Tesi Legionella - Riscontro epidemiologico del batterio legionella

Indice

• Introduzione
• Che cosa è la Legionella?
• Dove cresce il microrganismo?
• Contaminazione negli impianti
• Bonifica della Legionella nei vari impianti idrici e la normativa vigente negli ambienti di lavoro
• Storia del genere Legionella
• Legionella spp. descrizione di alcuni ceppi conosciuti
• Malattie provocate dalla Legionella e sintomi della Legionellosi
• Legionella, batterio Gram-negativo
• Patogenesi molecolare delle infezioni causate da Legionella pneumophila
• Meccanismo di azione della L. pneumophila nelle cellule eucariotiche
• La formazione del biofilm, nido di replicazione della Legionella
• La Legionella al giorno d'oggi, monitoraggio epidemiologico e tecnico
• Epidemiologia e sorveglianza nel tempo dei casi di Legionella nel territorio nazionale italiano
• Scopo del lavoro
• Normativa vigente del Laboratorio
• Apparecchiature usate
• Terreni di coltura e reagenti usati
• Procedura
• Incubazione e identificazione
• Risultati
• Differenze tra acquedotti e pozzi
• Strutture ricettive
• Istituti riabilitativi
• RSA, RSD, asili
• Luoghi di lavoro
• Condomini
• Comuni
• Cooperative sociali
• Conclusioni
• Bibliografia

Scopo del lavoro

L'obiettivo della ricerca è identificare e analizzare la presenza di Legionella pneumophila in acque del territorio aretino, evidenziando le tipologie di strutture che hanno evidenziato valori positivi, per comprenderne le possibili cause e i motivi della diffusione. È stata condotta un'analisi epidemiologica nell'anno 2024, fornendo un'indagine atta alla prevenzione, eradicazione e per contribuire al miglioramento della sicurezza di strutture, per la salute pubblica.

Normativa vigente del laboratorio

Per effettuare le analisi di laboratorio si eseguono le metodiche UNI EN ISO 11731:2017.

Apparecchiature usate

• Rampa filtrante con pompa a vuoto; necessita di un'accurata sterilizzazione mediante fiamma ossidrica, viene utilizzata per permettere la filtrazione dei campioni di acqua su filtri di carta.
• Pompa da vuoto regolata ad una pressione di circa 500-550 mm Hg; viene collegata attraverso un tubo di gomma alla rampa di filtrazione per generare un gradiente di pressione per permettere il movimento dei fluidi deposti all'interno dei vari bicchieri.
• Membrane filtranti di policarbonato o PES sterili aventi pori di diametro 0.22 micrometri, da utilizzare quando la membrana su cui il campione è filtrato è sottoposta a lavaggio.
• Vortex; dispositivo elettronico che attraverso un gommino in ripetuta vibrazione (intensità regolabile) permette di staccare il particellato (deposizione in acqua sterile) presente nei filtri precedentemente raccolti dalla rampa di filtrazione.
• Bagno termostatico regolabile a 50 ±1 °C; viene usato per mantenere i terreni di coltura allo stato liquido, per prevenire la loro solidificazione a temperatura ambiente.
• Incubatore termostato regolabile alla temperatura di 37 ±1 °C; in pratica delle piccole camere termostatiche, regolate a temperatura costante, permette la crescita ottimale dei vari microrganismi attesi nelle analisi.
• Autoclave; apparecchiatura sigillata e chiusa, viene usata per mantenere al suo interno una combinazione di pressione e temperature elevate, con lo scopo di sterilizzare strumenti, materiali e liquidi contenuti nei recipienti (bottiglie di vetro).
• Cappa sterile; detta anche cappa a flusso laminare, è un piccolo ambiente di lavoro privo di contaminanti grazie alla filtrazione dell'aria.
• Barattoli di vetro o polistirene; recipienti di vetro sterilizzati all'interno dell'autoclave, servono per contenere i terreni allo stato solido-liquido, acqua sterile o talvolta, campioni di analisi.
• Micropipette 100-1000 µL e relativi puntali sterili, pipette sterili; strumentazione in vetro usate per prelevare piccole aliquote di campioni preservandone l'asetticità.
• Spatole ad “L” monouso sterili; piccole anse di plastica, monouso e sterili, usate per spatolare campioni di legionella sui terreni di coltura specifici.
• Pipette graduate 2-10 mL sterili o monouso sterili; strumenti di vetro usa e getta, spesso usate per il trasporto di acqua sterile tra i vari recipienti di vetro o per il prelevamento di campioni di acqua.
• pH metro; apparecchiatura elettronica per il controllo e la misurazione del pH di liquidi vari.

