Ruolo del sistema endocannabinoide nei disturbi d'ansia: evidenze precliniche

Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di laurea in Scienze Biologiche

Laurea di primo livello

Ruolo del sistema endocannabinoide nei disturbi d’ansia: evidenze precliniche

Relatore: Dr.ssa Viviana Trezza

Candidata: Rossella Belardi

Matricola 282200

Anno Accademico 2012/2013

Introduzione

Il sistema endocannabinoide è costituito da molecole di natura lipidica, definite endocannabinoidi, dai loro recettori e dagli enzimi responsabili della loro biosintesi e degradazione. Gli endocannabinoidi devono il loro nome alla capacità di legare e attivare i recettori target del THC, principio attivo della marijuana. Questi lipidi sono sintetizzati dai neuroni e, a differenza della maggior parte dei neurotrasmettitori che sono immagazzinati in vescicole, attraversano la membrana cellulare per diffusione facilitata subito dopo la sintesi. I primi endocannabinoidi ad essere isolati dal tessuto cerebrale sono stati l’anandammide e il 2-arachidonilglicerolo (2-AG).

L’attività degli endocannabinoidi viene limitata da due eventi: la ricaptazione nel neurone mediante un trasportatore proteico e la degradazione enzimatica. L’enzima che degrada l’anandammide è l’idrolasi dell’ammide degli acidi grassi (FAAH); l’inattivazione del 2-AG è catalizzata dalla monoacilglicerolo-lipasi (MGL). I recettori cannabinoidi conosciuti sono i recettori CB1, abbondantemente espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC), e i recettori CB2, presenti sulle membrane dei leucociti e di alcuni neuroni nel cervello. La localizzazione dei recettori CB1 nel SNC interessa aree preposte all’attività cognitiva e al controllo emozionale.

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare il ruolo del sistema endocannabinoide nella regolazione degli stati d’ansia, esaminando i risultati di diversi studi preclinici condotti su roditori. In particolare, l’inattivazione farmacologica e genetica della degradazione di un endocannabinoide, l’anandammide, si è dimostrata efficace in diversi test comportamentali. Gli studi preclinici presentati in questa trattazione attestano l’efficacia ansiolitica dell’inibizione dell’idrolisi dell’anandammide ma, allo stesso tempo, non identificano l’inattivazione farmacologica come una terapia definitiva. L’attività dell’anandammide, difatti, è influenzata da numerosi fattori che devono essere considerati prima di poter giungere ad un nuovo farmaco per trattare i disturbi d’ansia.

Indice

• Capitolo 1: Il sistema endocannabinoide
  • 1.1 Cos’è il sistema endocannabinoide
  • 1.2 Regolazione della trasmissione gabaergica
  • 1.3 Regolazione della trasmissione glutammatergica
• Capitolo 2: Disturbi d’ansia
  • 2.1 Eziologia e sintomi
  • 2.2 Terapia farmacologica
    • 2.2.1 Effetti collaterali delle benzodiazepine
• Capitolo 3: Ruolo del sistema endocannabinoide nel controllo degli stati emozionali
  • 3.1 Il sistema endocannabinoide nello sviluppo del SNC e nel controllo delle emozioni: infanzia e adolescenza
  • 3.2 Effetti dell’esposizione ai cannabinoidi
• Capitolo 4: Test pre-clinici
  • 4.1 Scopi dello studio
    • 4.1.1 Materiali e metodi
  • 4.2 Risultati
    • 4.2.1 Effetti del trattamento con diazepam
    • 4.2.2 Effetti dell’inattivazione genica di FAAH
    • 4.2.3 Effetti dell’inibizione farmacologica di FAAH
  • 4.3 Gli endocannabinoidi nei disturbi d’ansia
    • 4.3.1 Influenza delle condizioni ambientali
    • 4.3.2 Effetto della dose e localizzazione dei recettori CB1
    • 4.3.3 Risposta tonica e risposta fasica
    • 4.3.4 Sensibilità
    • 4.3.5 Adattamento allo stress: equilibrio tra la neurotrasmissione GABAergica e quella glutammatergica
    • 4.3.6 Ruolo dei recettori CB2, TRPV1, serotoninergici e dei recettori per la colecistochinina
• Conclusioni
• Bibliografia

Capitolo 1: Il sistema endocannabinoide

1.1 Cos’è il sistema endocannabinoide

Il sistema endocannabinoide comprende molecole segnale di natura lipidica, definite endocannabinoidi, gli enzimi necessari per la loro biosintesi e per la loro degradazione, e i corrispondenti recettori bersaglio, distinti in due sottotipi: il sottotipo CB1 e il sottotipo CB2. I recettori CB1 sono espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) e i CB2 sono espressi nel Sistema Nervoso Periferico e nelle cellule del sistema immunitario. Alcuni recettori sono presenti anche in diverse cellule endoteliali e muscolari lisce (Piomelli, 2003).

