Appunti Genetica molecolare umana

Genoma umano e NGS

Il Progetto Genoma Umano prevede il sequenziamento del genoma dell'uomo per ottenere la sequenza nucleotidica di tutto il genoma. Sono stati attivati poi dei progetti complementari al sequenziamento di topo, arabidopsis e di Escherichia coli. Non esiste una proporzionalità tra la quantità di paia di basi e il numero di geni che ogni organismo possiede.

Le prime scoperte fatte grazie al Progetto Genoma Umano hanno dimostrato che nel genoma sono presenti 23.000 geni codificanti. Ma è stato visto che gran parte del genoma è costituito da sequenze ripetute, che sono raggruppabili in base alle loro caratteristiche: ripetizioni in tandem o DNA satellite che presenta una composizione particolari ricca di AT, sequenze intersperse dove la categoria più presente nel genoma sono le SINE, le LINE e le LTR. Il 95% dei geni subisce splicing alternativo, dove ogni genere può dare origine a trascritti diversi e proteine diverse. I meccanismi di splicing alternativo sono diversi e il più facile è l’exon skipping, dove in particolari tessuti o sotto particolari stress viene saltato un esone e si ha l'origine di un trascritto diverso dal trascritto originale.

Oltre allo splicing alternativo vi possono essere anche promotori alternativi, dove alcuni promotori non vengono usati e ne vengono usati altri all'interno della sequenza portando all'origine di un trascritto diverso. Questi meccanismi sono importanti anche da un punto di vista della ricerca, visto che molti meccanismi di splicing si verificano all'interno delle cellule tumorali.

Microarray e nuove tecnologie

Fino a qualche anno fa l'espressione dei geni veniva misurata mediante l'utilizzo di microarray, dove su dei vetrini venivano fissati dei probe di DNA, che erano stati precedentemente estratti e venivano studiati i pathway stessi e venivano generati cDNA e marcati con fluorofori. A seguito dell’ibridazione si ottenevano degli spot che davano informazioni sulle espressioni di determinati geni in esame.

È stata successivamente sviluppata una nuova tecnologia dove ogni vetrino veniva ibridato con il campione di mRNA, che venivano retrotrascritti e biotinati e si avevano delle intensità relative per ogni vetrino e per ogni campione. Sempre sul supporto si poteva studiare dove questi fattori trascrizionali erano posizionati nel genoma. Si prendevano le cellule, si isolava il DNA e lo si frammentava. Tutte le proteine legate al DNA venivano selezionate mediante l'utilizzo di anticorpi specifici. Il campione di controllo era senza l’anticorpo oppure con un anticorpo non correlato che riconosce solo dei legami specifici. Successivamente gli anticorpi venivano etichettati con fluorofori e infine ibridati su vetrino grazie alla presenza delle sequenze promotrici. Si va a leggere l'intensità dell'anticorpo specifico con il fluoroforo di riferimento. In questo modo si riesce a capire dove la proteina regolatoria si sedeva sul DNA per regolare l'espressione genica.

Con l'avvento del NGS è stato messo a punto un metodo che è in grado di rilevare la frequenza del campione mediante il processo di sintesi. I frammenti in esame si legano ad un supporto solido formando dei bridge e, come primo step, si creano dei cluster del frammento in quella posizione per amplificare il segnale. Durante gli ultimi cicli di amplificazione, vengono inseriti dei nucleotidi fluorescenti. Questo metodo permette di analizzare quantitativi di campione inferiori rispetto al metodo precedente.

Super sequenze e RNA non codificanti

Sempre nel Progetto Genoma, sono stati identificati e le super sequenze conservate, 481 UCI, che sono conservate e identiche tra uomo, ratto e topo. Queste sequenze sono disperse nel genoma, vengono trascritte e sono non coding RNA e microRNA. Sono coinvolte in diversi processi che servono alla cellula per vivere ed espletare le proprie funzioni in maniera corretta.

Nelle cellule tumorali molto spesso si hanno non coding RNA che sono regolati. I non coding RNA possono essere posizionati nell'introne di un gene. Mediante CHIP-SEQ si ha la possibilità di vedere diverse proteine dove sono legate e se sono legate ad una sequenza di DNA specifica. La mRNA-SEQ si usa per valutare quali geni sono espressi e si possono identificare anche quali regioni del genoma non verranno trascritte.

