentali, per malattie mitocondriali in senso stretto

si intendono le sindromi associate al deficit della fosforilazione ossidativa.

Gli organi coinvolti sono quasi nella totalità:

- SNC → epilessia, tremori, demenza

- occhi → vista, cecità, alterazioni a carico dei movimenti oculari (oftalmoplegia) coinvolgimento della palpebra

- cuore → cardiomiopatie

- pancreas → diabete

- tratto GI → diarrea/ostruzione intestinale

Le malattie mitocondriali possono manifestarsi a qualsiasi età, con maggiore incidenza nell’età dello sviluppo

puberale, dovuta al maggior consumo energetico. 36

DIAGNOSI

In alcuni individui il quadro clinico è caratteristico di una specifica alterazione della funzione mitocondriale e la

diagnosi può essere confermata tramite il test del DNA.

In molti individui è necessario invece ricorrere a un approccio più complesso che prevede:

1. Albero genealogico: controllare se segrega con una mutazione di tipo femminile

2. Misurazione della concentrazione di acido lattico, che misura la respirazione

3. Biopsia muscolare per analisi istologiche

4. Analisi molecolare delle basi del mtDNA per confermare l’ipotesi di diagnosi

Le citopatie mitocondriali sono di due diverse classi:

→ Classe I: intervengono all’interno del metabolismo mitocondriale, disordini di geni nucleari

→ Classe II: riarrangiamenti di DNA mitocondriale

Classe I:

- difetti nella fosforilazione ossidativa (Esempio: sindrome di Leigh)

- difetti in proteine mitocondriali utili all’integrità del DNA mitocondriale (come la PEO)

- disordini con effetti secondari a carico dei mitocondri

I riarrangiamenti sono classificati come:

→ mutazioni puntiformi in proteine non codificanti, tRNA o rRNA → deficit in produzione proteine → deficit maggiore

→ riarrangiamenti mitocondriali → da 1.3 a 8 Kb che coinvolgono delezioni

Spesso le delezioni all’interno di tessuti diversi sono in zone diverse, che portano tuttavia alla stessa malattia.

37

LE MUTAZIONI: le basi molecolari della variabilità

La frequenza di una mutazione perché sia definita tale e non sia un polimorfismo è 1%.

La mutazione non riguarda, come si potrebbe pensare, solo la mutazione del fenotipo, in realtà alcune mutazioni non

sono visibili perché letali, altre, invece, hanno una bassissima frequenza ma di fatto non hanno un effetto visibile.

Dal punto di vista di classificazione possono essere distinte in base a diversi fattori

A. CLASSIFICAZIONE SU EFFETTO FENOTIPICO

1. Letale o sub-vitale: sono mutazioni che causano l’assenza di progenie. Non si sa quali sono perché non è possibile

definirle.

Altre volte si determina grazie alle caratteristiche, ad esempio nella nanoacondroplasia.

Talvolta la progenie non è vitale e saranno vitali solo gli eterozigoti, da cui deriveranno aborti nel momento in cui

questi si incroceranno → aborti/perdita feto/incapacità di concepire

2. Condizionale: sono mutazioni particolari, che determinano in alcuni soggetti il fatto che questi soggetti sono

normali ma in qualche modo in alcune condizioni la mutazione si manifesta e causa quindi una patologia.

Esempio: favismo → malattia frequente in zone mediterranee, che portano a condizioni emolitiche, ovvero si assiste

alla rottura delle cellule del sangue, dovuto a un deficit della glu-6-P-deidrogenasi, enzima importante nel

metabolismo dei globuli rossi, dove è maggior fonte del glutatione ridotto.

Nel caso di ingestione di fave si causa emolisi così come se prendono determinati farmaci, tra cui l’aspirina.

3. Neutro

4. Pleiotropico: sono mutazioni dove una mutazione dà una cascata di sintomatologie.

Ad esempio: anemia falciforme → mutazione che determina produzione di emoglobina adesiva (S), che precipita nella

cellula. Questo effetto primario, poiché colpisce i globuli rossi, ha effetto a cascata su tutti gli organi, comprese ulcere

derivanti dalla falcizzazione delle cellule. Inoltre l’organismo aumenta l’attività della milza per filtrare le cellule e

distruggerle.

