Tecniche immunologiche e modelli cellulari e animali

Tecniche immunologiche e modelli cellulari e animali A.A. 2021/2022

Lez. 1 – Introduzione

Gli anticorpi monoclonali innanzitutto hanno oggi utilizzi in terapie neutralizzanti (per esempio Covid), oppure terapie oncologiche, e anche terapie per bloccare le attività pro-infiammatorie di molte citochine dell’immunità innata (IL6, IL1, TNF-alfa ecc…).

La risposta immunitaria la possiamo dividere in risposta di tipo cellulo-mediata (linfociti T che proliferano in risposta agli antigeni) e una risposta umorale in carico a molecole solubili, ovvero anticorpi, prodotti a carico dei linfociti B. Questi anticorpi non sono altro che dei recettori che hanno specificità molto alta nei confronti dell’antigene che stimola la cellula B. Si distinguono anticorpi di superficie, a rappresentare il recettore per l’antigene e si identificano anche forme solubili rilasciate nell’ambiente circostanze. Nell’organismo abbiamo significative quote a livello di tessuti e in particolare nel plasma.

L’innesco delle immunoglobuline da parte dei linfociti B può avvenire in tre modi:

• Antigene proteico: richiede la cooperazione di linfociti T specifici per la proteina antigenica (si parla di cooperazione tra cellula B e T). Di fatto nel momento in cui il linfocita B cattura l’antigene (avviene tramite le immunoglobuline di membrana della cellula B, ovvero le IgM e IgD) lo può a sua volta presentare a una cellula T. La cellula B per questo si chiama, insieme alle cellule dendritiche e ai monociti/macrofagi, cellule del tipo presentati l’antigene professionali (o APC professionali). L’attivazione della cellula T a carico dell’antigene attiva l’esposizione del CD40-Ligando che contatta il linfocita B per indurre la risposta con produzione di anticorpi e poi sempre le cellule T producono anche citochine per causare una risposta cellulare e tissutale. Questo avviene nei linfonodi, all’interno dei follicoli linfonodali, in quella che viene chiamata area B (proprio perché in questa zona si ha l’attivazione dei linfociti B).
• Antigeni polivalenti: ovvero sono antigeni che presentano in modo ripetuto lo stesso epitopo antigenico (il dominio dell’antigene che viene riconosciuto dall’anticorpo). In questo caso avviene il capping recettoriale, per cui il linfocita B ha varie immunoglobuline esposte in membrana (in primis IgM e IgD), tutte con la stessa specificità, e non si ha il legame di una sola con questo epitopo, ma si ha l’interazione ripetuta e contemporanea dell’antigene con tutte queste immunoglobuline. Il capping quindi consiste nell’avvicinamento in membrana di tutte queste immunoglobuline e si ha un’attivazione massiva della cellula B, tale che non si richiede la cooperazione in questo caso della cellula T e la cellula B indipendentemente produce anticorpi.
• Antigeni proteici associati ad alcune componenti del complemento: in particolare l’antigene proteico si lega all’immunoglobulina di superficie della cellula B, ma lega anche un elemento del complemento, detto CD3 e quindi viene riconosciuto da alcuni recettori presenti sempre sulla cellula B che ne ricevono il segnale attivatorio e il segnalatore della componente CD3 del complemento è il CD21.
• Attivazione mediante TLR: abbiamo che il linfocita B che tramite un’immunoglobulina riceve l’antigene, ma si può avere anche co-stimolazione di un elemento dell’immunità innata, che è il Toll-Like Receptor TLR inducendo produzione anticorpale.

Le immunoglobuline sono strutture tetrameriche, con due catene pesanti e due leggere, ognuna fatta da un dominio costante che non varia e una variabile. L’associazione della parte variabile della catena pesante con la parte variabile della leggera identifica il sito di attacco dell’antigene (FAB, fragment antigen binding). Esistono due catene leggere, che sono la K e la lambda, mentre i classici 5 isotipi di anticorpi (IgA, IgG, IgM, IgE e IgD) sono definiti dalla parte pesante delle immunoglobuline.

La forma classica a Y dell’anticorpo indica che ognuno ha due siti di specificità per l’antigene (due FAB), in cui le parti variabili presenti su entrambi i rami della Y sono identiche e quindi questo è il motivo per cui entrambi i FAB sono della stessa specificità. A differenza dell’anticorpo solubile, quello di membrana ha anche una parte in più, ovvero ha 4 domini costanti invece dei 3 soli, propri invece dell’Ab solubile (CH1, CH2, CH3, più il CH4 presente solo nel caso delle immunoglobuline di membrana). Oltre ai 5 isotipi principali, si hanno anche varie sottoclassi, 4 nel caso delle IgG, mentre 2 nel caso di IgA.

