Strategie di monitoraggio e controllo di Brettanomyces bruxellensis in uve, mosti e vini

Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-ambientali

Corso di Laurea Magistrale in Produzioni Agroalimentari e Gestione degli Agroecosistemi

TESI DI LAUREA MAGISTRALE

Strategie di monitoraggio e controllo di Brettanomyces bruxellensis in

uve, mosti e vini

CANDIDATO:

Alessio Carnemolla RELATORE:

Prof.ssa Annita Toffanin

CORRELATORE:

Prof. Fabio Mencarelli

ANNO ACCADEMICO 2021-2022

Dedicato a Romeo, Masha e Mina.

Sommario

I. RIASSUNTO ................................................................................................................. 3

1. INTRODUZIONE .................................................................................................... 5

1.1 I difetti organolettici nei vini ............................................................................................. 8

1.1.1 I fenoli volatili e le deviazioni organolettiche di tipo “fenolico” ................................................... 10

1.1.2 I meccanismi enzimatici di formazione dei fenoli volatili nei vini ................................................. 12

1.2 Brettanomyces/Dekkera spp. .......................................................................................... 15

1.2.1 Storia ................................................................................................................................................ 15

1.2.2 Tassonomia ...................................................................................................................................... 16

1.2.3 Morfologia ....................................................................................................................................... 16

1.2.4 Fisiologia .......................................................................................................................................... 17

1.2.5 Fattori che ne influenzano lo sviluppo ........................................................................................... 17

1.2.6 B. bruxellensis: influenza sulle caratteristiche organolettiche ...................................................... 20

1.2.6.1 Fenoli volatili ................................................................................................................................. 21

1.2.6.2 Acido acetico ................................................................................................................................. 21

1.2.6.3 Acidi grassi volatili ......................................................................................................................... 22

1.2.6.4 Ammine biogene ........................................................................................................................... 22

1.2.6.5 Tetraidropiridine ............................................................................................................................ 22

1.2.7 B. bruxellensis: dispersione geografica e persistenza in cantina ................................................... 23

1.2.8 B. bruxellensis: vitalità e coltivabilità ............................................................................................. 25

1.3 Tecniche microbiologiche per la ricerca di Brettanomyces spp. ........................................ 26

1.3.1 Tecniche coltura-dipendenti ........................................................................................................... 27

1.3.2 Tecniche coltura-indipendenti ........................................................................................................ 27

1.4 Strategie di controllo dello sviluppo di Brettanomyces spp. ............................................. 30

1.4.1 Impiego di anidride solforosa ......................................................................................................... 30

1.4.2 Impiego di ozono ............................................................................................................................. 31

1.4.3 Impiego di chitosano ....................................................................................................................... 32

1.4.4 Filtrazione ........................................................................................................................................ 33

1.5 Il Progetto G.R.A.P.E. ...................................................................................................... 34

1.5.1 I Partner del Progetto G.R.A.P.E. .................................................................................................... 36

1.5.2 Gli obiettivi del Progetto G.R.A.P.E. ............................................................................................... 38

1.5 Scopo dell’elaborato ....................................................................................................... 39

2. MATERIALI E METODI ......................................................................................... 39

2.1 Aziende vitivinicole .................................................................................................. 39

2.2 Piano sperimentale .................................................................................................. 41

2.2.1 Vigneti ......................................................................................................................................... 41

2.2.2 Mosti in fermentazione ............................................................................................................... 42

2.2.3 Vini in affinamento ...................................................................................................................... 43

2.3 Metodo di analisi statistica ....................................................................................... 44

2.4 Monitoraggio dei vigneti .......................................................................................... 45

2.4.1 Vigneti e varietà ......................................................................................................................... 45

2.4.2 Campionamento delle uve ......................................................................................................... 45

2.4.3 Determinazione del pH .............................................................................................................. 47

2.4.4 Determinazione dell’acidità totale ............................................................................................ 48

2.4.5 Determinazione del glucosio e fruttosio ................................................................................... 51

2.4.6 Determinazione dell’acido L-malico .......................................................................................... 53

1

2.4.7 Concentrazione di B. bruxellensis in uve pressate tramite Real-Time PCR (qPCR) .................. 54

2.5 Interventi di contenimento e contrasto allo sviluppo di B. bruxellensis ...................... 56

2.5.1 Vigneti ........................................................................................................................................ 56

2.5.2 Attrezzature e superfici di cantina ............................................................................................. 60

2.5.3 Vini in affinamento .................................................................................................................... 61

2.6 Monitoraggio dei mosti in fermentazione e dei vini in affinamento ........................... 62

2.6.1 Campionamento dei mosti/vini in serbatoio di acciaio inox .................................................... 62

2.6.2 Campionamento dei vini in barriques e tonneaux .................................................................... 63

2.6.3 Determinazione dell’azoto prontamente assimilabile (APA) ................................................... 63

2.6.4 Determinazione del pH .............................................................................................................. 65

2.6.5 Determinazione dell’acidità totale ............................................................................................ 65