A livello del SNC, il sistema endocannabinoide è coinvolto nella regolazione delle funzioni cognitive, motorie e nel controllo emozionale: per questo motivo è oggetto di studio, in quanto la comprensione del suo funzionamento potrebbe essere utile nel trattamento terapeutico di alcune patologie.

Il tetraidrocannabinolo (THC) [Fig.1] è il principio attivo della Cannabis, pianta impiegata in Europa da diversi secoli nel settore tessile e, tuttavia, nota agli studiosi europei per le sue proprietà psicotrope solo a partire dal XIX secolo. I suoi effetti sono multipli e contrastanti: euforia, irascibilità, pigrizia. (Piomelli, 2003).

Questo cannabinoide è anche noto per le sue proprietà analgesiche, anti-emetiche e stimolanti l’appetito. Per questo motivo gli unici usi terapeutici consentiti dalla Food and Drug Administration sono come antidolorifico nei pazienti malati di cancro e in quelli affetti da sclerosi multipla, e come farmaco nel trattamento dell’anoressia nei pazienti malati di AIDS (Laviola et al., 2011).

[Fig. 1 Struttura chimica del THC e di agonisti e antagonisti cannabinoidi di sintesi (Immagine tratta da Piomelli, 2003)]

I molteplici effetti di questo cannabinoide sono il risultato di una trasduzione del segnale mediata dal legame del THC a recettori transmembrana, presenti in neuroni di alcune aree cerebrali. Il primo sottotipo recettoriale, CB1, fu clonato nel 1990 (Matsuda et al., 1990) mentre il sottotipo CB2 fu identificato tre anni più tardi. A queste scoperte seguì l’isolamento di alcuni composti THC-simili, cannabinoidi endogeni sintetizzati nel cervello e denominati endocannabinoidi proprio per la loro capacità di legare i recettori target del THC [Fig.2].

[Fig.2 Struttura chimica degli endocannabinoidi (Immagine tratta da Piomelli, 2003)]

A differenza della maggior parte dei neurotrasmettitori, gli endocannabinoidi sono molecole lipidiche che non vengono rilasciate dai neuroni per esocitosi di vescicole, in quanto attraversano il plasmalemma per diffusione facilitata. Questo tipo di trasporto non richiede energia ma dipende dalla presenza di un carrier proteico specifico per il ligando che, in seguito ad un cambiamento conformazionale, consente il passaggio di queste molecole idrofobiche attraverso la membrana cellulare.

Il primo endocannabinoide ad essere isolato è stato l’ammide dell’acido arachidonico ed etanolammina, noto come anandammide (AEA), seguito dall’arachidonil-glicerolo (2-AG) e da altri composti, come la virodamina e la noladina (Sugiura T. et al.,1995).

La sintesi dell’anandammide è catalizzata da due enzimi: l’N-aciltrasferasi (NAT) e la fosfolipasi D (PLD). Il primo enzima trasferisce la catena di acido arachidonico da un lipide di membrana, la fosfatidilcolina, ad un altro fosfolipide, la fosfatidiletanolammina, formando l’intermedio N-arachidonyl-PE. Quest’ultimo è idrolizzato dall’enzima PLD ad acido fosfatidico (un estere di due acidi grassi e glicerolo in cui l’alcol è legato ad un gruppo fosfato) e anandammide [Fig.3] (Piomelli, 2003).

[Fig.3 Biosintesi dell’anandammide (Immagine tratta da Piomelli, 2003)]

La biosintesi dell’anandammide è Ca⁺⁺ dipendente: infatti l’enzima acil-trasferasi è inattivo in assenza di Ca⁺⁺ e la sua azione catalitica è incrementata dalla fosforilazione mediata da una proteinchinasi A, a sua volta attivata da un secondo messaggero, l’AMP ciclico (Piomelli, 2003).

L’anandammide può essere prodotta dal neurone anche con un meccanismo indipendente dal Ca⁺⁺, a seguito dell’attivazione di alcuni recettori metabotropici, come quello legante la dopamina. Probabilmente l’attivazione di alcune fosfolipasi causa l’induzione della biosintesi (Piomelli, 2003).

Un altro endocannabinoide oggetto di studio è il 2-AG, un monoacilglicerolo che, a differenza dell’N-arachidonil-PE, è presente in elevate concentrazioni nel cervello poiché rappresenta sia il precursore di alcuni lipidi sia il prodotto finale di differenti vie metaboliche. Il 2-AG può essere prodotto tramite due vie biosintetiche. La prima è catalizzata dall’enzima fosfolipasi C (PLC), che idrolizza il fosfatidil-inositolo a 1,2-diacilglicerolo; quest’ultimo è poi convertito da una diacilglicerolo lipasi (DGL) a 2-AG [Fig.4] (Piomelli, 2003).

