Chimica dei biofarmaci

TALACOTUZUMAB

Altro esempio extra, per capire quanto può essere complessa la situazione ed è importante capire dove

lega l’anticorpo, sempre parlando di anticorpi che bloccano i recettori, sempre nella famiglia delle

interleuchine, IL-3 ha un sistema recettoriale molto complesso per il fatto di come si devono disporre tra di

loro le tre catene in presenza di ligando, per poter dare trasduzione del segnale. All’esame non verrà

chiesto nello specifico il blocco del recettore dell’interleuchina 3, da sapere in generale e che come in

questo caso bloccare l’anticorpo non è una cosa così semplice, motivo per cui ci serviamo degli studi

strutturali.

Situazione fisiologica: il recettore presenta strutture di alfa eliche abbastanza raccolte:

• subunità alfa che è tipicamente legata alla membrana ma non ha la porzione intracellulare di

trasduzione del segnale; quindi la funzione di questa catena è principalmente quella di legare il

ligando. Tale subunità ha una conformazione aperta che riceve il ligando e una chiusa che lo

ingabbia dopo il suo legame. Ho un sito 1 abbastanza importante tra il ligando e la prima catena.

• catena beta è un dimero che ha la porzione intracellulare in grado di legare jak2 e quando arriva in

vicinanza transfosforila e permette la trasduzione del segnale.

Quando si incontra la subunità alfa con il ligando e il dimero della subunità beta, si crea un complesso

esamerico perché ho 2 copie della catena alfa, 2 copie del ligando e due copie della catena beta e ancora

non è in grado di trasdurre perché le due porzioni fosforilabili sono ancora isolate. Questo oggetto

dimerizza ulteriormente e solo quando arriva a dimerizzare, le subunità beta intracellulari vengono

transfosforilate e parte la segnalazione.

A questo punto voglio selezionare un anticorpo monoclonale in grado di bloccare questo meccanismo e

quindi impedire all’interleuchina 3 di fare la trasduzione del segnale.

Talacotuzumab lega la subunità alfa implicata nell’interazione col ligando con meccanismo duale: è lo

stesso anticorpo che riconosce sia la conformazione chiusa, andando al posto del ligando, ma anche la 4

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conformazione aperta in presenza del ligando, impedendo poi di chiudersi intorno al ligando. In nessun

modo permette la formazione del dodecamero.

Infatti, lo studio strutturale ci fa vedere che esistono due possibili configurazioni del recettore che è quello

giallo e l’anticorpo che lega in condizione aperta o chiusa, anche in presenza del ligando e non è necessaria

la competizione del ligando, ma conta impedire i meccanismi successivi che portano alla trasduzione del

→

segnale il nostro obiettivo non è non mandare il ligando a legarsi sul recettore, il nostro obiettivo è

impedire la trasduzione del segnale. Quindi, l’anticorpo può legarsi alla subunità legante del recettore ma

anche il ligando può essere presente, e non è un difetto perché alla fine anche questo è un sito necessario

per la trasduzione del segnale e quindi l’effetto finale è il blocco del recettore. Il messaggio finale è che

capire quali epitopi devono essere bloccati per avere effetto voluto, sia nel caso di blocco o attivazione del

recettore (questo caso lo vedremo successivamente), non si può programmare facilmente e ci aiuta molto

lo studio strutturale del complesso tra anticorpo recettore e ligando per capire come funziona.

Nell’esempio precedente abbiamo visto o ligando o anticorpo, qua abbiamo visto che può esistere

recettore con ligando e anticorpo, ma questo blocca comunque la trasduzione del segnale.

BIOFARMACI PER IL TRATTAMENTO DELL’ARTRITE REUMATOIDE:

meccanismo molcolare correlato all’effetto terapeutico

Torniamo a una classificazione più farmacologica e l’esempio migliore è come sono stati usati i farmaci

biologici nella terapia nell’artrite remautoide (AR). È un caso importante perché in questa malattia i

farmaci biologici hanno rappresentato una svolta, perché gli approcci terapeutici classici che andavano a

occuparsi dell’aspetto infiammatorio, non intervenivano sui meccanismi di azione della malattia e quindi

non curavano la malattia, a differenza invece dei farmaci biologici che intervengono sui meccanismi

molecolari della malattia (disease modyfing anti-rheumatic drug, DMARDs)

Nell’ AR ho un quadro di infiammazione cronica, che si affianca a un quadro di autoimmunità:

• Il processo infiammatorio è sostenuto da citochine, da messaggeri intracellulari che si

attivano in una situazione di problema chimico, meccanico e tecnico, le cellule sentono una

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situazione di shock, comunicano tramite citochine alle cellule in vicinanza questa

situazione. Questa è la parte fisiologica del meccanismo infiammatorio, che dovrebbe

portare ad una risposta di riparazione del danno ma quando si cronicizza per colpa della

componente autoimmune, diventa un processo patologico che si autoalimenta e anziché

limitare il danno, aumenta e produce ulteriore danno. Alla fine, l’infiammazione cronica,

con eccesso di citochine pro-infiammatorie circolanti (es. TNF-alfa, IL1) porta a ulteriore

danno sulle strutture articolari fino a dolore e deformazione.