Terreni di coltura e reagenti usati

BCYE AGAR: Terreno in piastre pronto all'uso, riportata nell'etichetta della confezione.

NUTRIENT AGAR (NUT): Sciogliere 8 g di Lab-Lemco Broth (CM0015) in 1 litro di acqua distillata aggiungendo anche 5 g di Sodium Chloride (LP 0005), 15 g Agar Bacteriological (LP0011). Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15’, distribuire in piastre petri in ragione di 15 ml ciascuna. Stoccare in frigorifero.

GVPC AGAR: Terreno in piastre pronto all'uso, riportata nell'etichetta della confezione.

ACIDO CLORIDRICO: 20 ml di acido concentrato (densità 1.16 e concentrazione minima 31.5%) in 1 L di acqua sterile distillata. Preparata al momento dell'utilizzo (Corrosivo e irritante).

CLORURO DI POTASSIO: 14.9 g di polvere in 1 L di acqua distillata. Preparata al momento dell'utilizzo.

SOLUZIONE ACIDA: Miscelare 3.9 ml di soluzione A in 25 ml di soluzione B. Portare il pH 2.2 ± 0.2 con soluzione di idrossido di potassio. Preparata al momento dell'utilizzo. (Corrosivo e irritante).

TEST AL LATTICE: Test pronto all'uso, riportata nell'etichetta della confezione.

Procedura

La procedura qui descritta si esegue nel caso di campioni di acqua potabile provenienti da strutture che applicano le misure di prevenzione indicate nelle linee guida e per le quali quindi ci si aspetta una concentrazione di Legionella non molto elevata. Essa si applica inoltre quando non è ben nota, o comunque non è possibile prevedere, la possibile concentrazione di Legionella nel campione di acqua potabile, oppure nel caso in cui la struttura oggetti di campionamento abbia effettuato dei trattamenti di bonifica nei confronti di Legionella pneumophila.

Il campione d'acqua deve essere ben agitato manualmente per staccare le legionelle che aderiscono alle pareti del contenitore, soprattutto se questo è di plastica. Il campione d'acqua viene poi filtrato attraverso membrane sterili di policarbonato o PSE con porosità pari a 0,22 µm poste su apparati filtranti. La filtrazione avviene attraverso una pompa da vuoto, esercitando preferibilmente una pressione di circa 500-550 mm Hg. Al termine della filtrazione la membrana viene prelevata con pinzette sterili e posta in un contenitore di vetro o plastica monouso sterile di capacità adeguata e richiudibile. Si aggiungono 10 ml di diluente o acqua sterile. Si procede poi ad una agitazione vigorosa per 2 minuti con il vortex, ottenendo così il campione concentrato.

Si suddivide il campione in tre aliquote: Un'aliquota non subisce trattamenti, una viene trattata con il calore (3 mL in provetta sterile) e una con soluzione acida (3 mL in provetta sterile). Per quanto riguarda il trattamento al calore l'aliquota di campione concentrato è mantenuta a 50±1 °C per 30±2 minuti. Per quanto riguarda il trattamento all'acido, l'aliquota di 3 mL viene diluita con 27 mL di soluzione acida, mescolata bene e lasciata agire per (5±0.5) minuti. Vengono quindi inoculati 0.1 mL del campione concentrato (non trattato, trattato con calore e trattato con acido) su terreno di coltura selettivo per Legionella BCYE AGAR e GVPC AGAR e si procede a spatolare (semina per spatolamento).

Qualora si preveda una contaminazione estremamente bassa di Legionella è opportuno effettuare meno diluizione possibile per garantire un maggior recupero; pertanto tendenzialmente si seminano 0.5 mL del concentrato, ottenuto mediante sospensione della membrana in 5 mL di acqua sterile.

