Tecniche avanzate di indagine biomedica

05/10/2017: 3 domande sugli argomenti esposti (esame orale)

Canali ionici

I canali ionici permettono la comunicazione delle cellule. I canali ionici sono presenti in tutte le cellule.

Kandel (premio Nobel 2000) scoprì la memoria cellulare sulla base di un sistema composto da canali ionici di potassio.

Studiando Aplysia californica (mollusco erbivoro) si notò che la sua sensibilità aumentava a stimoli successivi soprasoglia. Ciò è dovuto ad un circuito nei quali sono presenti dei canali ionici che sono controllati da cAMP. Fu la prima descrizione sulla memoria cellulare.

Peter Agre ha scoperto il canale dell’acqua “acquaporine”. Mackinnon fu il primo a cristallizzare i canali di un batterio, in modo da determinare le sue caratteristiche.

Ritmo circadiano: permette a tutti gli animali di adeguare la loro attività/non-attività alla fase diurna o notturna. Il nucleo soprachiasmatico è un nucleo dell’ipotalamo che sta alla base di molti processi ciclici nell’organismo, come sonno, veglia, emozioni. Questo nucleo riceve informazioni dalla retina e insieme ad altre informazioni gestisce vari tipi di regolazione nel corpo. La ghiandola pineale ha un’attività circadiana, ossia la sua frequenza di scarica nei neuroni si modifica durante il giorno. I canali ionici sono tra i mediatori di queste funzioni.

Per diminuire l’angina pectoris si cerca di rallentare il cuore.

Approccio allo studio e caratterizzazione dei canali ionici e loro funzioni

I canali ionici sono proteine transmembrana costituite tipicamente da una subunità Alfa formata dal poro di permeazione e da una o più subunità Beta con funzioni regolatorie, che consentono il passaggio degli ioni attraverso la membrana secondo potenziale elettrochimico. Essi possiedono altre proprietà fondamentali:

• Permeabilità: costituiscono una via a bassa energia che consente alle specie ioniche idratate di passare la membrana impermeabile agli ioni.
• Selettività: consente di discriminare tra diversi ioni in funzione di dimensione e carica. Si distinguono in altamente specifici, ad esempio i canali per il sodio consentono solo il passaggio per il sodio, e meno specifici, ad esempio i canali cationici che consentono il passaggio di sodio, potassio e calcio.
• Gating: processo attraverso cui un canale passa da una configurazione all'altra. Si distinguono in stato aperto: gli ioni possono passare. Stato chiuso: gli ioni non possono passare ma il canale può passare allo stato aperto. Stato inattivato: gli ioni non possono passare, il canale non può passare allo stato aperto.

Le diverse tipologie di canale ionico sono regolate da differenti tipologie di stimolo: differenza di potenziale attraverso la membrana, neurotrasmettitori o altre proteine regolatrici, ad esempio acetilcolina, acido glutammico, stimoli meccanici, ad esempio stiramento.

I canali ionici nella storia

L'esistenza di molti canali ionici è stata dedotta da flussi rilevabili di corrente elettrica dentro e fuori la cellula: conduttanze.

• 1963: Andrew Hodgkin e A. Huxley svilupparono la tecnica del voltage clamp, in cui descrissero le basi ioniche del potenziale d'azione, ottenendo il Premio Nobel per la medicina per la fisiologia che condivisero con John Eccles poiché è compreso il meccanismo ionico dell'impulso nervoso.
• 1991: Erwin Neher e Bert Sakman ottennero il Premio Nobel per la medicina e furono in grado di registrare la corrente che fluisce tra un singolo canale ionico grazie allo sviluppo della tecnica del patch clamp, che sfrutta un dispositivo di registrazione altamente sensibile, consente di isolare elettricamente un frammento piccolissimo della membrana, presumibilmente recante un singolo canale, mediante la punta di un microelettrodo di vetro cavo.
• 2003: Peter Agre e Roderick Mackinnon ottennero il Premio Nobel per la chimica poiché furono i primi a visualizzare un canale ionico.

Mentre alcuni canali ionici sono permanentemente aperti, altri lo diventano solo in risposta a particolari stimoli. Questa seconda categoria di canali è maggiormente responsabile della risposta cellulare a molti stimoli esterni e interni, poiché il flusso ionico che ne risulta scatena il meccanismo biochimico che produce la risposta tipica della cellula.

