Tecniche di fecondazione in vitro

Lezione 1

Prima di studiare le tecniche della fecondazione in vitro dobbiamo ricapitolare i meccanismi che sono alla base della formazione dei gameti, la loro interazione e lo sviluppo dell’embrione.

Riproduzione

La riproduzione è una delle caratteristiche fondamentali che definiscono gli organismi viventi dai non viventi. In termini evolutivi la misura del successo evolutivo di un organismo è la quantità dei suoi geni che è ancora presente nelle generazioni successive.

Il punto cruciale dell’esistenza di un individuo è dunque la riproduzione, ovvero la trasmissione delle informazioni genetiche da una generazione a quella successiva.

Ci sono 2 tipi di riproduzioni: sessuata e asessuata.

La riproduzione asessuale consiste nella produzione di una prole la cui totalità dei geni proviene da un solo genitore. La sua base cellulare è la mitosi. La progenie è geneticamente identica al genitore e composta da individui geneticamente identici, ovvero è un clone. Raramente possono verificarsi differenze genetiche in seguito a mutazione. Così un organismo pluricellulare come l’idra si riproduce per gemmazione, altri organismi, come i policheti, per scissione.

La maggior parte degli animali produce però discendenti per riproduzione sessuale. La riproduzione sessuale è la produzione di prole tramite fusione di due gameti, uova e spermatozoo, a formare uno zigote diploide; implica quindi due genitori, ognuno dei quali trasmette metà dei suoi geni alla propria prole. La progenie ha una combinazione unica di geni ereditati da entrambi i genitori. Il risultato è una maggiore variabilità genetica: la progenie varia geneticamente dai propri fratelli e dai genitori. Questa variazione genetica durante la riproduzione sessuale è dovuta alla meiosi, tramite i processi di ricombinazione genica, crossing-over e assortimento indipendente degli omologhi, e alla fusione casuale dei gameti. Quindi questa riproduzione crea nuovi genotipi e introduce variabilità.

La differenza principale tra riproduzione asessuata e sessuata è che quella asessuata è più efficiente in termini di trasmissione dei caratteri ereditari perché li trasmettiamo al 100% uguali; mentre quella sessuata invece è inefficiente sotto questo punto di vista perché trasferiamo solo il 50% dei miei caratteri ereditari, e non sono neanche esatte, crossing-over.

Tecniche di fecondazione in vitro: lo scopo di queste lezioni sono la formazione dei gameti in vitro e in vivo, e degli impianti embrionali. Tecniche usate per superare problemi dell’infertilità.

Allora perché si è affermata la riproduzione sessuata?

Perché dall’interazione dei 2 genomi, quello paterno e materno, si ha la possibilità di offrire una variabilità più elevata a livello dell’ambiente e quindi avere maggiori possibilità di sopravvivenza quando le condizioni ambientali sono sfavorevoli.

Gli organismi possono adottare diverse strategie per l’accoppiamento.

Strategie di accoppiamento alternative nella riproduzione sessuata

Strategie alternative nell’accoppiamento per riproduzione sessuata: esse sono diverse come la sneaker, stupratori, suicidi, transessuali, inversione permanente e inversione occasionale.

Esistono degli individui in cui la riproduzione è l’ultimo atto della loro vita, perché richiede un’elevata energia, e quindi coincide con la morte, un esempio sono i salmoni. La riproduzione è un obiettivo primario per moltissimi animali, e ci sono strategie differenti per effettuarla.

Il successo riproduttivo è la capacità che ha un individuo di riprodursi. Ad esempio in alcuni pesci, e non solo, è la femmina che sceglie il maschio che gli darà sicuramente una prole sana, non sempre sceglie la femmina.

Ci sono poi maschi che arrivati a maturazione sessuale verranno “scartati” dalle femmine perché non idonei nel dar loro una prole forte e sana, quindi questi, detti sneaker o schiavo, aiuteranno il maschio dominante a fare il nido e in cambio il maschio dominante gli fa fecondare una piccola parte delle uova. Oppure ci sono pesci che investono le loro energie solo nella riproduzione e non nell’accrescimento, quindi raggiungono la maturità sessuale precocemente, e mentre il maschio dominante e lo sneaker sono occupati a fare il nido insieme alla femmina, durante l’ovulazione di quest’ultima, spruzza gli spermatozoi e se ne va. Queste tecniche sono effettuate dagli organismi che hanno un fitness riproduttivo basso e cercano altri modi per riprodursi.