La seconda via metabolica coinvolge un altro tipo di fosfolipasi che trasforma il fosfatidil-inositolo in un intermedio, un arachidonil-lisofosfolipide, poi idrolizzato dalla Lyso-fosfolipasi C ad arachidonil-glicerolo [Fig.4] (Piomelli, 2003). La sintesi di questo monoacil-glicerolo si attiva in seguito ad un incremento intracellulare dei livelli di Ca⁺⁺ (Piomelli, 2003).

[Fig. 4 Vie biosintetiche del 2-AG (Immagine tratta da Piomelli, 2003)]

Il segnale trasdotto dagli endocannabinoidi cessa in seguito alla loro ricaptazione nel neurone, seguita da inattivazione enzimatica. La degradazione enzimatica dell’anandammide è catalizzata dall’idrolasi dell’ammide degli acidi grassi (FAAH), una serin-idrolasi legata alla membrana, che idrolizza l’anandammide ad etanolammina e acido arachidonico. Si ipotizza che il trasporto e la degradazione siano due meccanismi correlati tra loro nel caso dell’anandammide, dato che la somministrazione di inibitori dell’enzima FAAH impedisce la ricaptazione dell’anandammide (Piomelli, 2003).

Il 2-AG viene idrolizzato ad acido grasso e glicerolo dall’enzima monoacil-glicerolo lipasi (MGL) (Piomelli, 2003).

I recettori degli endocannabinoidi sono metabotropici, accoppiati a proteine G inibitorie sull’enzima adenilato ciclasi (G_i). Essi sono caratterizzati da un dominio N-terminale extracellulare, responsabile del legame con la molecola bersaglio, da sette domini ad alfa-elica transmembrana e da un dominio C-terminale citosolico, legato con interazioni deboli, non covalenti, alla proteina G (Cella et al., 2010).

Quest’ultima è costituita da un trimero di subunità (α,β,γ) con attività GTP-asica. Quando il recettore non lega l’endocannabinoide, la subunità α è legata al GDP (Cella et al., 2010). Nel momento in cui il recettore lega l’endocannabinoide, esso subisce un cambiamento conformazionale che ne aumenta l’affinità per il trimero mentre il GDP è sostituito dal GTP. La subunità α-GTP si separa dal dimero βγ, quale forma attiva della proteina G, che può interagire con proteine bersaglio: canali ionici ed enzimi (Cella et al., 2010).

Il legame degli endocannabinoidi ai recettori cannabinoidi genera la chiusura dei canali per il Ca⁺⁺, l’apertura di quelli per il K⁺, l’inibizione dell’adenilato ciclasi e la stimolazione di protein-chinasi (Piomelli, 2003).

Nel cervello i recettori CB1 sono altamente espressi su neuroni GABAergici e glutammatergici; il segnale trasdotto dopo la loro attivazione determina l’inibizione del rilascio dei neurotrasmettitori GABA e glutammato, perciò gli endocannabinoidi possono essere definiti “modulatori dell’attività sinaptica”. Essi agiscono legandosi a recettori cannabinoidi localizzati a livello presinaptico (Piomelli, 2003).

1.2 Regolazione della trasmissione GABAergica

La plasticità sinaptica consiste nella modificazione dell’attività dei neuroni a livello delle sinapsi. Tale modulazione può realizzarsi a livello presinaptico o postsinaptico. Nella modulazione presinaptica un neurone modulatore rilascia, su un neurone presinaptico, un neurotrasmettitore inibitorio o eccitatorio che origina, rispettivamente, un potenziale sinaptico inibitorio o eccitatorio. Quello inibitorio, attraverso l’iperpolarizzazione nella cellula presinaptica, riduce il rilascio del neurotrasmettitore dal terminale presinaptico (inibizione presinaptica) (Silverthorn, 2010).

Il potenziale sinaptico eccitatorio causa l’effetto opposto tramite una depolarizzazione, che genera un potenziale d’azione (PdA) a cui seguono l’apertura dei canali per il Ca⁺⁺ e l’esocitosi delle vescicole contenenti il neurotrasmettitore (facilitazione presinaptica) (Silverthorn, 2010).

Come accennato nel paragrafo precedente, gli endocannabinoidi determinano un’inibizione presinaptica in neuroni sintetizzanti GABA e glutammato di alcune aree cerebrali, come l’ippocampo, l’amigdala, i gangli basali e il romboencefalo (Piomelli, 2003).