Modificazioni biochimiche dei canali ionici nella porzione citosolica, esempio fosforilazione, alterano la funzionalità degli stessi. Questi canali, funzionanti se accoppiati ad uno stimolo, possono essere canali voltaggio-dipendenti e canali a liganti.

Canali voltaggio-dipendenti

I canali voltaggio-dipendenti si aprono in risposta ai cambiamenti del potenziale di membrana in aree loro circostanti. Questo avviene solo quando il potenziale raggiunge un certo valore soglia. Parte della proteina costituente il canale è implicata nella ricezione dei cambiamenti di voltaggio, inducendo un cambio conformazionale.

I più studiati dei canali voltaggio-dipendenti sono provenienti dalle membrane delle cellule elettricamente eccitabili come i neuroni e fibre muscolari, dove sono essenziali nella genesi e propagazione dell'impulso elettrico e nella regolazione del rilascio di neurotrasmettitore dai terminali del neurone. Si rammentano principalmente:

• Canali del sodio voltaggio-dipendenti che sono altamente conservati e durante l'evoluzione conducono correnti entranti che si attivano in depolarizzazione, e presentano una subunità alfa formata da una singola catena polipeptidica organizzata in quattro domini, ognuno formato da 6 segmenti transmembrana omologhi connessi da linker intracellulari che si ripiegano a formare un canale centrale, subunità Beta ad azione regolatoria. Sono due nel canale cardiaco e la loro assenza o disfunzione causa una forma di sindrome di QT lungo che può portare a morte improvvisa. Si attivano molto velocemente, pochi millisecondi, e il loro stato aperto, chiuso, inattivato, è una funzione probabilistica del potenziale di membrana e si inattivano in depolarizzazione e si riattivano in iperpolarizzazione. Un ottimo modello di canale di sodio voltaggio-dipendente è riscontrabile negli organi elettrici dell'anguilla elettrica Electrophorus, uno dei soggetti prediletti dai neurofisiologi.
• Canali del calcio voltaggio-dipendenti sono tutti attivati in depolarizzazione, presentano una subunità Alfa formata da una singola catena polipeptidica organizzata in quattro domini, ognuno formato da 6 segmenti transmembrana, omologhi connessi da linker intracellulari che si ripiegano a formare un poro centrale. Possono avere diverse subunità accessorie che modulano le proprietà della subunità Alfa 1. Sono diversi per resistenza ai farmaci, entità della depolarizzazione necessaria per aprirli, rapidità con cui si inattivano, secondi o decine di millisecondi.
• Canali pacemaker si attivano in iperpolarizzazione, sono modulati sia dal voltaggio che dalla concentrazione intracellulare del secondo messaggero cAMP, da cui il nome della duplice modalità hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated channels. Permettono il passaggio di If, Funny current, non sono dunque selettivi per un particolare ione, ma conducono sia sodio che potassio con un rapporto di permeabilità pari a 3. Fanno parte della sottofamiglia dei canali di potassio voltaggio-dipendenti in quanto non presentano la struttura tipica; ciò che li distingue è la presenza di un segmento C-terminale del dominio di legame del nucleotide ciclico CNBD, che consente il legame per cAMP. I canali pacemaker sono inibiti selettivamente da Procoralan (ivabradina), principio attivo derivato dal verapamil utilizzato nell'angina stabile e nello scompenso cardiaco, con conseguente riduzione della frequenza cardiaca.

Canali a ligando

I canali a ligando invece si aprono rispondendo al legame con una molecola a livello del sito ad alta affinità per la stessa. L'interazione con la molecola induce un cambio conformazionale della proteina e il canale si apre. Come i canali voltaggio-dipendenti, i canali ligando si comportano in modo stocastico, cioè probabilistico. Tra i più diffusi si rammentano:

• Canali ionici aperti dall'acetilcolina: l'acetilcolina lega fisiologicamente i recettori colinergici, e si sono divisi in recettori nicotinici, attivati anche dalla nicotina ed inibiti dal curaro, un veleno; recettori muscarinici, attivati anche dalla muscarina e inibiti dall'atropina.
• Canali ionici aperti dall'acido glutammico: si rammentano due tipi di recettori canali non attivati dal NMDA, un canale permeabile al sodio e al potassio. È un canale attivato dalla NMDA, un canale permeabile al sodio e al potassio, ma anche al calcio. Non necessita della glicina per essere aperto, sempre presente in condizioni fisiologiche e a potenziale di riposo è bloccato dal magnesio intracellulare che viene rimosso a seguito della depolarizzazione.
• Canali ionici aperti dall'acido gamma aminobutirrico GABA: si rammentano due tipi di recettori: il GABA A è un recettore canale permeabile al cloro e GABA B agisce tramite messaggeri intracellulari.