Un altro esempio è quello dello scarafaggio, dove il maschio porta in dono alla femmina. Anche in questo caso il maschio che non ha possibilità di accoppiarsi con una femmina, inizia ad emettere fermioni per attirare un maschio dominante, in questo modo gli ruba il dono che avrebbe donato alla femmina e lo dona a sua volta ad un’altra femmina.

Spermatogenesi, ovogenesi e fusione dei gameti

Cenni sulla formazione degli spermatozoi avviene attraverso un processo detto spermatogenesi, che avviene all’interno del testicolo, mentre quella delle cellule uova è detta ovogenesi ecc.

La differenza principale tra ovogenesi e spermatogenesi è che la seconda dura per tutta la vita mentre la prima no. Perché gli spermatozoi non perdono la loro capacità di staminalità mentre gli ovociti la perdono allo stadio di ovogoni.

TEE

La produzione di ovociti finisce con la menopausa, cioè non ci sono più ovociti da ovulare. Alla nascita si ha già un numero limitato di follicoli primordiali, che va a diminuire ancora di più fino alla pubertà.

Dalla pubertà fino alla menopausa vengono ovulati solamente 400 ovociti.

Infertilità: incapacità di ottenere una gravidanza per difetti anatomici, mancanza dell’utero, una tuba occlusa, aspermia, lentezza spermatozoi ecc. Le cause dell’infertilità sono aumentate ai giorni d’oggi. Infatti l’infertilità al giorno d’oggi è molto comune a causa di stress, condizioni ambientali, malformazioni anatomiche ecc.

Storia dell’embriologia

Storia dell’embriologia: Ippocrate studia il problema della steribilità e, basandosi anche sulle esperienze degli egiziani, formula numerosi rimedi che vanno dai consigli dati agli uomini per concepire più efficientemente alla diagnosi della sterilità.

La sterilità e infertilità sono un cosa che riguarda l’epoca moderna o c’è sempre stato?

Per Ippocrate la sterilità poteva essere originata da diverse cause:

• Mal posizionamento della cervice.
• Ammorbidimento della cavità dell’utero di origine congenita o acquisito.
• Ostruzione del canale cervicale dovuto all’amenorrea.
• Aumentato flusso mestruale.
• Prolasso uterino.

I trattamenti erano numerosi: “Quando la cervice è chiusa strettamente il foro interno deve essere aperto usando un miscuglio speciale composto di nitrato rosso, di comino, di resina ed di miele” (Ippocrate, Le Malattie delle donne 94).

I greci non si limitavano all’uso di medicamenti ma avevano sviluppato anche delle tecniche specifiche. Una di queste consisteva nel dilatare la cervice per inserire una sonda cava all’interno dell’utero in cui venivano versate delle sostanze emollienti (Ippocrate, Le Malattie delle donne 35).

Anton van Leeuwenhoek (1632 - 1723), ricco mercante olandese di tessuti, per valutare meglio la sua merce sembra avesse inventato un sistema di lenti ottiche, prototipo del nostro microscopio. Van Leeuwenhoek costruì centinaia di microscopi, formati da una sola lente sferica, montata tra due piccole piastre di ottone. Il materiale da osservare era sistemato sulla punta di uno spillo, all’altezza della lente; lo spillo veniva fissato alla piastra superiore e regolato da due viti che consentivano di variare la distanza del campione dall’obiettivo. L’osservatore teneva lo strumento molto vicino all’occhio e guardava attraverso la lente. Per ottenere ingrandimenti sempre maggiori, egli costruì lenti di dimensioni via via più piccole, fino a 1-2 mm di diametro, capaci di ingrandire l’immagine di quasi 300 volte.

Grazie a questo strumento van Leeuwenhoek studiò e descrisse un’infinità di oggetti: dalla trama minuscola dei tessuti ai semi e agli embrioni vegetali, dall’anatomia di piccoli invertebrati ai globuli rossi e agli spermatozoi. È per questo che può essere considerato il padre della microbiologia e l’iniziatore dell’istologia animale.

Leeuwenhoek e Hamm (1677) osservarono per la prima volta gli spermatozoi e formularono la teoria preformista. Leeuwenhoek nel 1677 scoprì nel seme umano “numerosi animaluncoli” e comunicò le sue osservazioni con una timorosa lettera del novembre dello stesso anno ai nobili membri della Società Reale di Medicina di Londra, i quali però accettarono con entusiasmo la sua scoperta, invitandolo a continuare i suoi studi in altre specie animali.