B. CLASSIFICAZIONE PER ETA’ DI INSORGENZA

1. Esordio precoce: prenatale o congenita

2. Esordio tardivo

C. CLASSIFICAZIONE A LIVELLO DELLA MUTAZIONE

1. Mutazioni genomiche: variazione del numero dei cromosomi

2. Mutazioni cromosomiche: modificano la struttura del cromosoma e possono comportare o rotture di geni o perdite

o acquisizione di materiale

3. Mutazioni a carico dei geni che modificano i geni singoli: mutazioni puntiformi o più espanse.

-4 -7

Tasso di mutazione: numero di mutazioni nuove per locus per generazione → 1x10 a 1x10

Da questo tasso si può capire quanti individui mutati si possono avere.

Incidenza di una mutazione: numero di nuovi casi

Prevalenza di una mutazione: numero di affetti di una popolazione

-4 -7

Il range di mutazioni per locus per generazione varia da 1x10 a 1x10 per diversi motivi:

→ Più un gene è grande più può mutare

→ Se gene è mutato dà origine a mutanti, ma a volte sono mortali, quindi il range è influenzato dal numero di alleli

mutanti in grado di dare origine a un individuo rilevabile

→ Età/Sesso del genitore: le mutazioni de novo sono ad esempio più

correlate al sesso maschile e all’età maschile

→ Presenza di un meccanismo piuttosto che di un altro nell’insorgere di

una mutazione

→ Composizioni in basi di alcuni geni: talvolta presentano hot-spot

mutazionali, ovvero più zone del DNA dove la frequenza di mutazione è

più elevata rispetto ad altre relativamente alal composizione in basi.

Geni con hot-spot saranno più propensi alla mutazione piuttosto di altri

→ esempio codone 6 emoglobina β

38

-4 -7

Il tasso di mutazione può variare da 10 a 10 a seconda della grandezza del gene e del fatto che vi siano degli hot

6

spots per mutazione, dove la media di tasso di mutazione è di circa 1 x 10

Quali sono le cause della variabilità?

1. Le mutazioni spontanee derivano da:

→ errori di duplicazione: tre miliardi di coppie di basi devono essere replicate a ogni divisione cellulare, in un periodo

di 2-3 ore con una velocità di 100.000bp/sec, il che fa sì che avvengano casualmente degli errori.

Riguarda sia mutazioni puntiformi, sia corte inserzioni sia delezioni possono avvenire per errore durante la

replicazione del DNA

→ ricombinazione: è un processo fondamentale per generare diversità biologica, a causa della struttura di particolari

regioni genomiche, è un’altra fonte di possibili errori

→ errori di segregazione: processo finale della mitosi e della meiosi.

Avvengono casualmente degli errori che portano a un errata ripartizione dei cromosomi nelle cellule figlie.

Mutazioni per sostituzione

Sono cambiamenti in un gene tali per cui una coppia di basi viene rimpiazzata da un’altra coppia di basi, per esempio

AT, che può essere sostituita da GC.

Per il 63% sono dovute a transizione, ovvero la sostituzione di una purina ( A e G) con un’altra purina, o di una

pirimidina (C e T) con un’altra pirimidina.

Per il 37% sono dovute a transversione, ovvero la sostituzione di una purina (A e G) con una pirimidina (C e T) o

viceversa.

LE MUTAZIONI SPONTANEE: sono mutazioni che possono avvenire in fase S, in fase G e in fase G del ciclo cellulare.

1 2

Il tasso di mutazione, ovvero la probabilità che si verifichi un particolare tipo di mutazione in funzione del tempo, è,

-4 -6 -6 -7

10 - 10 per quanto riguarda gli eucarioti in generale per gene per generazione mente è 10 – 10 per quanto

riguarda i batteriofagi per gene per generazione.

Sono quelle mutazioni che sfuggono al sistema di correzione.

La maggior parte delle mutazioni finora identificate sono mutazioni deleterie e recessive. I processi metabolici

avvengono attraverso una serie di reazioni chimiche, in cui ogni singolo passaggio è catalizzato da uno specifico

enzima codificato da uno o più geni.

Le mutazioni di questi geni producono, di frequente, blocchi delle vie metaboliche.

Molte mutazioni non hanno effetto sul fenotipo dell’organismo a causa della degenerazione che si osserva nel codice

genetico. Queste sono chiamate mutazioni neutre.

E nel caso si tratti di un omozigote recessivo?

IL CASO DELL’ANEMIA FALCIFORME: è una malattia genetica a trasmissione autosomico – recessiva.