Incubazione e identificazione

Viene effettuata l'incubazione a 36±2 °C per 10 giorni. Si posizionano le piastre all'interno di una giara (contenitore con chiusura a clip, in vetro borosilicato) per prevenire la disseccazione del terreno di coltura. Si controlla la crescita nelle piastre dopo 4 giorni di incubazione, in modo tale da valutare eccessiva crescita di colonie e registrare il valore di lettura nel foglio di lavoro; per il risultato finale si devono attendere comunque 10 giorni di incubazione, al termine dei quali si effettua la lettura definitiva registrandola nel foglio di lavoro.

Qualora dopo 4 giorni vi sia crescita batterica eccessiva nelle piastre, e quindi le colonie presenti non risultino contabili, si effettueranno diluizioni sul concentrato o sul campione (stoccati in frigorifero per non più di 4 giorni a partire dalla data di campionamento); oppure in alternativa sarà ripetuta l'analisi dell'acqua, che sarà nuovamente campionata, apportando opportune diluizioni.

Le colonie di Legionella si possono presentare in vario modo, ed in generale sono bianche grigie. Le colonie inoltre appaiono lisce, con margini netti e aspetto a vetro smerigliato. Alla lampada ultravioletta alcune specie di Legionella sviluppano fluorescenza bianco brillante (ad esempio Legionella anisa, Legionella bozzemanii, Legionella parisiensis). Legionella erythrae e Legionella rubrilucens alla lampada ultravioletta mostrano fluorescenza rossa, mentre Legionella pneumophila verde scuro con delle sfumature gialle. Non si devono esporre per un tempo eccessivo le colonie alla lampada ultravioletta poiché ciò potrebbe causare la morte dei batteri.

Nel caso di presenza di colonie di Legionella tipiche, per avere una discreta rappresentatività delle colonie presenti in un campione vengono analizzate 3 colonie per ogni piastra seminata, qualora nella suddetta piastra sia presente un solo tipo di colonia. Se invece, vi sono nella piastra colonie aventi differente morfologia, per ciascuna tipologia se ne semina una colonia; per avere conferma viene effettuato un isolamento, mediante la semina su BCYE AGAR e NUTRIENT AGAR (privo di cisteina). Si mettono a incubare le piastre a (36±2) °C per 2-5 giorni.

Si procederà quindi alla identificazione. Si potrà effettuare una valutazione quantitativa (unità formanti colonia/litro, UFC/l) in base al numero di colonie contate per piastra, al numero delle colonie confermate tra quelle sottoposte a conferma e al volume filtrato. Per determinare il numero di UFC di Legionella presenti nel campione, si deve considerare la piastra che presenta il maggior numero di colonie confermate. Se attraverso le procedure di analisi e identificazione si ottengono dati di quantificazione prima dei 10 giorni si possono comunicare al committente al fine di consentire le idonee misure di prevenzione e controllo a tutela della salute pubblica. Tali dati saranno indicati come “preliminari” e dovranno essere successivamente confermati.

La conferma avviene nel modo seguente. Le colonie di Legionella presenteranno crescita su BCYE AGAR e assenza di crescita su NUTRIENT AGAR, per l'incapacità di Legionella di moltiplicarsi in assenza di L-cisteina. L. oakdrigensis e L. spiritensis richiedono L-cisteina e ferro per l’isolamento primario, ma possono crescere debolmente anche in terreno privo di L-cisteina. Pertanto, deve essere accuratamente osservata la differenza di crescita nel terreno con e senza cisteina (semina per isolamento). Questa identificazione presuntiva deve essere confermata attraverso l'utilizzazione di reagenti specifici. Si effettua dunque il test di agglutinazione al lattice. I reagenti di agglutinazione per il sierogruppo Legionella pneumophila consistono di una sospensione tamponata di particelle di lattice rivestite con anticorpi purificati. Gli anticorpi sono specificamente indirizzati contro gli antigeni di superficie del sierogruppo L. pneumophila. Quando una goccia di una sospensione di colonie sospette di Legionella è miscelata con una goccia di reagente al lattice e l'organismo in questione è uno dei sierogruppi di L. pneumophila, essa si legherà al lattice sensibilizzato anti-Legionella specifico. La miscela determinerà un'agglutinazione visibile e l'aggregato risultante viene graduato ad occhio nudo.