Progetti internazionali e test genetici

Il Methyl-seq permette di capire dove il DNA viene mitigato, molto importante nel imprinting dei geni, nell’ereditarietà corretta dei geni quando si forma lo zigote. Dopo il Progetto Genoma e l'avvento delle NGS, sono stati introdotti nuovi progetti internazionali divisi in uomo e topo, come il progetto ENCODE. È stato attivato anche un progetto chiamato Hap Maps che è incentrato nello studio dei polimorfismi SNP. Analizzando i genomi di individui provenienti da tutti i continenti, hanno cercato di capire come gli SNP influenzassero l’insorgenza di determinate patologie correlate alle diverse popolazioni. La popolazione con più SNP è quella africana. Grazie all'avvento delle NGS il tempo per il sequenziamento si è notevolmente ridotto. Gli NGS hanno permesso di velocizzare i test genetici e le risposte a queste per poter fornire delle diagnosi rapide.

I test genetici sono diversi dalle consuete analisi in quanto i risultati che forniscono sono permanenti per l'individuo. Occasionalmente alcune forme di test genetici possono rivelare informazioni non desiderate sulla paternità, possono essere eseguiti con finalità diagnostiche ma anche predittive per patologie future e i risultati possono avere conseguenze importanti per altri membri familiari. La consulenza genetica ha lo scopo di aiutare la persona e la famiglia a comprendere la componente genetica della malattia in esame, la probabilità di svilupparla e/o trasmetterla, le opzioni procreative, le conseguenze della malattia e la strategia terapeutica, quanto disponibile per la prevenzione.

Mediante analisi genetiche si possono ottenere dati per poter sviluppare una terapia personalizzata, ma anche la possibilità di identificare come sono i portatori per eventuali gravidanze future per poter effettuare diagnosi prenatali preimpianto. Esistono diverse tipologie di consulenza:

• Consulenza prenatale
• Consulenza genetica post-natale
• Consulenza genetica oncologica

Esistono diverse categorie di test genetici:

• Test diagnostici consentono di formulare una diagnosi o confermare un sospetto clinico
• Test predittivo
• Test identificazione dei portatori consentono di identificare gli eterozigoti per malattie recessive
• Indagini medico legali permettono di identificare i genotipi che pur non essendo di per se casi di malattia, comportano un aumento del rischio di sviluppare una determinata malattia in seguito ad esposizione a fattori ambientali favorevoli, o alla presenza di altri fattori genetici scatenanti

Diagnosi prenatale

Lo sviluppo di malattie genetiche aumenta con l'avanzare dell'età della madre, perché si va incontro ad un maggior rischio di errori di segregazione dei cromosomi. La diagnosi prenatale prevede il prelievo del liquido amniotico, prelievo di placenta e ad oggi si possono usare anche test NGS andando a pesare il DNA fetale libero del plasma materno e capire se il feto è malato o meno, come nel caso della Trisomia 21. La placenta rilascia infatti cellule che vanno incontro ad apoptosi e il DNA si riversa all'interno del torrente circolatorio materno già a partire dall'ottava settimana. In questo modo si può procedere con un’analisi non invasiva del genoma del feto. Questi test valutano principalmente le trisomie del 21, del 18 e 13.

Alberi genealogici e analisi indiretta

Un'analisi genetica non può essere fatta se prima non si ha un albero genealogico della famiglia che si sta prendendo in esame in quanto, l'albero, fornisce sempre tante informazioni inerenti al pattern di ereditarietà dei geni, della causa della malattia. Ancora oggi, nella pratica ospedaliera, le varie parentale vengono effettuate a mano e risultano difficoltosi i calcoli delle probabilità. Molto importanti sono le determinazioni di consanguineità delle malattie, in quanto si ha una maggior probabilità di trasmissione dei geni recessivi. Da quando si è sequenziato il genoma umano, è emerso che tutti siamo portatori di alleli recessivi dei nostri cromosomi. Per questo motivo, se due consanguinei decidono di procreare, nonostante nella loro famiglia non vi siano casi di patologie genetiche, presentano comunque una probabilità più alta di trasmettere i geni recessivi alla prole.

Una prima analisi dell'albero genealogico permette di vedere se vi è verticalità o orizzontalità nella trasmissione della malattia:

• Orizzontale -> è una malattia recessiva
• Verticale -> malattia dominante

Inoltre, bisogna prestare particolare attenzione alla presenza di un alto numero di maschi affetti, che indica una patologia di tipo X-linked recessivo. Quando, invece, i maschi trasmettono la malattia solo alle figlie è di tipo X-linked dominante. Definiamo come penetranza un valore tra 0 e 1 che indica la probabilità di manifestazione del fenotipo. Con il termine espressività variabile si indica il grado con cui nei diversi individui si manifesta una certa mutazione.