Tecnica del patch-clamp per lo studio di canali ionici

È una tecnica molto utile per studiare l’attività dei canali ionici. Si utilizza per studiarne le proprietà e il loro significato funzionale.

I canali ionici svolgono varie funzioni in tutti i tipi cellulari, assumendo particolare importanza nel tessuto nervoso e muscolare dove sono deputati alla regolazione dell’eccitabilità cellulare. Ciò serve alla comprensione di numerosi fenomeni fisiologici o patologici e allo sviluppo di nuove terapie, farmaci in grado di attivare o bloccare i canali ionici.

In generale nelle cellule, la membrana plasmatica separa due compartimenti: componente intracellulare e componente extracellulare che presentano diverse concentrazioni ioniche. Confrontando le varie tabelle, si nota che il sodio è uno ione molto più concentrato all’esterno che all’interno. Il rapporto tra la concentrazione esterna e interna è mantenuto nei vari animali.

La membrana plasmatica è permeabile solo ad alcuni ioni, grazie ai canali ionici e dal momento che ognuno di essi porta con sé una carica elettrica, il risultato finale indotto da questa diversa permeabilità è la creazione di una d.d.p. ai lati della membrana che prende il nome di potenziale di riposo (-60/-90 mV).

V = V_in - V_out V_out = 0

Es. Canale selettivo per il potassio. Quando il canale è aperto il potassio, che è maggiormente concentrato all’interno, è sottoposto a due forze:

1. Gradiente di concentrazione che lo spingerebbe verso l’esterno.
2. Potenziale di membrana che invece tenderebbe a trattenerlo all’interno.

Ogni volta che il canale si apre, lo ione che permea dipende da 2 forze:

1. Gradiente di concentrazione.
2. Gradiente elettrico.

Se il gradiente elettrico vince sulla differenza di concentrazione, lo ione entra e viceversa. È il bilanciamento di queste due forze che determina l’entrata o l’uscita dello ione. Questo processo viene definito dall’equazione di Nernst:

[] = ln ( )[]

In base a questa equazione si può vedere il potenziale di equilibrio o di inversione. Al potenziale di riposo la corrente è zero, se si va verso potenziali più positivi, nel caso del potassio, sarà uscente; nel caso in cui siano più negative, sempre nel potassio, sarà entrante.

Equazione di Goldman Hodgkin Katz (GHK)

Per definire il potenziale di riposo, da un punto di vista teorico: equazione di Goldman Hodgkin Katz (GHK).

Il potenziale di riposo è una conseguenza di una permanente differenza di concentrazione ionica ai due capi della membrana. Questa è prodotta da:

• Una membrana selettivamente permeabile.
• Un trasporto attivo degli ioni Na⁺/K⁺.

Proprietà elettriche passive della membrana

La membrana plasmatica può essere ricondotta ad un circuito elettrico equivalente che comprende una resistenza R_m ed una capacità C_m, disposte in parallelo. Il condensatore è dato dalla membrana plasmatica. La resistenza è quella offerta al flusso ionico attraverso i canali. La capacità dipende dal potere dielettrico della fase lipidica.

Legge di Ohm

Corrente ionica: è definita come G_i.

• E = potenziale a cui io sto osservando la corrente.
• E_i = potenziale di inversione.

La conduttanza del singolo canale aperto si misura in singolo canale e si determina la conduttanza. Lo scopo nei vari esperimenti è quello di determinare la corrente I_i.

Tecnica del voltage-clamp

Questa tecnica consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche transmembrana generate a tale potenziale di membrana. È necessario bloccare il voltaggio perché la corrente e anche l’apertura/chiusura di molti canali dipende dal voltaggio.

La corrente attraverso il canale dipende da:

1. Permeabilità del canale: conduttanza, es. voltaggio-dipendenza.
2. Driving force, dovuta al potenziale elettrico attraverso la membrana e al gradiente di concentrazione degli ioni.

Es. Studiare una corrente di sodio di un canale voltaggio-dipendente che si attiva in depolarizzazione. Nel momento in cui un canale di sodio si apre, entrano degli ioni positivi all’interno della cellula e quindi la cellula si depolarizza. La depolarizzazione fa aprire altri canali ionici, si forma quindi un loop.