E’ una mutazione che si manifesta allo stato di omozigote e porta al cambiamento di un amminoacido

nell’emoglobina, una proteina che trasporta O .

2

L’EMOGLOBINA: negli adulti (emoglobina A) la principale forma di emoglobina è costituita da due polipeptidi

, tra loro identici, e due polipeptidi , sempre identici.

Ogni polipeptide è formato da una specifica sequenza di 141 aminoacidi, mentre ogni catena è formata

da 146. Date le similarità presenti nelle loro sequenza aminoacidiche, si pensa che tutte le catene globiniche

derivino da un comune progenitore.

Tra le varianti identificate nell’emoglobina adulta è presente l’anemia falciforme.

Nell’anemia falciforme (emoglobina S), si scoprì che la S differiva dalla A in una sola posizione.

Il sesto aminoacido dell’estremità ammino-terminale della catena nell’emoglobina A è un acido glutammico

(carico negativamente); la catena dell’emoglobina S, invece, contiene nella stessa posizione una valina

(neutro)

La mutazione prevede che la sequenza codificante per l’acido glutammico (GAA) muti, andando a codificare

per valina (GUA).

A causa del diverso ripiegamento della proteina, la quale passa quindi dall’essere carica negativamente

all’essere apolare il fenotipo del globulo rosso cambia, andando a costituire la caratteristica forma a falce.

39

Questo genere di globuli rossi sono molto più fragili e tendono a bloccarsi nei capillari portando un danno alla

circolazione e ai tessuti (è pleiotropia).

a s

: allele normale, emoglobina normale Hb-A : allele mutato, emoglobina mutata Hb-S

a a individui sani

s s individui affetti

a s individui potatori (fenotipo intermedio)

Un’altra mutazione ce porta all’anemia, in particolare all’emoglobina di tipo C, Hb-C, è la sostituzione

dell’acido glutammico con la lisina; tuttavia è meno grave perché il ripiegamento della proteina è simile a

quello di un individuo sano.

2. Le mutazioni indotte derivano da:

Sono quelle causate dall’esposizione degli organismi ad agenti fisici o chimici, che causano cambiamenti nel DNA.

Tali agenti, chiamati mutageni, sono catalogabili principalmente in due categorie:

→ Mutageni fisici, comprendono:

- Raggi UV: radiazioni non ionizzanti, che portano minore energia rispetto ai raggi X.

Sono in grado di penetrare solo nelle cellule dello strato superficiale e non causano ionizzazioni. I raggi UV dissipano la

loro energia distribuendola agi atomi che incontrano, portando gli elettroni negli orbitali più esterni a livelli di energia

più elevati, uno stato descritto come eccitazione.

Ad alte dosi possono uccidere la cellula, per questo vengono utilizzati per sterilizzare, in quanto, nel momento in cui

colpiscono organismi unicellulari (i microrganismi), questi muoiono.

Come? Poiché le basi del DNA assorbono le lunghezze d’onda dello spettro UV (250-260nm), si ha la formazione di

legami tra pirimidine appartenenti allo stesso filamento, con conseguente protrusione del filamento di DNA. Per

esempio, si può formare T-T al posto di T-A e, se sul dimero T-T viene effettuata una sostituzione avrò una riparazione,

altrimenti la cellula morirà.

- Raggi X: radiazioni ionizzanti ad alta energia, le quali sono in grado di penetrare i tessuti viventi in profondità. I raggi

ad alta energia collidono con gli atomi e determinano il rilascio di elettroni, producendo radicali liberi e ioni carichi

positivamente. Gli ioni, a loro volta, collidono con altre molecole, determinando il rilascio di altri elettroni. Il risultato è

che si forma un cono di ioni lungo il percorso di ogni raggio ad alta energia attraverso i tessuti viventi.

1 2

A volte provocano la rottura del DNA, mutazioni cromosomiche, con riarrangiamenti strutturali e

3

mutazioni geniche (puntiformi) se le radiazioni hanno bassa energia.

Vi è una relazione tra la dose di raggi X e la frequenza di esposizione, in quanto si ha un accumulo di raggi X

con lunghe e frequenti esposizioni. Ciò prende il nome di effetto cumulativo delle radiazioni.

Le mutazioni, se cadono in regioni non codificanti, l’effetto sarà generalmente minore. Se questi sono però enhancer,

essi perderanno la loro efficienza.

Distribuzione genomica delle mutazioni

All’interno del genoma si possono distinguere regioni in cui le mutazioni sono più o meno presenti.

