Mappe Appunti Tecnologie ricombinanti

Clonaggio molecolare e genoteche

Dentro genoteche cercare frammento individuare clone specifico particolari sonde DNA circolare vettore plasmidico chiuso vettore inserzione aperto tanti individui replicarsi ospite ogni 20 min E. Coli introduzione colonie batteriche in cellula vivente.

Tappe principali trasformazione serve per inserimento vettore selezione ospiti frammento DNA replicarsi molecola ricomb. originaria essere espresso amplificazione manipolazioni analisi molecola DNA clonaggio origine naturale molecolare vettore da RNA messaggeri frammenti modificata funzionalità specifiche DNA doppio filamento retrotrascrizione mRNA con frammento DNA esogeno ricombinante da retrotrascrizione cDNA cuciti insieme molecola chimerica clonazione genoteca cDNA dentro vettore inserimento in ospite genoteca genomica provenienza frammenti trascritta in RNA genoteca cDNA determinato momento parte espressa determinate condizioni DNA genomico frammenti isolati da organismo isolare DNA genomico frammentazione messo in vettore a DNA clonazione genoteca genomica E. Coli inserimento in ospite dentro i batteri collezione frammenti genoma originale framm. interesse cercare dentro collezione.

Ospiti e applicazioni

Eucariote crescita genetica ben nota terreni poco costosi non patogeno caratteristiche DNA esogeno prolifera lievito stabilità proteine mammiferi replicazione clone colonie indipendenti proteasi attive svantaggi manipolazione difficile semplicità prima trattati analisi elementi regolativi applicazioni specifiche breve tempo ospiti vantaggi varia origine tanto DNA esogeno accumulo plasmidi sistemi x modificazioni grande vantaggio espressione espressione proteine frammenti codificanti tempi lunghi difficili produrre produzione eucarioti procarioti (batteri) no espressione alta non folding corretto no clonaggio base applicazioni avanzate origine eucariotica no modifiche p.t. cellule costose proteine tossiche x batteri svantaggi contaminazione non enzimi 1 copia batterico DNA circolare doppio filam. grande più copie genoma doppio filam. DNA circolare plasmidico extracromosomiale replicaz. enzimi ospite piccolo enzimi diversi tanti siti sequenza DNA carta di identità DNA mappe di restrizione tagliare DNA.

Enzimi di restrizione e taglio del DNA

Malattie emoglobina mutazione siti restrizione ruolo sequenze specifiche riconoscere DNA dominio riconoscimento 1 u: 1ug DNA 7-8,5 pH mai cambio in E. Coli 37° temperatura DNA esogeno parametri frammentato scoperta tempo frammentazione difesa concentraz. utilizzo calore metilasi sistema restrizione e EDTA taglio arresto modificazione precipitaz. sali metilazione porzioni DNA batterio no taglio estraz. proteine condiz. non ottimali 5'P ruolo taglio ponte fosfodiesterico framm non netti effetto star 3'OH siti simili genere nomenclatura specie richiude ceppo origine virale DNA ligasi ATP dipendente enzimi di restrizione non sequenze riconosciute sfalzate 37 ° I taglio riconoscimento sequenze specifiche piatte 4-16° da 100 a 1000 bp a valle unione DNA diversi sequenze specifiche III no complementarietà difficili taglio specifico da 25 a 27 bp al di fuori 3 tipi molecole chimeriche no riformaz. stesso sito restriz piatte sempre più usate palindromia riconoscimento sequenze specifiche estremità compatibili facili sequenza riconosciuta II taglio specifico riformare stesso sito di restriz sfalzate complementari sequenze palindromiche no palindromia metilasi enzimi diversi endonucleasi sequenze diverse isocaudameri protruding stesse estremità 5' protrudente sfalzate 3' protrudente estremità se non metilata stesso punto nette asse di simmetria isoschizomeri stessa sequenza se metilata punti diversi unico sito restrizione.