Le IgG sono in forma unicamente monomerica e sono le più abbondanti nei fluidi corporei, specialmente extra vascolari dove combattono tossine e microorganismi vari. Le IgA possono essere monomeriche, dimeriche o trimeriche e sono per lo più presenti nelle secrezioni siero-mucose difendendo le superfici corporee dal contatto con l’esterno. Le IgM sono in forma pentamerica e sono nel siero ed è il primo anticorpo prodotto in forma solubile. Nei linfociti B, infatti, si ha una prima espressione di IgM, dopodiché la cellula co-esprime IgM e IgD (presente unicamente o quasi in membrana dei linfociti, infatti esiste solo nella conformazione di membrana e non solubile) con la stessa specificità antigenica.

Sono quelle due immunoglobuline precedentemente citate che servono a contattare gli antigeni e sono il recettore per l’antigene d’eccellenza. Solo quando la cellula B riceve una segnalazione adeguata da parte dell’antigene catturato e dai linfociti T può cambiare l’isotipo globulinico verso le altre classi, A, G ed E. Le IgE sono in forma monomerica, presenti in concentrazioni molto basse a livello sierico e aumentano in condizioni particolari come infezioni parassitarie o in collaborazione con altre molecole, come l’istamina in reazioni allergiche. Le IgE sono per lo più in membrana di basofili e mastociti.

Queste cellule presentano un recettore per le IgE ad altissima specificità, quindi significa che quando una cellula B produce IgE queste vanno unicamente verso queste cellule, mai verso altre. Tale sensibilizzazione di basofili e mastociti è alla base delle reazioni allergiche istantanee rivolte verso l’allergene (motiva quindi la risposta quasi immediata, in termini di minuti, all’allergene appunto).

Gli anticorpi, se trattati con papaina possono essere divisi in tre componenti, i due bracci della Y, mantenendo però la specificità verso l’antigene, e il frammento detto Fc ovvero la parte costante dell’anticorpo. Se si tratta l’immunoglobulina con la pepsina, rimangono insieme le parti del FAB, mentre viene completamente degradata in frammenti peptidici la parte dell’Fc.

Funzioni degli anticorpi

• Neutralizzazione: capacità dell’organismo di neutralizzare un microbo mediante il riconoscimento di una tossina o antigene vario. Alcuni esempi sono per esempio avvelenamenti, intossicazioni, infezioni virali o plasma terapie e plasma iperimmune.
• Opsonizzazione: ovvero gli anticorpi ricoprono un antigene, o meglio un patogeno, con lo scopo di renderlo più visibile a quelle cellule dell’immunità innata che presentano recettori membranosi per i frammenti costanti di quegli anticorpi, per esempio macrofagi che hanno recettore per le IgG. Questo processo può favorire da un lato la fagocitosi, che in assenza di Ab sarebbe inefficiente, mentre con gli Ab è più mirata ed efficace, oppure dall’altro la cellula opsonizzata può essere bersaglio di cellule Natural Killer o per l’attivazione del complemento e quindi lisi cellulare mediante tale sistema. I membri recettori delle IgG presenti su macrofagi, eosinofili e neutrofili sono i CD64, 32 e 16 (16a e 16b).
• Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC): pensiamo di essere una cellula che viene riconosciuta da un Ab perché presenta un’anomalia o è infettata da virus, in questo caso quella cellula viene uccisa mediante un meccanismo attivo da parte di cellule dell’immunità innata, come le Natural Killer, sempre specifiche per le IgG, quindi le individua sulla membrana di questa cellula target e la uccide direttamente, proprio perché quelle IgG l’hanno marcata.
• Attivazione del complemento (citotossicità complemento dipendente CDC): sistema che permette laddove un Ab è stabilmente legato a una superficie cellulare si inneschi la cascata complementare con l’attivazione del sistema MAC portando la cellula a lisi osmotica. Il grande problema di terapie con questo sistema è si può avere una risposta flogistica causata da una super risposta infiammatoria a causa di un’uccisione di una quantità alta di cellule e quindi causano una risposta infiammatoria pesante. Per questo sono terapie coniugate con farmaci per tenere sotto controllo l’infiammazione.
• Sensibilizzazione di mastociti, granulociti basofili ed eosinofili: nel caso di basofili e mastociti avviene grazie alla caratteristica espressione in queste cellule di recettori ad alta affinità per le IgE che sono intrappolate sulla superficie di queste cellule. Mastociti sono stanziate a livello tissutale, connettivo e mucose, mentre granulociti sono circolanti. Dopo il legame recettore-anticorpo-antigene avviene il meccanismo già detto di capping cellulare (non sarebbe sufficiente il legame di una sola IgE sulla superficie cellulare) per innescare la degranulazione del mastocita e granulocito basofilo. Quando vediamo titoli di IgE molto alti sono soggetti esposti quotidianamente esposti a parassiti, per esempio soggetti africani o sudamericani. In questo caso non rappresentano un’allergia (che invece potrebbe essere un caso più tipico e frequente in una casistica di soggetti occidentali dei paesi più ricchi). Ricordiamo che nel caso dei mastociti si hanno due tipi di granuli, i primi a essere rilasciati sono i granuli preformati contenenti soprattutto amine vasoattive che causano un’immediata risposta di vaso-dilatazione, aumento permeabilità vasale ecc… In tempi più tardivi invece si ha la formazione dei granuli neosintetizzati che contengono prostaglandine e anche citochine/chemochine. Gli eosinofili esprimono invece i recettori a bassa affinità per le IgE e è necessario che l’Ab sia legato a un bersaglio per innescare l’azione e degranulazione degli eosinofili mediante l’Fc-Receptor-epsilon-II.