Quasi tutte le malattie sono caratterizzate da una certa percentuale di casi che presentano mutazioni de novo. Con l’avanzare dell’invecchiamento infatti, gli acidi tendono ad accumulare cromosomi di non disgiunzione alla meiosi 1. Le cellule uovo non fanno tanti cicli meiotici, perché dopo la nascita il numero degli oogoni diminuiranno. I cicli mitotici sono quindi pochi dal momento che si è formato l'ovaio primitivo al momento in cui le cellule del feto sono andate in meiosi. Nell'uomo, invece, si assiste ad un processo continuo. Gli spermatogoni procedono con divisione mitotica dove una cellula rimane spermatogone e l'altra procede con la meiosi e durante la fase di sintesi si ha un aumento di 10^-7 mutazioni durante la replicazione.

Più volte la cellula va incontro a cicli mitotici e più sarà probabile che vi siano errori con l'aumentare dell'età, aumentando anche il rischio di mutazioni de novo. Il 90% delle mutazioni de novo avvengono a livello del genoma paterno. Il 90% delle aneuploidie avviene a livello del genoma materno. Il rischio di ricorrenza delle mutazioni de novo è del 5%. Può capitare che a livello germinale vi siano dei mosaicismi indicando un aumento della probabilità di trasmettere una mutazione de novo.

Per la stragrande maggioranza delle malattie dominanti gli effetti sono presenti negli eterozigoti, mentre gli omozigoti dominanti sono incompatibili con la vita. Tra le malattie recessive più comuni riscontriamo la fibrosi cistica, l'anemia falciforme è la fenilchetonuria. Per ognuna di queste malattie è stata spiegata da superiorità dell'eterozigote, spiegando il mantenimento degli alleli nella popolazione. Nelle malattie X-linked recessive, lo stato di portatrice della madre è certo se ha parenti maschi affetti. Le femmine possono essere affette se il padre è affetto e la madre è eterozigote. Le malattie X-linked dominanti, come alcune forme di rachitismo, entrambi i sessi possono essere affetti, più frequentemente sono affette le femmine. I figli di una donna affetta possono avere il 50% di avere figli e figlie affette. Le malattie X-linked dominanti sono letali nei maschi, per questo motivo si vedono maggiormente femmine affette dalla patologia. Un caso particolare è quello delle bambine affette da Duchenne, dove avevano un X normale e un X per cui avevano una traslocazione con un autosoma, dove la traslocazione cadeva dentro al gene MDM1. La patologia si manifestava a causa dell’inattivazione del X.

Non esistono delle malattie Y-linked, ma prevalentemente dei tratti, come le orecchie pelose, in quanto l’Y non contiene molti geni e uno dei più importanti è la SRY che si trova al di sotto della regione pseudoautosomiale che è una regione in comune con l'X.

Citogenetica

La citogenetica è usata per evidenziare anomalie del cariotipo per il mappaggio dei geni sui cromosomi. L'analisi cromosomica prevede l'analisi del cariotipo, Fish e derivati, in modo da individuare patologie cromosomiche. La probabilità di avere una patologia cromosomica per un neonato è di 1 su 200, e più del 50% degli aborti spontanei nel primo trimestre sono dati da anomalie cromosomiche. Uno su 100 è portatore di un'anomalia bilanciata, come nel caso delle traslocazioni bilanciate, che però non dà effetti sul fenotipo ma può causare problemi di infertilità.

Grazie allo studio degli aborti spontanei precoci, la riproduzione umana è altamente imperfetta, in quanto il 25% degli ovociti è caratterizzata da aneuploidie causate da difetti di non disgiunzione. Questo evento avviene durante la meiosi, sia in meiosi 1 che è la più frequente che in meiosi II. Il prodotto più grave quando si ottiene dalla meiosi 1. L'unica monosomia che è letale è la sindrome di Turner. La mancanza delle coesine delle proteine che proteggono le cosine causano la non-disgiunzione in meiosi. Le cosine favoriscono il legame al cinetocore nel fuso e entrano in gioco nel mantenere unite le tetradi. Quando si ha un errore dalla quantità delle coesine si assiste ad una separazione prematura dei cromatidi è una separazione inadeguata.