Ci sono diversi fattori che incidono sulle mutazioni:

→ Lunghezza del gene: Più un gene è lungo tanto maggiore sarà la possibilità di mutazione.

→Capacità codificante o non codificante una regione regolatoria mutata ha minore effetto rispetto a una codificante

→ Caratteristica di sequenza

Sono detti hot-spot mutazionali, punti caldi delle mutazioni.

Mutazioni per sostituzione

Sono cambiamenti in un gene tali per cui una coppia di basi viene rimpiazzata da un’altra coppia di basi, per esempio

AT, che può essere sostituita da GC.

Per il 63% sono dovute a transizione, ovvero la sostituzione di una purina ( A e G) con un’altra purina, o di una

pirimidina (C e T) con un’altra pirimidina.

Per il 37% sono dovute a transversione, ovvero la sostituzione di una purina (A e G) con una pirimidina (C e T) o

viceversa. 40

La sostituzione di basi è dovuta a errori spontanei che intervengono nei meccanismi di replicazione e di riparazione del

DNA:

→ Appaiamento vacillante delle basi e tautomeria chetoenolica che porta alla sostituzione di base. Nelle basi si ha il

gruppo chetonico (c=o) o il gruppo enolico (OH), che sono due conformazioni in equilibrio. Se l’equilibrio si sposta

durante la replicazione del DNA a favore di uno dei due tautomeri, anche se questo richiede maggior energia,

potremmo avere un appaiamento di basi non canonico e quindi una mutazione.

Nella sua forma rara, infatti, una base può formare legami idrogeno diversi rispetto a quelli normali e ciò può portare

a un appaiamento errato.

Per quanto riguarda le pirimidine, una forma rara di citosina può appaiarsi con l’adenina e una forma rara di timina

può appaiarsi con la guanina.

→Deaminazioni e depurinazioni spontanee: Due dei più comuni eventi chimici che portano alla produzione di

mutazioni spontanee sono la depurinazione e la deaminazione.

Se l’appaiamento non canonico avviene nel filamento senso, questo non verrà trascritto, quindi la mutazione non sarà

visibile nelle prima generazione.

I. La depurinazione, dove una purina viene persa a causa della rottura del legame con il desossiribosio.

Normalmente vi è un meccanismo che ripara la perdita, ma se la base non viene ripristinata non ci sarà una base che

serva da stampo per quella complementare e si creerà quindi un buco.

Se la lesione sfugge alla riparazione si inserirà una base a caso, che potrà produrre una coppia di basi con

appaiamento errato. Il risultato sarà una mutazione genica.

II. La deaminazione, è la rimozione di un gruppo amminico da una base, per esempio deaminazione di Citosina

produce un Uracile, che, essendo riconosciuta come base estranea, è rimossa dal DNA.

Quando una U non viene riconosciuta come base estranea, invece, si accoppia ad una adenina (transizione da C-G a U-

A)

Il DNA dei procaroti e degli eucarioti contiene, al posto della normale base citosina, una piccola quantità di basi

modificate a 5-metilcitosina.

Le citosine metilate, che vanno incontro a deaminazione diventano timine, le quali si accoppiano poi con le adenine

(transizione da C-G a T-A).

m

Le citosine 5’ (metilate al carbonio 5’) localizzate al 5’ (promotore) vanno incontro a un maggior numero di

deaminazioni, quindi vanno incontro a più sostituzioni per transizione.

m

Esistono delle regioni ricche di 5’ e sono dette hot spots (punti caldi mutazionali), luoghi che subiscono un numero di

sostituzioni per transizione superiori alla media

Esse avvengono molto spesso, ma in genere vengono riparati in maniera molto efficiente il che comporta che non ci

sia un effetto fenotipico. Solo nel caso della citosina metilata ci sarà effetto importante.

In opposizione agli hot spots esistono zone del genoma che prendono il nome di cold spots, che sono zone fredde di

variabilità.

Tra le mutazioni puntiformi sono comprese sostituzioni, inserzioni e delezioni di basi, purché interessino tratti brevi.

Sono importanti dal punto di vista fenotipico se ricadono in regioni codificanti.

Se la mutazione è sul promotore ciò può comportare il salto sì il salto del sito di binding, ma non è detto che la

capacità di legame venga messa in discussione.

