Biologia cellulare

Page 36 Il concetto di fluorescenza è un principio fisico e abbiamo l

emissione di luce da parte di una sostanza sottoposta a

irraggiamento. Quindi se io ho una sostanza come un

fluorocromo e gli passo un raggio uv abbiamo la produzione

di un energia che dà appunto l effetto della fluorescenza e l

emissione di una radiazione

Page 37 Nel microscopio a fluorescenza ci sono due filtri da

ricordare, uno di eccitazione e uno di sbarramento. Il primo

è quello che eccita il fluorocromo, il secondo è quello che

trattiene la fluorescenza che sta emettendo

Page 38 Esistono una serie di fluorofori o fluorocromi, che si

chiamano in maniera diversa, i principali sono i CFP e le

tdTomato, che sono dei fluorofori che sono diversi risp l uno

all altro.

Ora con l aumento della tecnologie ci sono tantissime

colorazioni disponibili grz a fluorocromi diversi

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Page 40 Il più famoso fluorocromo è la gfp, che viene ottenuto da

una medusa verde che emette una sua fluorescenza. Sono

riusciti a isolare questa proteina e di utilizzarla sia nel

campo della microscopia che in quello della genetica e

dalla gfp, che è ststo un po il capostipite della fluorescenza

sono state trovate altre molecole che vengono molto

utilizzate, come la ds red ecc, che sono proteins che hanno

alla base che è la gfp, ma che poi emettono fkuorescenze

diverse.

Page 41 Esistono ad oggi 57 proteine fluorescenti con diversi coloro,

quindi è una cosa molto usata nel campo della

fluorescenza, bisogns stare attenti che quando uniamo dei

coloranti al nostro campione non andare a interferire con le

sue proprietà, quindi a non cambiare nel corso dell

esperimento quello che io voglio andare a vedere.

Page 42 Altri nomi importanti che definiscono una stipologia di

esperimento, quindi dobbiamo andare a utilizzare quando

facciamo un esperimento degli anticorpi. Dobbiamo

utilizzare dei reagenti che abbiamo un alta specificità,

quindi che siano capaci di riconoscere in maniera precisa e

selettiva l antigene che voglio andare a vedere. Abbiamo 4

parametri molto importanti che sono la specificità, e quindi

il nostro anticorpo deve essere capace di riconoscere in

maniera specifica il nostro antigene pk se io non uso un

anticorpo che è specifico per il mio antigene avrò un

esperimento dove avrò dei falsi positivi. Il nostro anticorpo

deve essere sensibile, quindi devo utilizzarne una minima

quantità e questo viene riportato sull indicazione dell

anticorpo che si compra. Se c'è scritto che devo utilizzarne

10 ma ne uso 100 ank lì vado incontro a dei falsi positivi, pk

il nostro anticorpo si legherebbe all antifene in maniera non

specifica e non sensibile. Abbiamo poi la risoluzione e cioè

la capacità di veree perfettamente il nostro campione e

soprattutto poi devo avere dei reagenti e cioè degli anticorpi

che sono riproducibili, cioè se devo rifare lo stesso

esperimento fra un mese quell anticorpo che sto utilizzando

dece essere sempre uguale a se stesso e deve darmi

sempre la stessa identica fluorescenza. In disgnostica non

potremmo mai usare un reagente scaduto pk come vi

dicevo la fluorescenza decade

Page 43 Praticamente la reazione che si utilizza per fare qualcosa in

fluorescensa è la reazione antigene-anticorpo, dove la parte

grigia è la membrana della cellula, il verde sono gli antigeni,

quindinsulle superfici abbiamo una serie di proteine che

sono tipiche delle cellule, ogni cellula ha antigeni diversi, io

posso in questo mio esperimento prendere degli anticorpi

che sono quella parte rossa che si va a unire perfettamente

e specificatamente solo al mio antigene e lo posso

prendere già collegato. Quindi faccio un incubazione,

prendo un campione di cellule, e gli metto sopra la mia

fluorescenza, cioè il mio anticorpo, c'è un incubazione che

viene fatta al buio, dopo di che viene lavato e tutte le cellule

che presentano un antigene specifico per quel anticorpo si

saranno legate e saranno in fluorescenza.

Page 44 È importante il controllo dei negativi e dei positivi, per

essere sicura che il mio anticorpo che sto utilizzando in un

esperimento mi farà vedere tutto bello verde devo essere

sicura che quell anticorpo funzioni in maniera corretta

quindi devo avere un campione di controllo che so che è

positivo, qcs che io so essere sempre positivo in maniera

che quando poi vado a fare l esperimento se l anticorpo e

positivo allora io posso dire che il controllo positivo è

venuto giusto. Lo stesso vale ank per il controllo negativo,

dove la reazione dell anticorpo fluorescente è sbagliata,

quindi se ho un controllo negativo non devo avere nessuna

fluorescenza

Page 45 Questo è un altro reagente, anticorpo che si usa

tantissimissimo ed è fondamentale nella sperimentale della

fluorescenza, che si chiama DAPI. Ed è un colorante che

lega in maniera molto specifica e molto forte delle regioni

del DNA scritte in sequenza A-T. Io sono in un campo buio,

ho il microscopio a fluorescenza nel mio laboratorio,

ovviamente sono in una camera buia pk se fossi in un

ambiente luminoso non vedrei il colore, il mio cambio lo

metto sotto, metto a posto la fluorescenza, incomincio a

mettere a fuoco. Per mettere a fuoco con il mio

microscopio a fluorescenza devo colorare il nucleo, che è

sempre blu, riesco a scendere con la microscopia dentro il

nucleo, che mi fanno dire che ah perfetto ho trovato la

cellula. È importante riuscire a riconoscere il nucleo, pk ti dà

la strada, nel senso è una luce nel buio che ti dà la strada

che sei a fuoco, hai trovato il tuo campione e ora vai a

vedere altri parametri.

