Tecniche microbiologiche

Tecniche microbiologiche

Enrico Masotto

Scienze e tecnologie alimentari

III UNIPR A.A. 2018/2019

Tecniche microbiologiche

• Introduzione 5
• Alimenti come ecosistemi microbici 5
• Analisi quantitativa culture dependent 10
• Tipologia di dato 11
• Preparazione del campione 13
• Metodo di analisi 15
• La scelta del terreno 16
• Pregi e difetti dell’analisi culture dependent 18
• Analisi qualitativa mediante approccio culture dependent 20
• Identificazione di un isolato 20
• 1. Estrazione degli acidi nucleici 22
• 2. Polymerase chain reaction (PCR) 24
• 3. Rivelazione 28
• Applicazione della PCR 29
• Tecniche di identificazione e tipizzazione di una specie 30
• Organizzazione dell’operone ribosomiale 30
• Enzimi di restrizione 31
• A. PCR specie-specifica 31
• B. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 33
• C. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 34
• D. AFLP (Amplified Fragment length polymorphism) 36
• E. RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) 37
• F. Ribotyping 38
• Analisi qualitativa mediante approccio culture independent 39
• 1. T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) 39
• 2. DGGE-TGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - Temperature Gradient Gel Electrophoresis) 40
• 3. LH-PCR (Length Heterogeneity-PCR) 43
• FISH (fluorescenti in situ hybridization) 44
• Analisi quantitativa mediante approccio culture independent: la real-time PCR 47
• High throughput sequencing 52
• Illumina Next-Gen Sequencing 54
• Esperienze di laboratorio 58
• Semina in piastra ed isolamento di una coltura pura 58
• Estrazione di DNA dall’isolato 61
• Preparazione ed esecuzione della reazione di PCR 63
• Elettroforesi su gel di agarosio 66
• Estrazione di DNA dalla matrice alimentare 68
• Real-time quantitativa (qPCR) 70
• Accenni di bioinformatica, allineamenti e banche dati 76
• Banche dati primarie 77

Tecniche microbiologiche

Introduzione

L’obiettivo del corso è quello di andare a vedere con tecniche di biologia molecolare come si fa a caratterizzare ed identificare un microorganismo (m.o.). Si seguono due tipologie di approccio:

• Culture dependent: determinazione mediante coltivazione; sono tecniche che hanno il vantaggio di poter ottenere delle micro-colture pure di microorganismi, da poter conservare ed inserire in collezioni microbiche. Mediante procedure di isolamento e purificazione posso arrivare all’ottenimento di un genotipo o una coltura pura specifica ed unica (processo per 3 volte, mediante la tecnica dello striscio, di prelievo della coltura e reinoculo in terreno). Utilizzare questi approcci, tuttavia, richiede molto tempo, fino a diverse settimane per una procedura di isolamento e purificazione. Una volta arrivati alla coltura pura, queste si possono conservare nello stesso brodo di isolamento, con aggiunta di glicerolo (un crioprotettore). Successivamente si conserveranno a -80°C.
• Culture independent: analizzare il DNA presente all’interno di una matrice, mediante l’estrazione di un pool di DNA di tutti i microorganismi presenti. Uno dei vantaggi è quello di poter stimare la popolazione VBNC (vitali ma non coltivabili) e tutti i microorganismi non vitali. Alla fine del processo in mano non si ha nulla, se non un dato (non posso costruire una collezione microbica). Richiedono molto meno tempo rispetto ai metodi culture dependent.

Tutti e due questi approcci possono essere utilizzati per analisi sia qualitativa che quantitativa.

L’analisi qualitativa che si basa su tecniche di biologia molecolare, si effettua a partire dall’amplificazione e sequenziamento del frammento di 16S rRNA (che è una sequenza specifica ed identificativa di ogni m.o.).

Oltre alla caratterizzazione genotipica è possibile fare una caratterizzazione fenotipica (ad esempio la caratterizzazione del profilo fermentativo, la capacità di crescere su alcuni substrati, resistenza al sale, capacità di crescita a diversa temperatura…).