All’interno di un gene le mutazioni patogene possono verificarsi:

→ Nella sequenza codificante

→ Nella sequenze non codificante intragenica

→ Nella sequenza di regolazione esterna ai geni

Esiste una variabilità delle sostituzioni nelle diverse regioni geniche.

La frequenza e il tipo di mutazioni di singole basi, o poche basi, sono diverse nel DNA codificante e non codificante.

La localizzazione delle sostituzioni di basi nel DNA codificante non è casuale. Il tasso di mutazione è il risultato

dell’evento mutazionale e della pressione selettiva. 41

Utilizzando un topo si sono analizzati diversi geni e si è notato che c’è

una minor conservazione di frequenza tra topo e uomo in zone che

non hanno capacità codificanti.

Le regioni codificanti sono quelle più conservate, gli pseudogeni sono

quelli meno conservati.

Anche a livello dei cromosomi il tasso di mutazione è diverso: ci sono

cromosomi ricchi di geni che hanno un tasso di mutazione più elevato

(Come il 19) e altri che hanno un basso tasso di mutazione (X)

Le mutazioni puntiformi si differenziano in:

1. Sinonime o silenti: è una specie di mutazione missenso e si verifica quando viene cambiato un codone nell’mRNA in

modo tale da codificare ancora per lo stesso aminoacido. Di solito a cambiare è la IIIª base del codone (vacillamento

della terza base). Nonostante la mutazione, esso continua a codificare per lo stesso amminoacido.

2. Missenso (mutazione missenso):è una sostituzione genica nella quale la sostituzione di una coppia di basi nel DNA

causa un cambiamento nel codone dell’mRNA, con il risultato che nel polipeptide viene inserito un aminoacido

differente al posto di quello specifico del codone selvatico e il fenotipo risulta mutato; per esempio una transizione da

AT a GC cambia il codone per la lisina (AAA) in un codone per l’acido glutammico (GAA)

Questo tipo di mutazioni si differenziano in conservative e non conservative rispetto al cambiamento amminoacidico.

Vale a dire che con una sostituzione di un amminoacido della medesima classica (polare-polare, apolare-apolare,

basico-basico, acido-acido) non modifica la conformazione della proteina.

Quelle non conservative, invece, comportano la sostituzione di un amminoacido che comporta cambiamenti

importanti dal punto di vista strutturale della proteina

Esempio: l’anemia falciforme

Il sesto aminoacido dell’estremità ammino-terminale della catena nell’emoglobina A è un acido glutammico (carico

negativamente); la catena dell’emoglobina S, invece, contiene nella stessa posizione una valina (neutro)

La mutazione prevede che la sequenza codificante per l’acido glutammico (GAA) muti, andando a codificare per valina (GUA).

A causa del diverso ripiegamento della proteina, la quale passa quindi dall’essere carica negativamente all’essere apolare il fenotipo

del globulo rosso cambia, andando a costituire la caratteristica forma a falce.

Questo genere di globuli rossi sono molto più fragili e tendono a bloccarsi nei capillari portando un danno alla circolazione e ai tessuti

(è pleiotropia).

3. Non senso, è una sostituzione di una coppia di basi nel DNA che determina nell’mRNA un cambiamento da un

codone che specifica per un amminoacido a un codone di stop (UAG, UAA, UGA)

Questa mutazione determina la fine prematura della proteina e prevede quindi il rilascio dai ribosomi di frammenti

polipeptidici, normalmente non funzionanti.

Esiste un sistema chiamato NMD (Nonsense Mediated Decay), in grado di riconoscere la presenza di un codone di stop

e prevenire l'espressione di proteine tronche o erronee.

Questo processo avviene se lo stop è entro il 55esimo nucleotide partendo dal 3’.

Quando l’mRNA esce dal nucleo per essere tradotto ha con sé ancora proteine che prendono nome di complessi di

giunzione esonica.

Il primo ribosoma si lega e fa sì che queste proteine vengano tolte.

Se c’è una zona di stop nella prima regione il riconoscimento fa in modo che l’mRNA si stacchi dal ribosoma e non

venga tradotto. Altrimenti si avrà un codone di stop con interruzione della traduzione.

Se va a degradazione vanno persi gli esoni coinvolti. 42

A causa della struttura del codice genetico differenti gradi di degenerazione caratterizzano i differenti siti.

- Siti non degenerati costituiscono circa il 65% delle posizioni di basi dei codoni uguali.

- Siti degenerati quattro volte costituiscono circa il 16% delle posizioni di basi dei codoni umani.