Con il termine poliploidie ci riferiamo alla presenza di corredi cromosomici 2N dove si hanno difetti interi di n, ossia le cellule con un numero di cromosomi corrispondente ad un multiplo esatto del corredo aploide. La triploidia può essere dovuta alla doppia fecondazione da parte di 2 spermi ed è tra le cause più frequenti di aborto spontaneo. Rappresenta il 15% degli errori cromosomici. La tetraploidia invece deriva da un ciclo mitotico che non presenta citodieresi. A livello morfologico quando si verifica una triploidia con 2 set paterni oppure in altre condizioni, dove l'assetto cromosomico di tipo androgenico, ovocita senza nucleo fecondato da 1 o 2 spermi, da un punto di vista morfologico è riconoscibile perché si assistono a delle anomalie della placenta.

Nel cordone ci sono tre vasi: una vena e due arterie, dove la vena porta il sangue ossigenato al feto mentre le arterie portano il sangue refluo alla madre. Quando un ovocita vuoto è fecondato da due spermatozoi non si ha niente di materna e si ha solo la formazione della placenta definita come mola completa o Mola lievitiforme che, se non viene tolta, diventa tumore, coriocarcinoma. I geni dell’imprinting paterno sono importanti per la crescita del feto e dalla placenta, come IGF2 che è il più potente fattore di crescita. Quando ci sono due complementi paterni questi tendono a formare villi coriali molto grossi. Se un ovocita innesca la sua divisione cellulare in maniera autonoma dà origine al teratoma ovarico, che ha una massa benigna che non ha niente a che fare con il tumore, che si sviluppa a livello ovarico costituito da diversi tipi di tessuto.

Per procedere con l'analisi del cariotipo, servono cellule in metafase. Nel sangue ci sono cellule già differenziate e non entrano in mitosi, ma mediante processi che permettono la stimolazione della proliferazione cellulare, dopo 72 ore linfociti blastizzano ed entrano in mitosi. Si usa un veleno che inibisce la formazione del fuso mitotico in modo da separare i vari cromosomi e si crea il cariotipo. I cromosomi vengono bandeggiati e le zone chiare sono le zone trascrizionalmente attive, mentre le scure sono zone di eterocromatina. Una banda cromosomica è possibile analizzarla con il microscopio. La citogenetica non è in grado di individuare alterazioni più piccole di una banda cromosomica.

I cromosomi vengono classificati in relazione alla posizione del centromero che li divide in un braccio p e in un braccio q. In base alla posizione del centromero possiamo avere cromosomi metacentrici, submetacentrici e acrocentrici. I cromosomi acrocentrici vengono definite come cromosomi Robertsoniani, dove si hanno due fili sottili di cromatina che legano i satelliti e sono rappresentati dei cromosomi 13, 14, 15, 21 e 22. Questi cromosomi tendono a traslocare uno con l'altro e a dare origine ad un cromosoma metacentrico con perdita dei satelliti che però non causano alcun danno a livello fenotipico in quanto l’RNA risulta essere ridondante.

La tecnica FISH è un’ibridazione in sito o sui nuclei o sui cromosomi e non si procede con alcune estrazione di DNA. Il painting prevede l'utilizzo in modo simultaneo di una stessa sonda. Per capire se ad un certo corredo genetico manca un frammento cromosomico si usa la tecnica CGH ARRAY. Estraendo il DNA questo veniva ibridato con un DNA normale si ottiene un mix di sequenze. Per distinguere il DNA che si vuole testare lo si ibrida con dei fluorocromi diversi. In un array, che contiene tanti punti del genoma in fila, in relazione all'emissione di colore, si possono ricavare informazioni sul quantitativo cromosomico se presente o mancante. Permette di vedere tutte quelle traslocazioni che sono piccole e sbilanciate.

Una traslocazione 14 21, alla meiosi porta alla formazione di una struttura che permette la separazione dei cromatidi diversi su diversi piani, portando alla formazione di una possibilità su 3 di down. Anche nella traslocazione bilanciata, durante la traslocazione delle tetradi si hanno problemi. Le delezioni comportano un aploinsufficienza portando ad un dosaggio genico del 50% che è sempre causa di malattia, come la Cri du chat. Viene definita in questo modo perché mancano dei geni che portano a delle anomalie della laringe, causando il pianto del gatto. La sindrome di George, invece, presenta una delezione all'interno del cromosoma 21 portando ad anomalie cardiache, al mancato sviluppo del timo e a difetti immunitari.

Struttura e regolazione della cromatina

Il genoma umano è organizzato in 46 cromosomi. Il DNA è una doppia elica destrorsa costituito da singoli nucleotidi che contengono basi A, C, G, T, uno...