Alimenti come ecosistemi microbici

Per ecosistema si intende l’insieme di più popolazioni microbiche (comunità microbica) in un determinato habitat: per popolazione microbica si intende l’insieme di numerosi organismi della stessa specie che si sono replicati a partire da una cellula madre, mentre per habitat si intende il luogo in cui la popolazione microbica vive. Più popolazioni costituiscono una comunità microbica. Più comunità + 1 habitat = ecosistema microbico.

All’interno di un ecosistema microbico le diverse popolazioni interagiscono tra di loro, e questo comporta diverse modificazioni all’ecosistema stesso in cui si trovano. Gli ecosistemi, quindi, non sono stabili nel tempo, grazie alle trasformazioni microbiche l’ecosistema gradualmente si modifica sia chimicamente che fisicamente. I microorganismi di un ecosistema compiono trasformazioni, ovvero rimuovono nutrienti dall’ambiente e producono prodotti di scarto. Il numero di cellule e i metaboliti prodotti sono in funzione delle trasformazioni microbiche. Le trasformazioni microbiche sono condizionate dalla capacità di crescita del microorganismo, quindi da:

1. Esigenze nutrizionali. Occorre considerare anche che alcuni microorganismi, oltre agli zuccheri, possono utilizzare molecole azotate come fonti di carbonio per produrre energia. Questi sono meccanismi accessori che alcuni microorganismi possiedono.
2. Condizioni ambientali presenti in quel determinato habitat. Alcuni microorganismi hanno range di sviluppo più ristretti in condizioni ambientali avverse (ad esempio concentrazione di sale).
3. Dalle interazioni che si instaurano tra microorganismi. I microorganismi possono trarre vantaggi dalla presenza di altri microorganismi o svantaggi (simbiosi, competizione, antagonismo, …).

Esistono ecosistemi diversi (suolo, oceani, microbiota, ..) tra i quali anche sicuramente gli alimenti, ed in particolare gli alimenti fermentati, ovvero alimenti ottenuti attraverso l’attività fermentativa di m.o., Flavour, …

Gli ecosistemi non sono stabili, quindi si evolvono, e questa dinamicità dipende dal fatto che:

1. I m.o. cambiano le dinamiche metaboliche e di crescita in seguito a condizioni di stress che si verificano nella matrice alimentare (carenza di nutrienti, pH, sale, temperatura, …). Nel processo di trasformazione di una materia prima in un prodotto finito le condizioni estrinseche ed intrinseche mutano. I possibili meccanismi di sopravvivenza e di reazione a questo stress sono diversi:
   • Possono entrare in stato di VBNC “viable but not cultivable”: viene definito VBNC il momento in cui le cellule entrano in una fase in cui nonostante siano ancora capaci di compiere attività metabolica, non producono colonie (non si riproducono) nel mezzo di coltura che viene normalmente utilizzato per la loro crescita. Questo è indotto da condizioni avverse quali la carenza di nutrienti, le basse temperature, il pH o i trattamenti termici;
   • Possono entrare in fase stazionaria, ovvero indurre, anche in modo anticipato, una fase in cui i microorganismi sono più resistenti a determinati stress (la fase precedente alla fase di crescita esponenziale logaritmica). È noto che negli alimenti questo è lo stato fisiologico in cui si trovano la maggior parte dei microorganismi. Le cellule in questo stadio sono ancora metaforicamente attive e compiono reazioni biochimiche differenti rispetto a quando crescono in fase esponenziale (es: metabolismi secondari che portano alla produzione di aromi; spesso in questa fase stazionaria avvengono i cambiamenti principali e più interessanti che non avvenivano in fase di crescita esponenziale, trasformando delle fonti alternative di carbonio come ad esempio composti azotati, acidi grassi e acidi organici per produrre composti aromatici come aldeidi, alcoli, composti sulfurei, esteri e metilchetoni).
2. I m.o. interagiscono tra loro (es: produzione di un composto che favorisce lo sviluppo di un altro m.o., quorum sensing, …). Il quorum sensing è la regolazione dell’espressione genica in risposta al cambiamento di una densità di popolazione. Il quorum sensing permette a batteri diversi di coordinare il loro comportamento. Le condizioni ambientali di crescita spesso cambiano repentinamente ed i batteri hanno bisogno di rispondere a questi cambiamenti velocemente per poter sopravvivere. In seguito all’attivazione del quorum sensing possono essere attivate diverse tipologie di risposta, come un aumento dell’adattamento a substrati alternativi, aumento della difesa contro microorganismi che competono per gli stessi nutrienti o la produzione di composti tossici che danneggiano altri microorganismi. I batteri per regolare il quorum sensing producono dei segnali, ovvero delle molecole definite “autoinduttori” e prodotte verso l’ambiente esterno. Quando la concentrazione di autoinduttori in ambiente esterno è elevata, e quindi è presente un elevato numero di cellule nella popolazione, queste entrano all’interno della cellula, legandosi al DNA in corrispondenza dei geni coinvolti nella risposta allo stress, promuovendo o inibendo l’espressione di quel gene (tutti iniziano a produrre una batteriocina, a utilizzare una fonte alternativa di carbonio, …). Queste molecole “segnale” sono di origine diversa, definite AHLs e AL-2. Queste molecole si ritrovano e rilevano negli alimenti e vengono messe in correlazione direttamente con la popolazione microbica specifica presente nell’alimento (Vasiliki A. Blana et. Al).