- Siti degenerati due volte costituiscono circa il 19% delle posizioni di basi dei codoni umani.

4. Senso

Altre mutazioni:

5. Mutazioni nel sito di splicing

Sono mutazioni che si verificano nei siti donatore o accettore o nelle sequenze vicine di elementi conservati dando

origine ad assenza di splicing con ritenzioni di un introne, omissione di esoni, attivazione di siti criptici.

→ Exon skipping: salto d’esone, si verifica la perdita di un dominio funzionale e quindi in alcuni casi dell’intera

proteina.

E’ un metodo che è anche in fase di sperimentazione. Esso prevede l'aiuto di piccole molecole di RNA che si legano a

specifiche regioni dei geni, dette esoni, modificando l'RNA messaggero e risolvendo l’eventuale danno.

→ Intron retention: mutazione a livello del sito accettore, che comporterà la trascrizione dell0introne causando la

perdita del frame.

→Attivazione di siti criptici: ESE, mutazione a livello di un introne che acquista una sequenza per splicing. Aggiungerò a

un esone un pezzo di introne. E’ come facessi slittare una giunzione di splicing.

6. Mutazioni frameshift Interessa un numero di basi diverso da un multiplo di tre.

E’ il risultato di un’inserzione o di una delezione di una o più coppie di base in un

1 2

gene. E’ possibile avere un’inserzione o una delezione.

Con un’inserzione si ha l’aggiunta di una base e con una delezione si ha la

rimozione di una base, ma in entrambi i casi è possibile, a volte, lasciare immutato

l’effetto fenotipico.

Sempre in entrambi i casi avrò una lettura alterata nel momento in cui la delezione

o l’inserzione saranno a valle del codone, in quanto verranno incorporati nella

proteina aminoacidi sbagliati. Può anche accadere che uno dei codoni che si

originano in seguito allo sfasamento della lettura sia un codone nonsenso; in questo caso verrà prodotto un

polipeptide più corto del normale.

7. Mutazioni puntiformi a carico di geni a RNA

Sono mutazioni difficili da identificare perché poco conservate.

Sono uomo-specifiche, il che significa che sono poco conservate tra uomo e altre specie.

Possono avere un effetto sulla struttura secondaria di RNA e, probabilmente, sono molto importanti nelle malattie

complesse.

Ne sono state identificate molto poche.

8. Inserzioni e delezioni

Possono interessare brevi regioni o regioni estese.

Nel caso delle brevi regioni derivano da errori di replicazione, nel caso, invece, di regioni estese, da errori di

ricombinazione.

Delezioni e inserzioni brevi: ripetizioni più o meno estese di una base (TTTT) sono hot spots per piccole inserzioni o

delezion dal momento che possono dare origine ad appaiamenti sbagliati. Possono essere causate appaiamento

errato alla forca replicativa di brevi sequenze ripetute dirette.

Se la delezione coinvolge tre basi non si ha lo spostamento del codice di lettura, ma la perdita di un amminoacido nella

proteina corrispondente. In particolare, la mutazione più frequente nella popolazione caucasica interessa ΔF508, che è

l’agente causante della fibrosi cistica, che causa una delezione della fenilalanina in questa posizione.

Esistono classi di mutazioni che implicano lo scambio di sequenze alleliche e non che coinvolgono le sequenze

ripetute. 43

Anche nel caso di sequenze corte ripetute in tandem si possono verificare inserzioni/delezioni per appaiamento errato

causato da scivolamento di un filamento → è il caso dei microsatelliti

Possono essere causa delle mutazioni dinamiche neurodegenerative da triplette.

Quando si hanno sequenze ripetute i cromosomi omologhi può essere che non siano perfettamente appaiati: ci

possono essere sia crossing over su cromatidi fratelli sia su omologhi.

In questo caso si può generare o una delezione o un’inserzione.

La conversione genica

Un appaiamento errato di sequenze ripetute può causare il fenomeno della conversione genica, cioè uno scambio non

reciproco fra sequenze per effetto del quale una sequenza detta effettrice, diventa identica a una sequenza donatrice,

che rimane inalterata. Può avvenire tra sequenze alleliche, e in tal caso sarà detta conversione genica interallelica, o

non alleliche e sarà detta conversione genica interlocus.

E’ una trasposizione senza perdita.

Può avvenire tra sequenze alleliche o non alleliche.

∎ Esempio 1: sindrome adrenogenitale o interplasia congenita del surrene.