Procedimento

• Portare i reagenti a temperatura ambiente;
• Agitare bene i reagenti;
• Dispensare una goccia di tampone all’interno dei 4 cerchi presenti sul cartoncino di reazione;
• Dispensare nei quattro cerchi i reagenti, ovvero in un cerchio il reagente di controllo, nel secondo il reagente per l’identificazione di Legionella spp., nel terzo il reagente per Legionella pneumophila sier. 1 e nell’ultimo il reagente per l’identificazione di Legionella sier. 2-15. Assicurando che in questa fase il lattice ed il tampone non vadano a contatto tra di loro;
• Con ansa sterile si preleva una colonia di almeno 1 mm di diametro (se colonie sono più piccole prelevarne due o più) ed emulsionarla accuratamente con la soluzione tampone in modo tale da ottenere una soluzione omogenea. Ripetere la procedura per ciascuno dei reagenti;
• Mescolare i reagenti al lattice con la sospensione, spandendo la miscela sull’intera area di reazione. Per ciascun reagente utilizzare una nuova ansa;
• Roteare il cartoncino di reazione e osservare l’eventuale comparsa di agglutinazione, che deve apparire dopo massimo 1 minuto;

Interpretazione del test

• Risultato positivo: agglutinazione e quindi comparsa di granuli blu nel cerchio di reazione in cui è presente reagente per Legionella pneumophila sier. 1 o sier. 2-15 e assenza di agglutinazione nel cerchio dove è presente il reagente di controllo. Qualora si vengano a creare formazioni fibrose-viscose o granulose anomale considerare la reazione positiva qualora il colore blu di fondo del reagente presenti una marcata limpidezza.
• Risultato negativo: non si verifica agglutinazione nel cerchio di reazione in cui è presente reagente per Legionella pneumophila sier. 1 o sier. 2-15 e assenza di agglutinazione nel cerchio dove è presente il reagente di controllo. Qualora si vengano a creare formazioni fibrose-viscose o granulose anomale considerare la reazione negativa qualora il colore blu di fondo del reagente non presenti una marcata limpidezza.
• Risultato non interpretabile: se si verifica agglutinazione nel reagente di controllo, il ceppo in questione è auto agglutinante e quindi il risultato non è interpretabile. Inoltre, il risultato non è interpretabile qualora si verifichi agglutinazione sia nel cerchio con reagente per Legionella pneumophila sier. 1 e per sier. 2-15, poiché è possibile che si sia verificata una reazione crociata tra Legionella pneumophila sier. 1 e sier. 2-15.

Figura 12: Nel cerchio 4 si osserva agglutinazione, segno che il test è positivo. Nel cerchio 5 invece il test è negativo.

Il numero delle unità formanti colonia di Legionella presenti in 1 litro (UFC/1000 mL) viene calcolato in base al numero delle colonie contate sulla piastra considerata, al numero delle colonie confermate tra quelle sottoposte a conferma, alla diluizione eventualmente effettuata sul campione e al fattore di concentrazione secondo la seguente formula:

× = × ×

dove:
Cs = numero di Legionella pneumophila UFC/l;
a = (numero di colonie confermate / numero totale di colonie testate) x conta totale;
V =volume di liquido concentrato in mL;
cV = volume di campione inoculato nelle piastre in mL;
Vtot = volume di riferimento scelto per l’espressione della concentrazione dei microrganismi nel campione, espresso in millilitri;

Figura 13: Esempio di piastra risultata positiva alla legionella (terreno BCYE-AGAR) si possono notare tutte le colonie formate con una colorazione tra il giallo e il bianco.

Figura 14: Esempio di piastra risultata positiva alla legionella (terreno GVPC-AGAR) qui invece la colorazione delle colonie formatosi è tendente al bianco/grigio bluastro.

Risultati

Nel corso del 2024 è stato condotto uno screening approfondito sulla presenza della Legionella pneumophila in campioni di acqua raccolti da un ampio spettro di strutture situate nel territorio aretino. L’indagine ha coinvolto diverse tipologie di ambienti, tra cui:

• Strutture ricettive (tra cui piscine e palestre)
• Istituti riabilitativi
• RSA, RSD, asili
• Luoghi di lavoro, come aziende pubbliche e/o private
• Condomini
• Comuni
• Cooperative sociali

I campioni sono stati distinti in base alla fonte di provenienza (se acqua di acquedotto o di pozzo) e alla temperatura di prelievo dell’acqua (calda o fredda), al fine di comprendere al meglio le caratteristiche ambientali che possono influenzare la presenza e la proliferazione del batterio. Questa