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Riassunto microbiologia generale

Procarioti ed eucarioti

I domini sono tre grossi domini che includono tutte le specie organiche viventi: eucarya, archea, bacteria. La microbiologia è interessata a tutti e tre i domini perché i batteri fanno parte del dominio bacteria e alcuni del dominio archea, ma i funghi, le alghe e i protozoi fanno parte del dominio eucaria. Il nostro organismo è eucariote, ma è popolato da microrganismi. L'informazione genetica umana è minore di quella dei microrganismi nell'uomo e anche il numero di cellule dei microrganismi in generale è maggiore del numero di cellule eucariote.

Tassonomia

Scienza che si occupa della nomenclatura delle specie viventi. Per quanto riguarda la nomenclatura dei microrganismi si suddivide il nome in due parti, la prima che indica il genere e la seconda che indica la specie di appartenenza. Tradizionalmente i due regni principali erano piante e animali. Nel 1886 Haeckel creò il regno dei protisti. Nel 1938 Chatton suddivise in procarioti e eucarioti. Nel 1969 Whittaker suddivise i regni in monere (batteri), protisti, funghi, piante e animali. Nel 1990 Wose suddivise i regni in batteri, archei ed eucarioti. Le cellule sono state suddivise anche per il loro fenotipo, ossia l'insieme delle loro caratteristiche morfologiche e funzionali (attività della cellula).

Cellula procariote

La cellula procariote è molto più piccola (0,2-0,3 micrometri ovvero meno di 10 m) della cellula eucariote (100-150 micrometri ovvero 10 m). La cellula procariote è rivestita di una parete cellulare, che è lo strato esterno rigido, a composizione chimica variabile, presente in molti microrganismi, ma in tutti i funghi e piante. Sotto la parete troviamo la membrana cellulare, strato di lipidi e proteine che circonda il citoplasma, che rappresenta, per le cellule prive di parete, il confine tra la cellula e l'ambiente circostante. Il citoplasma contiene organuli, enzimi, sostanze chimiche e rappresenta il sito di gran parte dell'attività metabolica della cellula (è ricco di ribosomi che sintetizzano le proteine). Il materiale nucleare può essere RNA o DNA (in gran parte delle cellule, ma non nei batteri) ed è racchiuso da una membrana nelle cellule eucariote, mentre nei procarioti non è separato né da una membrana né da un nucleo. La mitosi è la caratteristica riproduzione asessuata dei batteri e molte altre cellule procariote (per gli eucarioti si ha la meiosi, riproduzione sessuata).

• Interfase
• Profase: la cellula possiede due serie di cromosomi, una proveniente da ciascun genitore. Ognuno dei quattro cromosomi si è replicato. I due figli di ciascun cromosoma sono ancora uniti assieme.
• Metafase: i cromosomi si allineano lungo l'asse centrale della cellula.
• Anafase: i due cromosomi figli si separano.
• Telofase: la cellula si divide.
• Interfase: le due cellule figlie sono ora pronte a replicare i propri cromosomi per ripetere il processo mitotico.

I più comuni sono i bacilli, i cocchi, i vibrioni e gli spirilli. I plastidi sono presenti solo nelle cellule vegetali. Una cellula eucariote come il lievito possiede una parete cellulare.

Cellula eucariote

Deriva da una simbiosi spinta tra due organismi: uno procariote ed uno eucariote. Il materiale genetico non è contenuto solamente nel nucleo, ma anche nei mitocondri, che assomigliano a dei batteri e sono le centrali energetiche della cellula. Nelle cellule vegetali il materiale genetico si trova anche nei cloroplasti. Si pensa che la formazione delle cellule eucariotiche sia partita dalla mitosi di singole forme di progenota (singole forme che si evolvono indipendentemente) che hanno originato i prebatteri e i prearchea. Queste due nuove forme si sono evolute in protobatterio (con esteri in membrana, che origina anche le alghe) e in protoarchea (con eteri in membrana). Dalla loro fusione si è formato il ceppo dei preeucarya (con esteri in membrana), evoluti in eucarya con nucleo e poi con mitocondrio (simbiosi tra un protobatterio e un eucarya primitivo) e anche nelle cellule delle piante, con i cloroplasti. In pratica quindi la cellula eucariote è compartimentata.