Leeuwenhoek osserva gli spermatozoi, li classifica e ne distingue di due sessi, pensa che si accoppino nella stagione degli amori e che quelli femmina diventino gravidi e partoriscano altri animaluncoli. La sua scoperta degli spermatozoi, animalicula, diede sprone ad una schiera autorevole di studiosi, animalculisti, che si opponevano all’altra teoria preformista dell’ovismo.

Nel 1890 Walter Heape trasferisce con successo embrioni tra due differenti specie di coniglio, per la prima IVF animale bisognerà aspettare il 1959 Chang.

Nel 1890 Robert Dickinson inizia esperimenti con sperma di donatore, anche in questo caso il suo lavoro viene fatto in segreto per evitare l’opposizione della chiesa.

Nel 1897 il S.Uffizio risponde con un “Non licet!” sulla moralità della fecondazione artificiale. In clandestinità si fa di tutto e la procreazione assistita viene praticata nella specie umana saltuariamente per lungo tempo.

Nel 1927 si erano registrati 88 casi e dopo il 1930 l’uso se ne diffuse rapidamente, particolarmente nei paesi anglosassoni.

Nel 1930 studi sulla maturazione in vitro degli ovociti da parte di Pincus e colleghi. Vengono scoperti e studiati i principali ormoni della fertilità, vale a dire le gonadotrofine non coriali follicolostimolanti (FSH) e luteostimolanti (LH), la follicolina (ESTROGENI) e la luteina (PROGESTERONE). Viene scoperta nell’urina anche la gonadotropina corionica (HCG) e vengono ideati i primi test biologici per la determinazione del test di gravidanza, prima sui conigli e poi sulle rane. Si inizia inoltre la terapia ormonale, estratti di ghiandole endocrine di animali, maiali o cavalli.

1945 Prima pubblicazione sul British Medical Journal (BMJ), relativa ad un’inseminazione artificiale con seme di donatore.

1951 Austin e Chang scoprono il ruolo essenziale della capacitazione degli spermatozoi e la fecondazione in vitro si avvale delle tecniche di “capacitazione in vitro”.

1959 Chang dimostra che ovociti fecondati in vitro si sviluppano normalmente. 1955 Vengono pubblicati i risultati relativi a quattro gravidanze ottenute utilizzando seme crioconservato.

1960s IVG Golden Age: grosso incremento delle conoscenze relative alla stimolazione ovarica, sulla maturazione degli ovociti, fecondazione, sviluppo degli embrioni in vitro e delle tecniche di laparoscopia.

1969 Si ottiene la prima fecondazione in vitro umana.

1977 Prima gravidanza da IVF, ectopica.

1978 Nascita di Louise Brown.

Competenze dell’embriologo

Un embriologo prima aveva le seguenti competenze:

• Conoscenze e sistemi di coltura che derivavano da modelli animali.
• Molti provenivano dalla ricerca di base.
• Embriologia sperimentale.
• Biologia cellulare.
• Veterinaria.
• Colture cellulari e microscopia.

Competenze di un embriologo clinico oggi sono:

• Fisiopatologia dell’infertilità maschile e femminile.
• Analisi e valutazione dei gameti.
• Colture cellulari.
• Micromanipolazione.
• Criopreservazione.
• Genetica.
• Biologia molecolare.
• Proteomica.
• Microbiologia e virologia.
• Endocrinologia.
• Gestione e organizzazione del laboratorio di riproduzione.
• Norme e decreti che regolano l’attività della PMA.

Lezione 2

Le Tecniche di Riproduzione Assistita (TRA) comprendono una serie di metodiche atte a superare eventuali condizioni presenti nella coppia che ostacolano completamente o parzialmente la possibilità di concepire naturalmente. La condizione di infertilità, definita come incapacità di concepire dopo due anni di rapporti intenzionalmente fecondi in età riproduttiva, interessa circa il 12-15% delle coppie. È quindi un problema di dimensioni sociali che oltre alla valenza sanitaria ne possiede altre di ordine psicologico, familiare, personale e relazionale. In Italia si stima che oltre 45.000 nuove coppie ogni anno siano destinate ad incontrare difficoltà riproduttive durante la loro vita coniugale. Queste coppie, nel loro insieme, rappresentano la cosiddetta popolazione infertile.