Considerato che gli alimenti sono ecosistemi microbici, uno degli obiettivi dell’industria alimentare è quello di valutare nel prodotto finito o durante le diverse fasi di trasformazione questi tre aspetti:

1. Studiare la presenza di microorganismi nel prodotto finito o nelle diverse fasi di trasformazione (ci sono microorganismi?);
2. Studiarne il numero (valutazione quantitativa) quindi rispondersi alla domanda “quanti sono in totale?” “Quanti sono i microorganismi di determinati gruppi microbici?”;
3. Identificarli, quindi rispondersi alla domanda: “quali sono?” In particolare la tecnica utilizzata permetterà di discriminare a livello di genere, di specie e subspecie (strain-level);
4. Studiarne il tipo cioè individuare particolari ceppi e/o biotipi di interesse tecnologico.

Alcune volte, gli studi di microbiologia che vengono fatti, sono atti a studiare l’evoluzione dell’ecosistema nel tempo. Spesso questo viene chiesto per alimenti fermentati che vanno incontro a processi di stagionatura lunga. Da una matrice iniziale al prodotto finito si valuta la popolazione microbica, e per questo approccio si utilizzano generalmente metodologie culture independent. Conoscere come si sviluppano i microorganismi nel tempo permette di:

• Valutare se lo sviluppo è corretto;
• Mantenere la corretta tecnologia di trasformazione;
• Permettere la correzione tecnologica;
• Vedere quali sono gli effetti delle dinamiche di sviluppo microbico sul prodotto.

Questi diversi livelli di studio possono essere affrontati attraverso due tipologie di approccio: culture dependent e culture independent.

Approccio culture dependent

I microorganismi vengono coltivati ed isolati mediante impiego di adeguati mezzi di coltura (terreni). Una volta ottenuti in coltura pura e conservati in collezione, i singoli isolati provenienti dalla popolazione in studio, vengono analizzati in base al loro genotipo, nonché caratterizzati in base al loro fenotipo (con analisi chimiche, biochimiche, microbiologiche):

• I mezzi colturali selettivi, differenziali e di arricchimento forniscono ai microorganismi nutrienti che ne permettono la loro moltiplicazione e la formazione di colonie dopo incubazione in condizioni e tempi definiti;
• Attraverso la coltivazione in piastra viene valutata e quantificata la presenza di gruppi/generi e raramente di specie. Quindi è necessario l’isolamento delle colonie dalla piastra e la loro identificazione/tipizzazione biochimica e/o molecolare.

Approccio culture independent

I microorganismi non vengono più coltivati ed isolati, ma si rilevano direttamente all’interno del campione attraverso l’analisi del loro DNA ed RNA. La principale novità di questi procedimenti è l’estrazione diretta degli acidi nucleici dalle matrici in esame, i quali, successivamente, vengono analizzati con strumenti molecolari in grado di definire la loro diversità, la quale è in stretta connessione con la complessità microbica del sistema in studio.

Si hanno due diversi target molecolari:

1. A partire dal DNA: si valuta la diversità tra i microorganismi presenti sia vivi che morti;
2. A partire dall’RNA: si valuta l’attività dei microorganismi (quindi solo quelli vivi e vitali) metaforicamente attivi.

