Analisi della trascrittomica e tecniche di identificazione proteica

Per trascrittomica si intende l’insieme degli RNA messaggeri. È qualcosa che si modifica nel tempo. Le cellule dell’organismo hanno trascrittomi diversi. Esso serve a capire quello che sta accadendo.

Analisi dell'RNA messaggero

Nel momento in cui si analizza un certo RNA messaggero, si capisce come si esprimono i geni e l’attività che sta svolgendo la cellula.
Ottenuto l’RNA messaggero dal citoplasma lo si fa reagire con la trascrittasi inversa per formare una copia di cDNA. Utilizzando l’ibridazione si impiega una tecnica chiamata micro array a DNA, delle piastrine predisposte in cui è contenuto tutto il genoma dell’organismo; ogni frammento del genoma viene tagliato, in modo che ci sia tutto il gene è collocato in dei pozzetti con delle micro pipette (anche il DNA dei pozzetti è cDNA). Il cDNA ottenuto è fluorescente grazie al fosforo radioattivo, in modo che il cDNA vada ad ibridarsi indicando quali geni la cellula sta esprimendo in un certo momento. Il micro array permette in ogni momento di identificare il trascrittoma attivo in quel momento.

Separazione delle proteine

Una volta che la cellula è stata demolita con dei detergenti e del sale, tramite enzimi che eliminano gli acidi nucleici, rimangono solo le proteine. Con una centrifugazione le proteine idrofile galleggiano e i residui più densi (pellet) si depositano sul fondo. Le proteine si separano per l’elettroforesi. La caratteristica che differenzia le proteine dal campo elettrico dell’elettroforesi è che il DNA ha sempre una carica negativa, mentre le proteine non necessariamente. Bisogna rendere quindi le proteine isoelettriche; per farlo vengono dapprima denaturate per renderle rettilinee. Vengono quindi inglobate in un detergente (SDS) che ha una carica positiva e avvolge completamente la proteina. Vengono distinte le proteine in base alla lunghezza. A questo punto la tecnica che viene più impiegata è il Western Blotting.

Identificazione delle proteine

Con la denaturazione la catena si estende e l’SDS avvolge la proteina rendendola tutta quanta carica negativamente sull’esterno, in maniera che possa migrare in blocco verso un polo negativo. Si fa l’elettroforesi e alla fine si ottiene un distanziamento delle varie proteine presenti nel citoplasma.

A questo punto bisogna identificarle. Si utilizza un sistema, chiamato Western Blotting. C’è un filtro di microcellulosa e si usa l’elettroblotting. La migrazione avviene con l’elettricità, verso il polo positivo e la superficie di microcellulosa è aderente al polo positivo (è essa stessa carica positivamente) in modo che le proteine vi si leghino e rimangano lì. Come sonde si utilizzano anticorpi monoclonali, proteine fatte in modo specifico per reagire con determinati antigeni; in questo caso l’anticorpo riconosce la proteina che si sta cercando. Sono ottenuti tutti uguali tra di loro. Una volta che l’anticorpo ha identificato la proteina, ce n’è un secondo, anticorpo secondario, che reagisce con il primo tramite un enzima; si crea un colore. Un primo anticorpo si lega alla proteina ed un secondo permette con una colorazione di trovare dove è avvenuto il legame.