Questa sindrome è dovuta al deficit della steroido-21-idrossilasi, che rientra nel metabolismo di glicoroticoidi e

mineralcorticoidi ed è codificata da CYP21A2.

Le mutazioni del gene CYP21 sono responsabili del deficit di 21-idrossilasi.

Il gene CYP21 (CYP21A2) è situato sul cromosoma 6 nella regione altamente polimorfica del complesso di

istocompatibilità HLA insieme ad uno pseudogene CYP21P (CYP21A1P). Sebbene CYP21 e il suo pseudogene abbiano il

98% della sequenza nucleotidica in comune, quest’ultimo ha accumulato innumerevoli mutazioni che rendono

completamente inattivo il suo prodotto.

Il passaggio di sequenze nucleotidiche normalmente presenti nello pseudogene inattivo all’interno del gene attivo

rendono quest’ultimo incapace di codificare per un enzima funzionante. Il trasferimento di sequenze fra geni

omologhi è solitamente detto “conversione genica” ma rimane un fenomeno ancora non perfettamente chiarito.

∎ Esempio 2: in questo caso sono coinvolti i geni delle globine, che portano a un tipo di emoglobina detta emoglobina

di Lepore, che rilascia con difficoltà l’ossigeno.

Si ha un crossing over ineguale a causa di una forte omologia tra i

geni δ e β; infatti essi differiscono solo per 10 dei 146 residui e

hanno quindi un’omologia di circa il 90%:

La conseguenza di questo processo può essere una forma severa di

β-talassemia, dovuta a una diminuzione della sintesi del prodotto di

fusione δβ, essendo il promotore del gene δ più debole.

All’interno di un gene le mutazioni patogene possono verificarsi

- Nella sequenza codificante

- Nelle sequenze non codificanti intrageniche

- Nelle sequenze di regolazione esterne ai geni

La patogenicità di una mutazione è influenzata da:

- Classe della mutazione e modalità in cui viene alterata l’espressione del gene mutante

- Grado con cui il fenotipo aberrante viene espresso da eterozigote

- Numero delle cellule in cui l’allele mutante è espresso

Non tutte le mutazioni hanno effetto immediato sull’organismo; alcune sono infatti a effetto ritardato, poiché

conferiscono il fenotipo alterato tardivamente nella vita di un individuo.

Alcune mutazioni mostrano non penetranza o variabilità di espressione in individui diversi.

44

Effetti delle mutazioni sulla funzione genica

A) Mutazioni perdita funzione – loss of function

Il gene non è espresso o non è prodotta la proteina.

Queste mutazioni sono dovute a diversi processi, tra cui ricordiamo la delezione* all’interno di un gene o di parte di

un gene, l’inserzione di una sequenza in un gene, la distruzione della struttura genica (traslocazione o inversione),

impedimento del funzionamento di un promotore, diminuizione della stabilità dell’RNA, alterazione del corretto

splicing, introduzione di uno slittamento del modulo di traduzione, formazione di un codone di stop, sostituzione di un

amminoacido essenziale, alterazione della maturazione post-trascrizionale e alterazione della corretta localizzazione

subcellulare.

Riguarda generalmente malattie recessive, ma talvolta può coinvolgere anche malattie dominanti.

→ Recessivo: nella maggior parte dei casi. Metà del totale dei prodotti dei geni WT sono spesso sufficienti per dare un

fenotipo WT.

→ Dominante: può essere di due tipologie

I. Aploinsufficienza: Il gene è importante e la riduzione del 50% della sua quantità può causare aploinsufficienza,

effetto fenotipico.

- Sindrome di Waardenburg: c’è la perdita di funzione del gene PAX3 e ciò causerà una forma di malatti;

II. Dominanza negativa: la proteina non funziona e interferisce con quella WT prodotta dall’altro allele, è una forma di

dominanza negativa.

- Osteogenesi imperfetta: è coinvolto il collagene.

Il collagene è normalmente costituito da due catene pro-α1 e una catena pro-α2.

Si forma una tripla elica con queste catene e, una volta secreto dalle cellule, le estremità N e C-terminali sono tagliate,

dando origine al collagene finale.

In tutto ciò sono coinvolti due geni: COL1A1, che lavora sul cromosoma 17 e COL1A2, che lavora sul cromosoma 7.

Nel momento in cui si ha una mutazione tale per cui uno di questi due alleli non funziona, ci saranno meno catene α1,

ci sarà formazione di osteogenesi imperfetta lieve.