L’acido γ-amminobutirrico (GABA) è un neurotrasmettitore amminoacidico con funzione inibitoria. Un esempio di come gli endocannabinoidi modulino l’attività GABAergica nel SNC avviene a livello dell’ippocampo (Piomelli, 2003). L’ippocampo è coinvolto nella modulazione della memoria e nelle funzioni cognitive. I neuroni GABAergici che lo costituiscono possiedono recettori di tipo CB1 e sono quindi sensibili all’attività degli endocannabinoidi. Quando nelle cellule piramidali si aprono i canali per il Ca⁺⁺, la depolarizzazione di membrana che ne consegue porta ad un incremento della sintesi di 2-AG, che lega i corrispondenti recettori sui neuroni presinaptici producenti GABA. Tale interazione provoca l’apertura dei canali per il K⁺, l’iperpolarizzazione di membrana, che blocca l’esocitosi delle vescicole contenenti il GABA, riducendo l’effetto inibitorio dell’amminoacido sui neuroni piramidali [Figure 5 e 6] (Piomelli, 2003).

Questo fenomeno è noto come “soppressione dell’inibizione indotta da depolarizzazione” (DSI) nell’ippocampo, e sembra essere correlato alla regolazione dei processi cognitivi. Inoltre la DSI potrebbe indurre il potenziamento a lungo termine, caratterizzato dalla sintesi di nuove proteine (Piomelli, 2003).

A conferma del fatto che tale segnale retrogrado coinvolge un endocannabinoide, è stato dimostrato che, in topi privi di recettori CB1 o nei quali essi sono bloccati da un antagonista, l’inibizione presinaptica non avviene. Quest’ultima, invece, ha luogo in presenza di agonisti cannabinoidi e caratterizza quei neuroni che esprimono alti livelli di recettori CB1 (Piomelli, 2003).

[Fig.5 Regolazione presinaptica dell’attività dei canali ionici mediata dai recettori CB1 (Immagine tratta da Piomelli, 2003)]

L’amigdala è un’area cerebrale preposta alla regolazione delle emozioni ed è sotto l’influenza degli endocannabinoidi. Diversi risultati sperimentali lo dimostrano: topi con recettori CB1 inattivati in questa parte del cervello hanno un comportamento aggressivo ed ansioso; al contrario essi manifestano un fenotipo meno ansioso in seguito al trattamento con farmaci che inibiscono la degradazione dell’anandammide. Inoltre stimoli ansiogenici portano ad un aumento nella sintesi di anandammide e di 2-AG (Piomelli, 2003).

Studi pre-clinici hanno confermato il coinvolgimento del sistema endocannabinoide anche nel controllo del dolore: sono stati riscontrati aumenti nei livelli di anandammide in seguito a stimoli dolorosi, nonché l’inibizione presinaptica del rilascio di GABA a seguito dell’attivazione dei recettori CB1. Inoltre roditori a cui veniva iniettato un antagonista dei recettori CB1 mostravano iperalgesia (Piomelli, 2003).

1.3 Regolazione della trasmissione glutammatergica

Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nel SNC. Gli endocannabinoidi, con un meccanismo simile alla DSI, ma di effetto contrario, modulano l’attività presinaptica di neuroni glutammatergici: inibiscono cioè il rilascio di glutammato. Tale fenomeno è noto come “soppressione dell’eccitazione indotta da depolarizzazione” (DSE) [Fig.6]. Il risultato è una riduzione dell’eccitazione sui neuroni bersaglio da parte del glutammato (Piomelli, 2003).

[Fig.6 Eventi di trasduzione del segnale indotti dall’interazione endocannabinoide-recettore CB1 nell’inibizione del rilascio di GABA (a) e del glutammato (b). (Immagini tratte da Piomelli, 2003)]

Capitolo 2: Disturbi d’ansia

2.1 Eziologia e sintomi

L’ansia è un’emozione derivante da una condizione fisiologica non necessariamente patologica o dannosa: al contrario, essa costituisce una risposta dell’organismo all’ambiente circostante che gli consente di reagire a stimoli spesso avversi, migliorando le prestazioni e capacità nel risolvere una situazione. L’ansia diventa una patologia nel momento in cui la reazione dell’organismo è esagerata, con conseguente calo delle prestazioni.

I disturbi d’ansia sono classificati in diverse categorie in base alla durata, alla presenza di stimoli scatenanti e di caratteristiche tipiche di fenomeni psicopatologici (Torta et al., 2008). Essi sono distinti in: attacchi di panico con e senza agorafobia, agorafobia, fobie specifiche e fobia sociale, disturbo d’ansia generalizzato, disturbo ossessivo compulsivo, disturbo da stress acuto, disturbo da stress post-traumatico. L’attacco di panico, ad esempio, ha un’insorgenza ac...