Vengono inserite due pipette di vetro con la punta tagliata, vi è continuità tra la soluzione all’interno dell’elettrodo e il citoplasma: elettrodo della corrente ed elettrodo del voltaggio. L’elettrodo del voltaggio porta il segnale ad un amplificatore differenziale, che può essere collegato ad un computer. Sapendo che per misurare, per esempio, la corrente di sodio, devo depolarizzare la cellula. Tramite il PC si può generare una corrente che viene iniettata all’interno della cellula per aumentare il voltaggio.

L’amplificatore confronta il potenziale della cellula con quello impostato dall’operatore e fa uscire una corrente che viene iniettata all’interno della cellula in modo da aumentare il potenziale. Si ha l’apertura dei canali di sodio permettendo l’entrata di altri ioni positivi nella cellula, andando ad aumentare il potenziale di membrana. Dall’amplificatore esce una corrente uguale e contraria a quella che si è generata dall’apertura dei canali di sodio, ed è quella che si va a misurare.

Slide: I_c è la corrente capacitiva. La corrente che si vede è data dalla corrente di sodio entrante e potassio uscente.

Limiti di voltage clamp

• Utilizzo di 2 pipette di vetro perché le cellule sono molto piccole, fatta eccezione per cellule relativamente grandi.
• Tecnica invasiva.
• Grande rumore di fondo.

Patch clamp

Utilizza una sola pipetta di vetro che misura sia la corrente che il voltaggio. Questa tecnica era stata sviluppata per studiare l’attività di un singolo canale e registrare le correnti ioniche che si formano solo in piccolo lembo di membrana plasmatica. Se la punta della pipetta aderisce bene alla membrana plasmatica si crea un sigillo ad alta resistenza e si possono misurare i canali ionici che si trovano solo in quel lembo di membrana.

Questa tecnica non permette di misurare solo le correnti in quella regione di membrana, ma anche in tutta la cellula. Viene utilizzata per studiare le correnti nei canali ionici ma anche i cambiamenti di voltaggio nella cellula. Vengono usati un solo amplificatore operazionale, una singola pipetta e un solo elettrodo con messa a terra.

Questo metodo permette di isolare elettricamente una piccola area (patch) di membrana dalla soluzione esterna e di misurare la corrente attraverso il canale/i localizzati nel patch. Ciò si ottiene premendo una pipetta di vetro, che è stata riempita con una soluzione elettrolitica adatta, contro la superficie di una cella e applicando un'aspirazione leggera. A seconda di cosa il ricercatore stia cercando di misurare, il diametro della pipetta è variabile, ma è comunque nell’ordine dei micrometri.

Sono stati sviluppati diversi tipi di configurazioni sperimentali:

• Cell-attached: mediante un micromanipolatore, si appoggia la pipetta sopra la cellula. Generando una pressione negativa, parte della cellula prende contatto con la pipetta e si forma il sigillo e si può quindi procedere alla misura dell’attività del canale/canali. Questa tecnica è molto difficile in quanto il noise elettrico può essere maggiore della corrente che si vuole misurare. Si può valutare la conduttanza del singolo canale o i meccanismi di apertura o chiusura. Si possono determinare cambiamenti a seguito di mutazione oppure come agiscono determinati farmaci. Slide corrente con cell-attached: si vedono dei gradini nel single channel. Utilizzando il macro-patch si ha la perdita del grafico a forma squadrata. Slide grafico macro patch.
• Inside-out: una volta la pipetta aderisce alla membrana, si solleva la membrana e si procede con lo studio di quel pezzettino di membrana. Questa tecnica permette di accedere alla parte intracellulare dei canali. Slide grafico macro patch: cAMP regola la corrente If, in quanto un aumento di cAMP porta ad un aumento di corrente If. Isolando un pezzetto di membrana, vi erano solo i canali If e mettendo all’esterno cAMP si è visto che in presenza di cAMP l’ampiezza della corrente aumentava.
• Whole-cell: configurazione più utilizzata. Si passa sempre da cell-attached e si cerca di creare una pressione negativa maggiore in modo da rompere il pezzettino di membrana e i lembi della membrana si legano alla pipetta e ciò permette all’elettrodo di essere in continuità con il citoplasma della cellula. Ciò permette di determinare le correnti di tutti i canali della cellula, ma anche cambiamenti nel voltaggio. Questa configurazione permette di calcolare quanto tempo la cellula impiega ad aprire il canale/chiudersi. È difficile discriminare la corrente di