Lez. 2 - Allestimento in vitro di anticorpi e loro utilizzo

Vediamo ora quindi l’allestimento in vitro di anticorpi specifici e lo facciamo mediante una immunizzazione ovvero significa fornire a un animale un antigene X. Quindi può essere un’immunizzazione legata a una vera e propria infezione naturale, oppure viceversa possiamo essere noi a inoculare nell’animale un antigene specifico, che non vuol dire per forza l’agente patogeno intero, ma una struttura di esso. A valle dell’immunizzazione si ha attivazione delle cellule B e T dove le B iniziano a produrre Ab che sono nel siero dell’animale.

Da un lato possiamo isolare TUTTI gli Ab presenti nel siero, a prescindere dalla specificità, e si fa attraverso tecniche vecchiotte con precipitazione in solfato di ammonio, cromatografia a scambio ionico, filtrazione su gel oppure assorbimento su colonna con proteina stafilococcica A che ha un’affinità elevata per il Fc delle IgG. In questi quattro modi prendiamo tutte le Ab in modo aspecifico, recuperando tutti gli Ab che circolano in quel momento nell’animale. Chiaramente è un problema, perché gli Ab specifici che mi interessano sono diluiti in altri Ab aspecifici che sono peraltro la maggioranza chiaramente.

Lo step successivo è quindi di purificare gli Ab di interesse e abbiamo la necessità di usare l’antigene verso cui l’animale si è immunizzato. Quindi se in colonna intrappoliamo questo antigene e ci facciamo passare tutti gli Ab purificati, soltanto quelli specifici per l’antigene rimangono intrappolati. Così dopo una serie di lavaggi andiamo a eluire e quindi distaccare i nostri Ab specifici dalla colonna contenente l’antigene di interesse. Questo è altamente specifico, ma non si isola solitamente tutti gli Ab che sono presenti infatti riporta il problema di quantità limitata.

Allora si passa agli anticorpi monoclonali che derivano per definizione da un unico clone di linfocita B. Infatti durante l’ontogenesi T e B ogni singola cellula si caratterizza per l’espressione di un unico recettore per l’antigene, quindi quella specificità associata al recettore è unica per tutta la cellula. E se produco tutte cellule uguali con un unico recettore, si genera un clone di cellule. Se è una cellula secernente anticorpi significa che ho una grande sorgente di anticorpi con tutti la stessa specificità, e si parla quindi di anticorpo monoclonale, ovvero che deriva da un singolo clone, che a sua volta deriva da una singola cellula.