Page 46 Esistono due tipi di fluorescenze, la primaria e la

secondaria. Alcuni campioni hannp un alta fluorescenze,

quindi è un campione che da solo spara fluorescenza, ci

sono ank dei supporti che da soli sparano fluorescenza, per

esempio le plastiche, infatti noi usiamo sempre il vetro,

quindi vetrini di vetro e non vetrini di plastica pk la plastica

ha una sua autofluorescenza. Quindi è una reazione di

alcune eccitazioni ank se in realtà non c'è nessun legame di

alcun genere

La fluorescenza secondaria invece è proprio quella in cui

vado ad utilizzare dei fluorocrominche si lega

specificatamente a un antigene e quindi lo posso vedere

Page 47 La prima è una cellula dell epidermide che produce

cheratina, quindi vediamo questo nucleo blu, che non tutte

le cellule lo producono. Ci sono dei fibroblasti e poi delle

cellule tumorali x il cancro della prostata e dei

mitocondri.questi colori che vedi è pk uno utilizza diversi

fluorescenti, diversi fluorocromi. Coloro con un anticorpo il

nucleo, poi coloro con un altro anticorpo con un altro colore

i mitocondri se ci sono, poi vedo se ho i ribosomi e prendo

un altro anticorpo che è specifico per il ribosoma che è

verde. Quindi dopo che ho fatto tutte queste incubazioni

vado al microscopio e posso vedere tutte queste 3

colorazioni. Passo il primo filtro e vedo il blu cioè il nucleo,

poi cambio filtro e vedo i mitocondri, faccio una foto, e poi

vado a vedere i ribosomi con un altro filtro, rifaccio un'altra

foto e poi le unisco le varie foto per farla diventare una foto

di microscopia.

Page 48 Il chiaro è il microscopio che hanno tutti, la fluorescenza è

un plus di laboratorio, ha un costo notevole, quindi la

fluorescenza in genere si divide fra più gruppi, invece di

confocale ce ne sono pochi. Sono strutture molto più

complicate, complesse, molto più delicate. Per utilizzarle

non basta mettere sul vetrino, alzo il piatto e giro il revolver,

ma è una macchina molto più sofisticata. Di base utilizza

campioni che sono colorati con la fluorescenza, quindi il

processo della colorazione è lo stesso, però rispetto alla

fluorescenza ho sicuramente un maggior contrato e una

risoluzione molto più elevata. Questo microscopio fa vedere

delle immagini quasi tridimensionali, questo pk riesce a

scannerizzare l intera struttura, quindi se ho nel vefrino una

struttura che ha una certa bidimensionalità il microscopio

confocale fa varie foto sequenziali con un software del mio

campione, tali x cui poi quando si rimettono insieme ho una

tridimensionalità di quello che ho visto, quindi non ho una

bidimensionalità come con il microscopio a fluorescenza. Il

confocale ti permette di avere questa scannerizzazione su

diversi piani che poi un software di immagini riesce a

rimettere insieme e a dargli una sua dimensione.

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Page 51 Questo è quello che succede in una fotografia confocale.

Praticamente sta mettendo a fuoco una stellina dell euro,

vedi come ha fatto tanti piani e quando poi li rimetti insieme

hai la tridimensionalità del mio campione, quindi il

confocale ha questa capacità grz ank a questo laser che

continua a fare fotografie ( si sente ank il rumore mentre fa

le foto), premde i singoli pezzi del nostro campione, rispetto

al microscopio a fluorescenza oltre al fatto che fa una

tridimensionalità riesce ad eliminare alcune sbrodolature

che il microscopio a fluorescenza non è così sofisticato

nelle immagini come il confocale.

Page 52 Ci sono alcune fotografie che con la fluorescenza

tradizionale non riusciamo a mettere a fuoco, menrre con

un confocale che fa tutti i piani di un campione si. Se

abbiamo un campione che ha una certa tridimensionalità,

con il confocale lo vediamo bene, mentre con quello a

fluorescenza lo vediamo sfocato, quindi dovremmo

continuare con l obiettivo ad andare su e giù fino a quando

riusciamo a prendere il fuoco, la cioè la risoluzione, di tutto

il nostro campione.

Page 53 Questo è un microscopio che costa un sacco di soldi e sono

talmente sofisticsti che esiste un tecnico che li può usare,

non li può utilizzare un ricercatore a caso.

Tem è la sigla di trasmission elettron microscopy, ma tutti

lo chiamano come tem e poi c'è un altro microscopio

chiamato sem. È una struttura molto particolare che ha

come struttura base il fatto che non viene utilizzata la luce

ma vengono utilizzati degli elettroni

Infatti il nostro campione che può essere molto sottile è all

interno di una camera vuota. Abbiamo una fotografia di un

campione dal punto di vista della sua atomicità. Ci sono

questi elettroni che attraversano il nostro campione, che

deve essere molto sottile risp a un campione per il

microscopio confocale, che sennonon vedremmo

assolutamente nulla.

Page 54 Quello che succede è che abbiamo un fascio di elettroni che