① Quindi nel caso di una popolazione infertile può essere suddivisa in 3 casi:

• Sterilità, cioè l’impossibilità di concepire spontaneamente. La sterilità maschile è legata all’assenza di spermatozoi nell’eiaculato o all’assenza dello stesso eiaculato; mentre la sterilità femminile è legata a problemi anatomici come assenza di utero, di tube, tube ostruite oppure a disordini ovulatori o endocrini.
• Subfertilità, in cui non c’è una impossibilità nel concepire ma è ridotta da un punto di vista probabilistico perché invece di ovulare normalmente ovuliamo un mese sì e due no e invece di avere un numero adeguato di spermatozoi ne abbiamo un numero particolarmente ridotto.
• Infertilità idiopatica, o sterilità idiopatica, è senza causa apparente cioè non sappiamo in realtà quale sia la reale causa. Coinvolge spesso il 20-25% dei casi di sterilità che noi osserviamo.

Ovviamente l’inizio della ricerca di figli è valida per una coppia in età giovane, mentre se consideriamo coppie diciamo di 40 anni il lasso di tempo nel tentare di fare un figlio sarà molto più breve.

Diagnosi sterilità: per il partner maschile abbiamo l’azoospermia, l’assenza di spermatozoi nell’eiaculato, l’anaeiaculazione, non si ha emissione del liquido seminario all’esterno, e l’eiaculazione retrograda, disturbo in cui l’eiaculato viene immesso nella vescica anziché fuoriuscire dall’uretra peniena, si ha comunque eiaculazione. Per il partner femminile riguardano disfunzioni anatomiche o ormonali. È una patologia.

Oggi è indicato che il valore minimo per essere considerato ancora normali è di circa 18 milioni di spermatozoi per ml tenendo presente che nella metà del secolo scorso una condizione normale era una condizione in cui l’uomo deve avere almeno 80 milioni di spermatozoi per ml.

Qual è la probabilità della gravidanza spontanea in coppie con infertilità idiopatica?

Tecniche di PMA

Tecniche di PMA, procreazione medicalmente assistita:

• STW - MESA - TESE, è una tecnica che permette il recupero degli spermatozoi dall’epididimo, organo che permette la maturazione finale degli spermatozoi. Andrò ad effettuare questa tecnica nel caso in cui mi trovassi di fronte un paziente che non emette spermatozoi, e attraverso un’indagine clinica, posso stabilire che probabilmente non li emette perché i dotti escretori sono occlusi. Quindi questo paziente produce spermatozoi ma se poi non ha la possibilità di riversarli all’esterno, io posso andare a recuperare nell’epididimo o nel testicolo gli spermatozoi.
• FIV o FIVET, fecondazione in vitro embriotransfer, cioè faccio la fecondazione in vitro e poi trasferisco l’embrione nell’utero.
• ICSI, Iniezione Intracitoplasmatica dello Spermatozoo, con questa tecnica si prende un singolo spermatozoo e attraverso l’utilizzo di micromanipolatori si inserisce lo spermatozoo all’interno dell’ovocita. Chiaramente nel momento stesso in cui gli spermatozoi e abbiamo recuperato dal testicolo, che vedremo essere spermatozoi immobili, l’unica possibilità di poter fecondare e vedere questo singolo spermatozoo è iniettarlo direttamente nell’ovocita.

N.B: se invece di avere un fattore maschile lieve moderato ho un fattore maschile severo, non posso usare la tecnica FIV ma devo usare la ICSI perché in questo caso gli spermatozoi sono immobili o si muovono male, quindi nonostante siano presenti nell’eiaculato abbiamo bisogno della tecnica ICSI per fecondare. Nel caso del fattore tubarico si utilizza invece la FIV perché l’ostacolo è rappresentato dalla tube che sono occluse, quindi l’ovocita non potrà scendere e lo spermatozoo non potrà salire, ma se prendo l’ovocita e dopo averlo fecondato lo riposiziono nell’utero il problema è risolto. Nel caso dell’infertilità idiopatica si possono fare entrambe, e ciò dipende dal caso, anche se molto spesso si preferisce la ICSI; poi nel caso dell’infertilità immunologica, cioè quando gli spermatozoi vengono riconosciuti e attaccati dagli anticorpi della donna perché considerati c