Plasmide ricombinante e clonaggio direzionale

Cosa ho dentro? Plasmide ricombinante vettore estremità compatibili domanda esame inserto enzimi restriz. due orientamenti caratterizzazione plasmide risposta sequenziamento clonaggio non ligasi richiudere estremità direzionale self ligation identiche fosfatasi alcalina defosforilare 5' vettore più difficile estremità temperature basse nette inibizione fosfatasi alcalina inserimento frammento concentraz. enzima 5' fosforilato frammento ligasi sfalzate vettore enzimi diversi estremità diverse digestione plasmide si richiude frammenti no clonaggio etidio bromuro direzionale banda vettore gel agarosio diverse tagliare elettroforesi estremità 2 bande protruding/nette sciogliere cubetto gel entrambe 5' protruding non compatibili tampone gel soluzione DNA purificazione legame DNA biglie/colonnine lavaggio eluizione conferma processo elettroforesi vettore 1 banda nucleotidi 3'OH no stampo terminal transferasi 3' protruding obiettivo estremità compatibili dGTP vettore dCTP frammento riempimento 5' protruding brevi tratti complementarietà strategia di adattatori fill in DNA pol I E. Coli EcoRI klenow 5' protruding clonaggio attività 5'-3' polimerasica BamH1 risultato estremità piatte primers DNA sintetico rimozione enzima di restrizione sito di riconoscimento 3' protruding frammento trimming linker esonucleasi DNA pol fago T4 ligasi appaiamento risultato estremità piatte estremità blunt enzima di restrizione sito di taglio 5' protruding separare.

Elettroforesi su gel

Pettine ruolo isolare gel caratterizzare vassoio polimerizzazione componenti ddp alimentatore campo elettrico migrazione coperchio recipiente setaccio molecolare dimensioni tampone agarosio tipo dimensioni frammenti poliacrillamide gel curva di taratura distanza migrazione asse x TAE più comuni dimensioni DNA asse Y TBE pH costante standard PM tampone di scorrimento (salino) forza ionica marker dimensioni frammenti confronto EDTA chela ioni divalenti elettroforesi su gel scioglie agarosio vedere bande intercalante Etidio bromuro transilluminatore raggi UV alga rossa nel tampone di scorrimento con agarosio agarosio dimensioni concentraz. 0,7/2% DNA solito in lab 1% appesantire DNA glicerolo pozzetti alla luce naturale seguire migrazione agarosio gel stoppare migrazione necessità tecnica tampone di caricamento nastro adesivo estremità inserimento DNA nel pozzetto vaschette scorrimento tampone salino di scorrimento xilene cianolo colorante no in fondo pettine blu di bromofenolo pozzetti migraz. indipendente da DNA piccole molecole naturali doppia elica facili isolare.

Plasmidi vettori

MCS dentro lacZ in E. Coli trasformazione pUC18 sub beta galattosidasi in eucarioti trasfezione esempi plasmidi vettori molto usato in lab caratteristiche cicli di replicaz. pBluescript da pUC18 origine di replicaz. numerose copie replicano autonomamente integrità vettore solo uno x enzima 1+ geni resistenza antibiotici ori no regioni cisregolative manipolazione vettori localizzaz. particolare amp no geni essenziali enzima conveniente pro siti di restrizione unici siti di restriz. unici molteplici più inserti elementi essenziali marcatore selezionabile contro clonaggi in frame ori casi particolari dentro geni funzionali polylinker antibiotici betalattamasi idrolisi anello betalattamico identificaz. plasmidi ricombinanti plasmidi marcatori selezionabili geni che da resistenza all'amp T7 SP6 per la replicaz. + copie vettore promotori pol. di origine fagica estremità x trascrizione in vitro 1 copia x primer universali ori a controllo stringente grandi dimensioni processo coordinato maneggevoli numero copie origine di replicazione piccole dimensioni varie tecniche trasformazione facile introdurli preferenze vettori piccoli ori a controllo rilassato + copie denaturazione metodi facile estrarli processo indipendente rinaturazione limitata in pochi batteri controlla largo spettro vasta gamma specificità ospite shuttle 2 ori plasmidi diversi competizione stessa ori compatibilità altri plasmidi.

Coltura batterica e trasformazione

22 minuti tempo 37° nutrienti Luria LB Bertani batteri + plasmide ricombinante agar 1,5% solido alfa-complementaz. colonie seconda selezione con enzimi di restriz. terreno beute E. Coli colony hybridization liquido 37° colony PCR agitazione 121° ricombinante sterili autoclave 20 min non ricombinante presenza vettore antibiotici amp marcatore selezione 4° 1 sett 1/1000 ha incluso prima selezione antibiotico stoccaggio glicerolo 20% crescita a confluenza lb agar -amp congelare -20° 1 anno con gene amp -80° per sempre ricombinante batteri con vettore lb agar +amp non ricombinante incubazione CaCl2 ghiacciato batteri competenti congelato -80° trasformazione batteri + plasmidi duplicazione LB agar ioni divalenti stesso DNA cloni indipendenti elettroporazione colonie corrente campo elettrico miscela se stesso x n volte replicaz. batterio pori transienti con e senza amp vettore non ricombinante solo senza amp inserto ioni divalenti combinazioni con e senza amp vettore + inserto (ricomb.) schermare cariche calcio cloruro solo senza amp niente.