2.6.6 Determinazione del glucosio e fruttosio ................................................................................... 65

2.6.7 Determinazione del titolo alcolometrico volumico effettivo ................................................... 65

2.6.8 Determinazione dell’acido malico ............................................................................................. 66

2.6.9 Determinazione dell’acido lattico .............................................................................................. 66

2.6.10 Determinazione dell’acidità volatile .......................................................................................... 68

2.6.11 Determinazione dell’anidride solforosa libera e dell’anidride solforosa totale ...................... 69

2.6.12 Concentrazione dei fenoli volatili tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (UHPLC-

FLD) 70

2.6.13 Concentrazione di B. bruxellensis nei mosti e nei vini tramite Real-Time PCR (qPCR) ............ 74

3. RISULTATI E DISCUSSIONE .................................................................................. 75

3.1 Caratterizzazione chimica delle uve .......................................................................... 75

3.2 Quantificazione di B. bruxellensis nel vigneto ............................................................ 82

3.3 Caratterizzazione chimica dei mosti in fermentazione e quantificazione di B.

bruxellensis .......................................................................................................................... 83

3.4 Quantificazione di B. bruxellensis e dei fenoli volatili nei vini in affinamento ............. 96

4. CONCLUSIONI ................................................................................................... 101

5. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA ............................................................................ 103

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I. RIASSUNTO

Il vino rappresenta la terza bevanda alcolica più bevuta al mondo, con un mercato

fortemente in espansione per l’Italia, attualmente il primo produttore mondiale. Il processo

produttivo, definito vinificazione, comprende processi biochimici dovuti alla fermentazione

alcolica e malolattica in cui i microrganismi coinvolti esercitano un ruolo determinante nelle

caratteristiche organolettiche del prodotto finale. Numerose specie microbiche possono

influenzare negativamente le caratteristiche organolettiche dei vini e spesso, la presenza di

difetti olfattivi di varia natura, comporta un deprezzamento e un declassamento che può

causare una notevole perdita economica da parte del produttore. Tra i microrganismi più

temuti da parte degli enologi vi è il lievito Brettanomyces bruxellensis, riconosciuto da molti

autori come parte del microbiota presente sull’uva, sulle attrezzature di cantina, sui serbatoi

di vinificazione e nel vino. La sua presenza è comunemente associata allo sviluppo di alcuni

metaboliti che possono influenzare negativamente il profilo sensoriale del vino. Tra i

composti più dannosi prodotti dal lievito vi sono i fenoli volatili, rispettivamente il 4-

etilfenolo e il 4-etilguaiacolo, che conferiscono i caratteristici sentori di sudore di cavallo, di

stalla, di farmaceutico e affumicato. B. bruxellensis risulta difficile da isolare e da individuare

con le tradizionali metodiche analitiche a causa della limitata velocità di crescita e della bassa

concentrazione, oltre a una condizione di scarsa coltivabilità (Viable But Not Culturable). Tale

limitazione può essere superata adottando metodi coltura-indipendenti basati sulle tecniche

di analisi molecolari quali la Polymerase Chain Reaction (PCR), in grado di fornire risultati

accurati in tempi molto brevi. L’individuazione tempestiva della presenza di B. bruxellensis

lungo le varie fasi della filiera produttiva è di fondamentale importanza al fine di

intraprendere le opportune azioni correttive. Tuttavia, visti gli elevati costi di investimento

dei monitoraggi analitici, è necessario che tali azioni siano opportunamente ragionate e

messe in pratica dai produttori o dagli enologi valutando i punti critici della filiera produttiva.

In tale contesto, con il Progetto Sottomisura 16.2 relativo al PSR 2014-2020 della Regione

Toscana è stata proposta un’attività di monitoraggio e contrasto allo sviluppo di B.

bruxellensis a partire dal vigneto fino al vino in affinamento, prendendo in considerazione

quattro aziende vitivinicole della Maremma grossetana. Attraverso l’individuazione delle

corrette strategie di prevenzione e valutando l’efficacia di alcune pratiche correttive nei

confronti della presenza di B. bruxellensis, l’obiettivo del presente lavoro è quello di fornire

indicazioni pratiche ai produttori su quali sono le fasi più determinanti in cui svolgere le

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attività di monitoraggio e di contrasto allo sviluppo del lievito, in modo da ottimizzare i costi

e garantire la massima qualità dei vini prodotti.

Dalla valutazione dei risultati è emerso che il monitoraggio analitico di B. bruxellensis tramite

qPCR e la verifica della presenza dei rispettivi marcatori chimici 4-etilfenolo e 4-etilguaiacolo

a partire dalla svinatura dei mosti rappresentano il migliore strumento a disposizione dei

tecnici e dei produttori. La sanificazione delle attrezzature e dei serbatoi di cantina tramite

acqua ozonizzata sembrerebbe avere un effetto positivo nei mosti in fermentazione. Nel

corso dell’affinamento la sanificazione dei serbatoi in legno ha avuto degli effetti

disomogenei e discontinui. In alcuni casi, lo sviluppo di B. bruxellensis è stato contrastato

solo attraverso il corretto utilizzo del chitosano e dei travasi.