• Interfase
• Profase 1: le due coppie iniziali di cromosomi omologhi (ciascun cromosoma si è replicato) si allineano al centro della cellula
• Metafase 1: mentre i due cromosomi sono appaiati si possono verificare "crossover" con scambio di DNA tra i cromosomi
• Anafase 1: i cromosomi omologhi si separano
• Metafase 2: si formano due cellule, ciascuna contenente due serie di cromosomi
• Anafase 2
• Telofase 2: le cellule figlie si dividono nuovamente mediante mitosi dando così origine a quattro cellule, ciascuna con metà del corredo cromosomico. Queste cellule aploidi sono i gameti, cellula uovo o cellule spermatiche.

Classificazione dei microrganismi

Tutti i microrganismi hanno un optimum di crescita: velocità massima di crescita in un tempo minimo a determinate condizioni di pH, T, P, H2O libera, presenza di O2. I microrganismi termofili e ipertermofili non presentano un doppio strato fosfolipidico della membrana esterna, ma uno strato unico in cui le molecole sono saldate (membrana rigida) e presentano una serie di proteine accessorie che aiutano le altre nel folding a temperature elevate. L'attività dell'acqua è un rapporto tra la pressione di vapore sulla soluzione e la pressione di vapore su acqua pura (distillata, deionizzata), che fornisce la disponibilità di acqua libera (AW) ossia non legata a nessuna molecola.

Pressione di vapore = AW pressione di vapore di riferimento, ovvero acqua. Quando AW = 1 si ha totale disponibilità di acqua libera nel microrganismo. Es. un alimento sotto sale ha valori di AW sotto 0,8-0,7. I microrganismi alofili estremi possono crescere con elevate concentrazioni saline e in generale con bassa disponibilità di acqua libera.

Il microscopio

È costituito principalmente da due gruppi di lenti:

• Oculari: dove appoggio gli occhi, che possono ingrandire fino a 10 volte.
• Obiettivi: gruppo più importante e vicino al campione da analizzare. Possono ingrandire il campione fino a 100 volte.

I batteri si vedono anche da 50x, il lievito anche da 40x. L'ingrandimento complessivo avvicinando le due lenti è 1000x. La sorgente luminosa proviene da basso e una serie di lenti direziona la luce in un punto sul vetrino. Il microscopio ha delle viti per il controllo micrometrico (spostamento in verticale) e macrometrico. Se devo ingrandire utilizzo molta più luce (diaframma aperto) e quindi le lenti oltre ad ingrandire devono avere una buona apertura numerica: angolo massimo di ampiezza (u) compreso tra l'asse ottico e il raggio più esterno che può venire raccolto dall'obiettivo.

Se c'è dell'aria (immersione non omogenea) i raggi luminosi vengono deviati e quindi vanno persi. È preferibile quindi utilizzare piccoli ingrandimenti. Se uso un fluido che ha la stessa rifrazione del vetro il raggio non viene deviato e aumenta la risoluzione (immersione omogenea). Il potere risolutivo è la capacità di distinguere due oggetti vicini tra loro: λ/d = n.A. eb = apertura numero dell'obiettivo e n.A. cond = apertura numerica del condensatore.

Più l'obiettivo si avvicina al vetrino più si ingrandisce il diaframma e quindi l'immagine sarà maggiore (passa più luce). Più l'obiettivo si allontana e meno ingrandisco perché diminuisce l'apertura del diaframma (passa meno luce). La rifrazione della luce dipende dall'angolo di incidenza, dal grado di curvatura della lente e dalla densità della luce. 'Indice di rifrazione = (seno dell'angolo incidente)/(seno dell'angolo di rifrazione)'. Quindi, il microscopio ottico è basato su un sistema di lenti e vista la minima grandezza dei microrganismi, se questi vengono attraversati da un fascio di luce grande non si riescono a vedere perché diventano trasparenti, per cui i microrganismi devo essere colorati.

Il microscopio ottico a contrasto di fase garantisce un'osservazione più veloce, riesco a distinguere il microrganismo in cui si trova evitando di colorarlo (perché quando vengono colorati muoiono) poiché trasforma un oggetto di fase in un oggetto di ampiezza (quello in fase diventa trasparente a contatto con il raggio luminoso, mentre quello di ampiezza è visibile).

• Diaframma anulare: la luce passa attraverso il condensatore e viene convogliata al vetrino (forma di anello).
• Anello di fase: vetro trasparente, i raggi che non colpiscono nulla vengono convogliati nella zona più spessa. I raggi che colpiscono vengono convogliati nella zona sottile.
• I raggi diretti sono ritardati o accelerati di ¼ la lunghezza d'onda quando passano nell'anello di fase.
• Piastra di fase: piastra su cui è presente l'anello di fase. Molti raggi passano attraverso la piastra di fase senza modifiche, evitando l'anello di fase.