L’obiettivo del corso, quindi, è quello di andare a studiare e vedere i diversi livelli analitici utilizzati in microbiologia, quali:

1 livello: analisi quantitativa

• Culture dependent: conta in piastra;
• Culture independent: quantitative PCR;

2 livello: analisi qualitativa (domanda: quali specie?)

• Culture dependent: estrazione DNA dagli isolati, amplificazione del gene 16S (o geni diversi la cui diversità permetta di identificare una o più specie);
• Culture independent: pyrosequencing, LH-PCR, DGGE.

3 livello: analisi qualitativa (domanda: quali genotipi/biotipi?) Al terzo livello lo scopo è quello di vedere se tutti i m.o. appartenenti alla stessa specie caratterizzata in secondo livello, sono geneticamente o biotipicamente simili o differenti. L’approccio culture independent al terzo livello è ancora poco studiato e conosciuto, ma comunque non molto utilizzato in quanto è molto difficile arrivare a questo livello di sensibilità.

• Culture dependent: estrazione DNA da isolati, tecniche di fingerprinting, prove fenotipiche/tecnologiche;
• Culture independent: pyrosequencing.

Analisi quantitativa culture dependent

Nel momento in cui si parte con un’analisi quantitativa il primo step è quello di fare una preparazione del campione, sia nel caso in cui si parli di campione solido che di campione liquido (differente tra campione solido e liquido). La seconda fase è quella di diluire il campione, e definire quali diluizioni effettuare per arrivare ad un carico microbico contabile in piastra (massimo 200 UFC in una piastra da 90): è possibile alla fine dell’analisi microbiologica determinare quante colonie sono presenti nella piastra per risalire al numero di cellule iniziali. Il terzo step è quello di scelta del terreno e l’inoculo dell’aliquota di campione nel mezzo agarizzato appropriato; si va ad incubare la piastra in modo tale da far crescere le cellule lasciando il tempo per formare le colonie alle opportune condizioni di crescita. L’ultimo step è quello di quantificazione delle colonie.

Ci sono dei fattori che vanno tenuti in considerazione, ovvero una analisi quantitativa può essere come descritta, ma anche analisi effettuate attraverso procedure di arricchimento per determinare la carica microbica di patogeni: in questo caso non si determinano le colonie ma l’assenza o la presenza di un patogeno in un alimento (es: assenza di Listeria in 25 g di alimento). La tipologia del dato più frequente è il numero di UFC per mL o grammo di campione, ma anche un dato quantitativo può essere presenza o assenza di patogeni in una aliquota di campione. Anche il metodo di preparazione del campione deve essere tenuto in considerazione, a seconda che si parli di campione liquido (dove è possibile analizzare una aliquota del tal quale) o solido dove si ha la necessità di almeno una diluizione: si hanno poi protocolli specifici per campioni bifasici o per alimenti specifici. Il metodo di analisi è differente a seconda della tipologia che si vuole ottenere: il metodo delle diluizioni viene effettuato quando si vuole andare a fare una analisi quantitativa contando il numero di UFC, mentre il metodo di arricchimento del terreno viene solitamente fatto per andare a valutare la presenza o l’assenza del patogeno nell’alimento. In funzione del terreno che si utilizza si possono ricercare microflore diverse: si utilizzano terreni generici per la ricerca di gruppi di microorganismi, oppure elettivi, selettivi o differenziali che permettono in modo specifico di ricercare microorganismi appartenenti a particolari generi microbici restringendo l’analisi al genere o famiglia.

Tipologia di dato

Il dato può essere espresso in due modi differenti, e richiede metodiche analitiche a loro volta differenti:

• Dato quantitativo espresso in UFC/g o Log o UFC/mL: dalle colonie attraverso la formula della media pesata si risale al quantitativo presente e si esprime il dato in UFC/g. Il numero delle unità formanti colonie nel campione in esame viene riferito all’unità di peso (UFC/g) o di volume (UFC/mL) e viene dedotto dal calcolo combinato del numero delle colonie isolate e contabili presenti in una determinata piastra:

∑c è la somma di tutte le colonie contate in tutte le piastre contabili. Na è il numero di piastre della prima diluizione contabile (analisi in singolo, doppio, triplo, …), nb è il numero delle piastre della seconda diluizione contabile e d è il fattore della prima diluizione contabile. Qui viene riportato un esempio di calcolo