Una situazione di questo tipo venne prodotta per la prima volta da Milstein e Kohler nel 1975. Lo schema della tecnica è molto semplice. Infatti, innanzitutto si immunizza un animale con un antigene X per innescare la produzione di cellule B che producono Ab specifici per l’antigene X. Tutte le cellule B dell’animale producenti anticorpi (prese dalla milza) vengono “fusi” (è solo una fusione di membrana ma non di nucleo e viene fatto con PEG, polietilenglicole) con un particolare tipo di cellula tumorale, un plasmocitoma murino NON secernente Ab, ma caratterizzato da iper-proliferazione, formando un ibridoma, questo con lo scopo di generare un pool di cellule secernenti Ab a potenziale replicativo illimitato, progettandolo per proliferare all’infinito potenzialmente.

A questo punto si ottiene una sola cellula, appunto l’ibridoma, fatto da due nuclei, un corredo genetico relativo alla cellula B che ha la proprietà di produrre Ab e uno relativo alla cellula tumorale che si caratterizza per vita illimitata. A questo punto si selezionano tra i vari ibridomi quello che produce l’Ab di nostro interesse. Questa selezione permette di distinguere cellule B che non sono fuse con cellule tumorali e quindi dopo pochi giorni moriranno, e cellule tumorali non fuse che continuano a proliferare ma non producono Ab. Adesso si fa proliferare all’infinito e banalmente recuperare dal surnatante di coltura gli Ab che ci interessano e siamo sicuri essere un Ab monoclonale (perché deriva da una sola cellula) specifico per un singolo antigene, di nostro interesse.

Gli ibridomi soltanto li selezioniamo perché le cellule tumorali usate sono naturalmente difettive per gli enzimi timidin-chinasi e ipoxantina guanina fosforibosil-transferasi deputati alla sintesi dei nucleotidi attraverso la “via alternativa” che parte da timidina e ipoxantina producendo i nucleotidi. Quindi questi ibridomi possono solo fare la via “de novo” partendo da fosforibosil-pirofosfato + uridilato. Di fatto aggiungiamo in cultura però l’aminopterina, inibitore della via di biosintesi de novo appunto. Quindi poiché le cellule tumorali non possono fare né la via alternativa (a causa della mancanza dei geni degli enzimi detti prima) né la via de novo a causa del farmaco aminopterina, e quindi muoiono chiaramente. In coltura rimangono quindi solo gli ibridomi. Questo processo è detto HAT.

Adesso però abbiamo una cultura mista, ovvero abbiamo tanti ibridomi che sappiamo derivare da un animale immunizzato per un antigene, ma era caratterizzato per immunizzazione anche per altri antigeni. Quindi con ogni probabilità in coltura ho sia ibridomi che producono Ab per il nostro antigene che per altri antigeni. Siamo sicuri però che se facciamo colture cellulari virtualmente a singola cellula, questa andrà a proliferare perché trasformata e costituisce un clone cellulare e avrò la formazione di un anticorpo monoclonale. Quindi dalla mia coltura di partenza facciamo una diluizione in modo da avere una cellula ogni tot di μL e mettiamo questo volume selezionato, in modo tale da avere una cellula per pozzetto e avviamo la proliferazione.

Ho ancora un problema però, devo identificare quale di questi Ab monoclonali che ho prodotto è effettivamente quello che voglio io. Quindi in ogni pozzetto facciamo una rilevazione immuno-enzimatica (tecnica ELISA indiretta), identificando i vari cloni che producono Ab specifici per il nostro antigene. Dopo, in base anche all’utilizzo che ne farò, dovrò fare ulteriori selezioni basata sull’affinità, infatti seppure tutti gli Ab siano rivolti per quell’antigene, non tutti hanno la stessa selettività.

A questo punto, selezionata la cellula che vogliamo, possiamo avere due destini di utilizzo. Da una parte induciamo una massiva clonazione per produrre diversi litri di surnatante da cui purifichiamo l’Ab, ovvero gli ibridomi sono mantenuti in coltura, per esempio per fini farmacologici, oppure però, se ci servono all’istante in grandi quantità, l’ibridoma può essere inoculato nuovamente a livello peritoneale in cui subisce una crescita estremamente accelerata con produzione significativa anticorpale e possiamo recuperare alte concentrazioni dell’Ab recuperando il liquido ascitico dalla cavità peritoneale dell’animale in cui abbiamo inoculato l’ibridoma.

Più di recente è stata elaborata la reverse vaccinology per ottenere Ab estremamente e sempre più efficaci, partendo dalla cellula B nel soggetto che ha fatto l’infezione naturale. Facciamo l’esempio del Covid. Si isolano linfociti B da soggetti infetti