Due raggi luminosi in fase che si incontrano si uniranno a dare un raggio con un'ampiezza uguale alla somma delle ampiezze dei singoli raggi. L'ampiezza di contrasto varia in funzione dei raggi che possono essere in fase o in inversione di fase. Immagini luminose in background scuro sono il risultato di raggi in fase; immagini scure in background luminoso sono il risultato di raggi in inversione di fase.

Membrana, sistemi di trasporto e parete cellulare

Membrane cellulari

La membrana cellulare è una struttura che divide l'ambiente interno della cellula dall'ambiente esterno. La struttura è comune in tutti i viventi e la costituzione prevede come componente principale i fosfolipidi: molecole formate da unità di glicerolo, polialcol (3OH), due legami esteri con acidi grassi. La membrana degli archea può essere a doppio strato lipidico o mono strato lipidico di tetraedri. Nel caso del mono strato lipidico il fosfolipide è il bifitanile che ha due teste polari alle due estremità opposte (nel doppio strato lipidico si ha il fitanile).

Funzioni della membrana

• Barriera permeabile: rappresenta una superficie attiva e selettiva per il trasporto di nutrienti e metaboliti nella cellula e fuori dalla cellula.
• Sito di ancoraggio: di proteine coinvolte nel trasporto, nel metabolismo e nella chemiotassi.
• Conservazione dell'energia: sito di generazione e mantenimento della forza protone-motrice. Gli agenti disaccoppianti uniscono le cariche e causano la morte della cellula.

Sistemi di trasporto

Per dissociare un acido organico (gruppo carbossilico COOH) la cellula utilizza un pH molto più acido (HCl). Gli acidi organici stabilizzano l'alimento e sono caratteristici degli alimenti fermentati. Il trasporto di molecole o ioni può avvenire:

• Diffusione:
  • Attraverso la membrana
  • Attraverso un poro presente sulla membrana
  • Diffusione facilitata (uniporto)
• Trasporto secondario:
  • Simporto: i protoni trasportano una molecola o uno ione nella cellula. Non esce niente, a parte gli ioni H⁺ che vengono espulsi, con dispendio di energia, per ripristinare l'equilibrio di cariche.
  • Antiporto: esce la molecola con elevata concentrazione (il lattosio scisso in galattosio e glucosio. Nella cellula rimane il glucosio ed esce il galattosio). Uno entra e uno esce.
• Sistema ABC: detto ATP-binding questo sistema sfrutta un enzima specifico per una molecola per farlo arrivare su un sito di ancoraggio ancorato nella membrana, regolato da una proteina all'entrata della cellula. Questo scambio consuma ATP in ADP+P.
• Traslocazione di gruppo: PEP-PTS (PEP= fosfoenolpiruvato; PTS= fosfotransferasico). È un trasporto che avviene coinvolgendo gruppi di proteine (solitamente 5). Una proteina è localizzata transmembrana e le altre svolgono funzioni. Nel caso del trasporto di uno zucchero nella cellula: lo zucchero viene fosforilato, dal gruppo PEP, che diventa piruvato, con dispendio di energia e dopodiché il gruppo fosfato viene donato ad uno degli enzimi PTS in modo contiguo fino all'arrivo dello zucchero nella cellula. Ogni trasporto è specifico, così la cellula sceglie cosa entra e cosa esce.

La parete cellulare

Ha una funzione prettamente strutturale e protettiva, conferisce rigidità e forma ed è formata da polimeri insolubili in acqua. Il lievito pur essendo un eucariote ha una parete cellulare diversa da quella dei batteri.

Tipologia di struttura nei batteri

• GRAM (+): possiedono una parete monostrato, di densità uniforme formata soprattutto da peptidoglicano. Dall'esterno verso l'interno: parete (spessa e periplasmatico), membrana e citoplasma.
• GRAM (-): possiedono una parete a doppio stato formata da uno strato sottile di peptidoglicano e da una membrana esterna. Dall'esterno verso l'interno: membrana esterna (doppio strato fosfolipidico), spazio periplasmatico, strato di peptidoglicano, membrana interna, citoplasma.

Peptidoglicano

Il peptidoglicano è formato da peptidi + zuccheri (amminozuccheri). Si tratta di polimeri inclinati di NAG (N-acetil-glucosammina) e NAM (acido N-acetil-muramico). Al NAM si legano 4 amminoacidi (catena tetrapeptidica) e si forma un legame peptidico tra due catene degli amminoacidi. In questo modo la struttura risulta ordinata ed organizzata. Il legame beta 1-4 è rotto dall'enzima lisozima, che è in grado di idrolizzare la parete cellulare e controlla lo sviluppo dei microrganismi presenti in un ambiente. Le cellule batteriche se poste in un ambiente acquoso interagiscono per osmosi con l'acqua.