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1. INTRODUZIONE

Il vino rappresenta la terza bevanda alcolica più bevuta al mondo (Fonte UIV, 2017), dopo la

birra e i superalcolici. Secondo il report 2022 presentato dall’International Organization of

Vine and Wine (OIV) la produzione mondiale di vino nel 2021 ha raggiunto la soglia di 260

milioni di ettolitri, circa l’1% in meno rispetto al 2020. Rappresentando il 19% della

produzione di vino mondiale totale nel 2021, l’Italia si afferma nuovamente come il maggior

produttore, seguita da Francia e Spagna.

I dati relativi al 2020 evidenziano che i primi cinque Paesi per consumo di vino rappresentano

quasi la metà del totale mondiale: gli Stati Uniti detengono il primato con il 14 % del consumo

complessivo, seguiti da Francia, Italia, Germania e Regno Unito (Figura 1). La panoramica

europea ha inoltre indicato un consumo di 114 milioni di ettolitri nel 2021 (+3% rispetto al

2020). Figura 1: Suddivisione dei principali Paesi per consumo di vino nel 2020 (modificato da www.oiv.int)

In tale contesto il mercato del vino italiano ha subito uno sviluppo considerevole, scaturito

sia dai notevoli progressi tecnologici nel settore vitivinicolo che da una maggiore attenzione

dei produttori e dei consumatori verso prodotti tipici di elevata qualità. Nel corso degli anni

le politiche agricole europee hanno orientato la legislazione verso la tutela dei prodotti tipici

attraverso la Denominazione di Origine Protetta (D.O.P.) e l’Indicazione Geografica Protetta

(I.G.P), garantendone la qualità e la salubrità attraverso norme specifiche molto restrittive.

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Il fenomeno del riscaldamento globale ha ulteriormente influenzato gli Stati membri a

intervenire sulla normativa comunitaria affinché si ripensasse il concetto di produzione

agricola non sono in termini economici ma anche secondo i criteri di sostenibilità ambientale.

Il vino è un alimento edonistico nel quale l’apprezzamento e il consumo sono fortemente

influenzati dalle caratteristiche sensoriali (Piombino et al., 2021; Chironi et al., 2013; Vecchio

et al., 2019).

Con il termine bouquet viene indicato l’insieme delle sensazioni olfattive di un vino distinte

in tre gruppi di profumi classificati a seconda della loro origine:

• Primari o varietali: sostanze presenti nelle uve che conferiscono al vino l’impronta

aromatica del vitigno;

• Secondari o fermentativi: sostanze che si originano dal metabolismo dei lieviti e dei

batteri che conducono le fermentazioni alcolica e malolattica;

• Terziari o da affinamento: sostanze derivate da reazioni chimiche post-fermentative

che intervengono nel corso dell’evoluzione e dell’affinamento del vino.

Il flavour rappresenta l’insieme delle sensazioni percepite dai recettori situati nella cavità

orale e nasale comprendenti le sensazioni olfattive, ortonasali e retronasali, le sensazioni

gustative e le altre sensazioni orali di natura tattile e trigeminale (Piombino et al., 2021;

Prescott, 2012; Small & Prescott, 2005).

La percezione del flavour del vino è perciò condizionata dall’interazione dei diversi stimoli

sensoriali percepiti durante l’analisi organolettica o degustazione (Piombino et al., 2021;

Noble, 1996).

L’obiettivo comune del produttore, dell’agronomo e dell’enologo che seguono ogni tappa

del processo produttivo è il conseguimento di un vino di massima qualità. Per definire il

concetto di qualità di un alimento è necessario comprendere i meccanismi coinvolti nel

processo decisionale che influenzano il consumatore all’acquisto di un determinato prodotto

(Marin & Durham, 2007). Generalmente la valutazione della qualità si basa su un giudizio del

grado di eccellenza o superiorità (Zeithaml, 1988). Una semplice definizione è stata suggerita

da Émile Peynaud, celebre enologo e ricercatore francese considerato tra i padri

dell’enologia moderna: “la qualità di un vino è l’insieme delle sue caratteristiche, vale a dire

delle proprietà che lo rendono accettabile o desiderabile”.

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A garanzia della qualità dei prodotti vitivinicoli e al fine di tutelare i consumatori, la

legislazione europea ha introdotto una normativa specifica e complessa.

Il Regolamento (UE) n. 1308/2013 definisce l’organizzazione comune dei mercati dei prodotti

agricoli, mentre il Regolamento delegato (UE) 2019/33 stabilisce le regole per le

denominazioni di origine protette, le indicazioni geografiche e le menzioni tradizionali

nonché per l’etichettatura e la presentazione nel settore vitivinicolo.

Attualmente in Italia sono presenti 76 vini a Denominazione di Origine Controllata e