Inoltre, le regioni N-terminali hanno strutture ripetute di Gly-Pro e un terzo amminoacido.

Questa ripetizione permette il conciliamento delle tre catene tra loro

Se c’è mutazione di Gly al C o a N-terminale viene disturbato l’assemblaggio.

In particolare, se c’è una mutazioni a N-terminale ci sarà un assemblaggio non ottimale; se la mutazione è invece al C-

terminale non verrà formata la tripla elica del pro-collagene e, di conseguenza, del collagene.

Esempi di delezione*:

1. Delezione all’interno di un gene: α-talassemia

Nel Crossing Over avviene uno scambio ineguale che ha come risultato la produzione di un gamete con uno solo o con

assenza di geni α.

A seconda dei geni α è possibile distinguere un portatore di talassemia (3α), una forma di α talassemia (2α),

l’emoglobina H (1 solo gene H, formazione di tetrameri di γ che precipitano) e l’assenza di geni nel feto.

2. Delezione di parte di gene: distrofia di Duchenne

Se le delezioni determinano la perdita del frame ci sarà distrofia.

B) Mutazioni acquisto funzione – gain of function

Riguardano mutazioni che possono alterare il fenotipo biochimico di una proteina dal momento che questa viene

prodotta massivamente, il che comporta funzioni maggiori di quelle richieste/alterazione espressione di un gene.

Questi possono essere:

- Mutazioni che aumentano le normali funzioni di una proteina: ci sono forme di emoglobine che funzionano bene ma

non rilasciano ossigeno perché hanno con esso troppa affinità, pertanto è una forma patologica

- Mutazioni che aumentano la quantità di una proteina: si ha un gene duplicato che comporta doppia proteina, allo

stesso modo nei tumori.

- Mutazioni che danno nuove proprietà alle proteine: sono presenti ad esempio nella corea di Huntington, che è

caratterizzata da un aumento di glutammine nella coda. 45

I polimorfismi del DNA

Marcatore genetico: è molto importante in diagnostica, soprattutto nel mappaggio di geni e del genomi.

I polimorfismi sono considerati dei marcatori genetici, ovvero caratteri mendeliani che possono essere utilizzati per

seguire la segregazione di una particolare regione cromosomica lungo un pedigree.

Per avere utilità pratica in studi di mappatura un marcatore deve essere polimorfico, ovvero deve avere almeno due

alleli comuni.

Polimorfismo: il termine polimorfismo significa esistenza di forme diverse e delinea la presenza di almeno due varianti

per un determinato locus all’interno di una popolazione, che abbia la frequenza superiore all’1%, il che fa capire che

non è una mutazione casuale.

Devono quindi esistere più alleli con una certa frequenza all’interno della popolazione.

Se prendo in considerazione più loci con alleli diversi vado a definire un aplotipo (visibile nell’immagine con CD32,

AB21).

Esempio di locus polimorfico

Aplotipo: costituzione allelica di loci multipli di un cromosoma

I polimorfismi possono essere studiati a livello del:

→ Prodotto genico (polimorfismo proteico), dove è coinvolto il cambio di 1-2 amminoacidi.

→ DNA (polimorfismi del DNA)

I principali polimorfismi proteici umani

- Gruppi sanguigni (AB0, MN, Xg, Rh)

- Proteine del siero

- Enzimi eritrocitari

- Altri polimorfismi enzimatici

Metodi di misurazione:

→ Analisi del prodotto proteico per evidenziare i polimorfismi

Il polimorfismo proteico può essere studiato mediante elettroforesi delle proteine.

Ciò che si ottiene sono alleli con pesi diversi, un cambio di migrazione, il che fa capire variabilità.

Il processo alla base del polimorfismo è il fatto che il DNA non è un’entità statica ma dinamica, poiché è soggetta a

cambiamenti ereditari che insorgono casualmente, fenomeni che rientrano nel processo evolutivo.

La variazione del DNA, cadendo in zone non codificanti, non viene

riparata e fissata.

Dal punto di vista evolutivo si ha un allele 1 che muta dando origine

a un allele 2, creando una situazione di polimorfismo obbligato.

Questi alleli devono essere mantenuti nella popolazione per essere

definiti polimorfici.

45

→ Variabilità di un genoma:

1. Proporzione dei loci polimorfici (P)


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher serena.savoldi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica umana e medica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Marozzi Anna.

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