• Soluzione ipotonica: la concentrazione dei sali è maggiore nella cellula per cui l'acqua comincia ad entrare nella cellula batterica, fino a farla esplodere.
• Soluzione isotonica: (fisiologica 9 g/L di NaCl). La parte viene digerita dal lisozima e il contenuto della cellula fuoriesce dalla parte. Si crea il protoplasto.

I GRAM(-) sono più fragili perché contengono poco peptidoglicano e sono anche meno sensibili alla colorazione.

Antibiotici

Le molecole antibiotiche sono prodotte da microrganismi e sono attive contro i microprocarioti (sono specifici) e funzionano solo su microrganismi in fase di crescita. Sono permeabili alle membrane e quindi entrano nella cellula senza sistemi di trasporto.

Diversi tipi di antibiotici

• Battericida: ad alte concentrazioni uccidono i microrganismi.
• Batteriostatica: bloccano i meccanismi vitali della cellula (sintesi della parete: penicillina o la vancomicina che si lega ad un dipeptide come D-Ala-D-Ala e blocca l'attività della cellula).
• Biocida: interagiscono con molte strutture della cellula: non ha un bersaglio preciso. Esempio la candeggina (ipoclorito di sodio).

Sistemi di trasporto che aumentano la resistenza del microrganismo

1. Cambio del bersaglio dove si va a legare l'antibiotico: modifica target (cambio del sistema enzimatico o della sequenza amminoacidica es: D-Ala-D-Ala in D-Ala-D-Lat per resistere alla vancomicina). Il problema si presenta se avviene uno scambio genetico tra un batterio patogeno e uno non patogeno, che acquisisce la resistenza.
2. Si smonta la struttura antibiotica: per la penicillina alcuni batteri hanno l'enzima b-lattanasi che rompe l'anello b-latturonico.
3. Sistemi di trasporto per espellere le molecole tossiche (efflusso).

È importante ricordare che l'antibiotico non guarisce, ma riduce la carica batterica riducendo la capacità del microrganismo di replicarsi. Se ad esempio ho un microrganismo che cresce a 4°C e uno che cresce a 30°C e metto l'alimenti in frigo aggiungendo poi la penicillina, questa andrà a combattere il batterio che sta proliferando (quella che cresce a 4°C), mentre non attaccherà quello che non si sta replicando.

Colorazione di Gram

Attraverso la colorazione si possono distinguere se si tratta di un GRAM(+) o un GRAM(-). Si osserva con il microscopio ottico.

1. Si mette con l'ansa il microrganismo sul vetrino.
2. Si lasci asciugare.
3. Si passa il vetrino su una fiamma per fissarlo.
4. Si colora.

La fase di colorazione comprende 5 passaggi:

1. Colorazione primaria: dopo aver preparato lo striscio si tratta il campione con il cristalvioletto.
2. Mordente: si copre il preparato con una soluzione di ioduro di potassio e iodio che si complessa sia con il cristalvioletto che con il materiale cellulare.
3. Decolorazione: si "lava" con qualche goccia di etanolo per lavare via il colorante superfluo.
4. Lavaggio con acqua.
5. Colorazione di contrasto: tratto il preparato con safranina. La seconda colorazione si fa perché nella fase di decolorazione i GRAM(+) mantengono il colorante fissato sulla parete (insolubile in H2O), mentre i GRAM(-) hanno il colorante che è fissato sulla membrana esterna e quindi quando passa l'etanolo porta via lo strato fosfolipidico con il colorante. Per questo utilizzo la safranina, un colorante rosa che ridà colore ai GRAM(-) decolorati, mentre non cambia il colore dei GRAM(+) che rimangono violetto.

Parete dei GRAM(+)

Sulla superficie della membrana si trovano acidi lipoproteici:

• Acidi teicoici: molecole che conferiscono carica negativa alla superficie della cellula, dovuta al legame estere del fosforo. Sono legati covalentemente al gruppo 6-ossidrile dell'acido muramico.
• Acidi lipoteicoici: sono uguali agli acidi teicoici con la differenza che "sfondano" la membrana di peptidoglicano, arrivando alla membrana plasmatica.
• Acidi teicuronici: sono in forma ciclica e non hanno il gruppo fosforico.

Parete dei GRAM(-)

Presentano lipopolisaccaridi (LPS) riconosciuti come endotossine.