• Processo autoimmune: il sistema immunitario reagisce negativamente, cioè produce una

risposta immunitaria sia cellulare (con linfociti), sia umorale (con anticorpi), diretta contro

antigeni self, espressi da osteoclasti e tutte le altre cellule articolari. Abbiamo la linea dei

linfociti b che arriva ad attivarsi sempre con l’intervento e il concorso di citochine, arrivando

fino a plasmacellule che producono autoanticorpi. Abbiamo anche la componente cellulare,

per cui vengono attivati tramite la presentazione di antigeni self, linfociti t citotossici che

vanno ad attaccare proprio le cellule articolari incrementando il danno

Quindi, una ipotesi terapeutica che cerca di intervenire sui meccanismi della malattia, deve interferire con

la segnalazione di queste citochine pro-infiammatorie over espresse. Quindi possiamo agire sul blocco del

recettore e il blocco del ligando, che sono i meccanismi di scelta per fare questa operazione. Il TNF è il più

importante dei mediatori infiammatori nell’AR e si cerca di utilizzare l’anticorpo monoclonale che blocca il

TNF e che impedisce di attivare i suoi recettori e quindi inibire la risposta pro-infiammatoria patologica. Ma

nello stesso modo posso pensare di bloccare il recettore stesso.

Quindi in questo caso, due meccanismi diversi (blocco del ligando e blocco del recettore), portano allo

stesso obiettivo terapeutico, ovvero interrompere la risposta pro-infiammatoria cronicizzata.

Esempio del TNF: sviluppo un

anticorpo monoclonale che lega con

alta affinità la citochina, con

obiettivo di tenerla fuori dalla

cellula, infatti il mio anticorpo nello

spazio extracellulare incontra il TNF

e lo lega, impedendogli di andare

sul recettore. Questo è il

meccanismo di blocco del ligando.

Qui voglio legare il ligando solubile

impedendogli di andare sul

recettore, si potrebbe dire che a

livello molecolare c’è una

competizione tra l’anticorpo e il

recettore per il ligando solubile. Se

ho un anticorpo che ha sufficiente

affinità e lega bene il ligando e riesco a farlo arrivare nel sito di azione in concentrazione sufficientemente

elevata, questa competizione va a vantaggio del farmaco e tutto il TNF viene bloccato dall’anticorpo e non

va a legare il recettore. (Questo meccanismo in realtà esiste anche in Natura per il tPA).

Qui il meccanismo di controllo che regola fisiologicamente la concentrazione di TNF nel soggetto sano, è il

recettore solubile, ovvero una proteina che è la porzione extracellulare del recettore, che non ha la 6

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porzione transmembrana che la tiene legata alla membrana, è libera in soluzione e ha lo stesso sito di

legame per il ligando, lega il ligando ma lo mantiene lontano dal recettore vero attivo. Questo meccanismo

fisiologico si ha quando la concentrazione di TNF in un soggetto sano è troppo alta, entra in gioco il

recettore solubile e ne elimina una parte e diminuisce la risposta.

Noi abbiamo imitato questo, costruendo un anticorpo monoclonale, ovvero una proteina con alta affinità

per il TNF che fa esattamente lo stesso lavoro. A dimostrazione che è esattamente lo stesso lavoro, esiste

anche un farmaco che è la versione ingegnerizzata ricombinante del recettore solubile, proprio perché è

esattamente lo stesso concetto e lo vedremo a breve. A dimostrazione di quanto nel caso specifico

degli anticorpi anti-tnf, l’approccio basato

sull’anticorpo monoclonale terapeutico è valido,

ne abbiamo tutt’ora sul mercato quattro diversi,

di alcuni di questi ne siamo arrivati anche ad

avere i biosimilari.

Infliximab è un anticorpo chimerico, che in

questo caso mi va bene perché non ho bisogno

di citotossicità e di porzione fc attiva, mi basta

che abbia una buona emivita, infliximab è

adesso sul mercato. Poi troviamo due anticorpi

umani, Adalimumab e Golimumab, che ci

aiutano a ricordare i due modi possibili di

ottenere anticorpi completamente umani in

quanto Adalimumab viene fuori dal metodo delle librerie fagiche, il Golimumab viene dal topo transgenico,

che è immunizzato ma esprime l’immunoglobulina umana. Fino ad arrivare al Certolizumab pegol che è un

frammento fab’, quindi monovalente, la porzione legante con una catena leggera e una pesante, ma è

pegylated, per renderlo più stabile ha pendagli lunghi di polietilen glicol, cioè di CH2 e CH2O (n volte),

quindi con una catena lineare, leggermente polare (funzione eterea), flessibile, che aiuta a migliorare

l’emivita. Questi quattro hanno lo stesso meccanismo di azione, tutti e quattro sono immunoglobuline anti-

TNF, la differenza è strutturale, riconoscono epitopi leggermente diversi sul TNF, ma sempre epitopi per

→

impedirgli di andare sul recettore e questo di nuovo ce lo dice la biologia strutturale infatti prima si va a

studiare come si lega il fattore al suo recettore e scopriamo in questo caso che il tnf forma un trimero in cui

vediamo tre molecole uguali, una

blu, una nera e una grigia, che sono

tre unità di TNF leganti tre unità di

recettore uguali; quindi,

formalmente ho un complesso 1 a 1

TNF-recettore con in realtà ho tre

unità di TNF legate tra di loro che si

legano a tre unità di TNF.

Questo mi permette di stabilire

quale è il sito di interazione tra il