Riassunto esame Istologia, prof.ssa Barni Luisa, libro consigliato Istologia, Monesi

Citologia ed istologia

Strumenti e tecniche per l’allestimento e l’osservazione di preparati istologici

Vi sono tre tipi di analisi di cellule e tessuti:

• Analisi morfologica: Serve a studiare la forma, la dimensione e l’organizzazione strutturale della cellula e dei costituenti extracellulari. A tal fine si utilizza il microscopio.
• Analisi biochimica: Studia la natura chimica delle cellule e dei tessuti.
• Analisi funzionale: Studia le modalità di funzionamento di cellule e tessuti.

Analisi morfologica

È suddivisa in due modalità:

• Metodi per l’osservazione diretta: Danno un’immagine reale delle cellule e tessuti ma hanno lo svantaggio che quando le cellule o frammenti di tessuto isolati dall’organismo di cui fanno parte sopravvivono a breve.
• Metodi per l’osservazione di preparati fissati e colorati: Sono usati più frequentemente per ovviare al problema e ai limiti dell’osservazione diretta.

L’analisi morfologica si avvale del microscopio.

Microscopio ottico

L’esame al microscopio ottico è condizionato da tre parametri:

• Potere di risoluzione: È la distanza minima alla quale due punti risultano distinti.
• Ingrandimento: È il rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio e la dimensione reale dell’oggetto.
• Contrasto: Dipende dalle differenze di assorbimento della luce da parte dei preparati osservati. La gran parte dei componenti cellulari risultano trasparenti nella regione dello spettro visibile, in quanto la cellula ha un alto contenuto di acqua. Per questo motivo vengono usati i coloranti istologici che colorano i vari componenti cellulari.

Data una certa risoluzione, l’ingrandimento assicura che tutti i dettagli siano riconosciuti. Ma se due oggetti non sono abbastanza distinti tra loro (potere di risoluzione) l’ingrandimento andrà a peggiorare la nitidezza dell’immagine. Il potere di risoluzione massimo di un microscopio ottico è 0,25 micrometri due punti per poter essere distinti devono trovarsi ad una distanza tra loro superiore a 0,25 micrometri.

Il microscopio ottico si basa sul fatto che un fascio di luce attraversa il materiale analizzato e l’immagine ottenuta, passando attraverso le lenti, giunge ingrandita all’occhio dell’osservatore. Per questo il materiale da analizzare deve essere attraversabile dalla luce. Per ottenere ciò occorre effettuare delle sezioni dei tessuti con uno spessore di 5-10 micrometri.

Microscopia elettronica

Si usa per lo studio della morfologia ultrastrutturale dei tessuti e ha un potere di risoluzione di 0,4 nanometri. Si basa sull’uso di un fascio di elettroni, emessi da un filamento di tungsteno, accelerati nel vuoto da un potenziale elettrico. Al posto delle lenti vi è un campo elettromagnetico che ha lo scopo di deflettere gli elettroni.

Esistono due tipi di microscopio elettronico:

• Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
• Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Il SEM ha un potere risolutivo più basso rispetto al TEM (circa 10 nanometri) ma consente di valutare la superficie e il rilievo degli oggetti. Si usa per studiare la superficie cellulare. La differenza tra i due consiste nel fatto che il TEM fornisce un’immagine dovuta all’attraversamento delle strutture da parte degli elettroni, mentre il SEM si basa sul principio di un’immagine riflessa dovuta al rimbalzo degli elettroni sulla superficie.

Micrografia ottenuta al microscopio elettronico a scansione (SEM) di un coniugato formato da una cellula di Candida albicans e una cellula Natural Killer (NK)

Preparazione del campione biologico

Fissazione

Dato che le cellule dei tessuti non sopravvivono a lungo al di fuori dell’organismo sono state messe a punto procedure di fissazione che conservano la struttura del campione biologico. La procedura va eseguita quanto prima dal prelievo del materiale dall’organismo; inoltre essa implica la morte delle cellule e la denaturazione delle proteine. I fissativi più usati sono:

• Alcol metilico
• Alcol etilico
• Aldeidi: formaldeide (per microscopia ottica) e glutaraldeide (per microscopia elettronica).

Il campione va mantenuto nel liquido di fissazione per un tempo variabile, in base al fissativo usato, da pochi minuti a uno o due giorni. Un’alternativa alla fissazione è il congelamento veloce con immersione di piccoli volumi di materiale biologico in azoto liquido (-196°C) con un congelamento praticamente istantaneo.

Inclusione e sezionamento

L’inclusione serve a preparare il campione per la fase successiva che è la sezione. Per poter osservare un frammento biologico al microscopio questo deve essere sezionato in sezioni sottili di 3-10 nanometri di spessore. Non si possono però effettuare sezioni così sottili su tessuto fresco perché la loro consistenza non è adeguata. Quindi si deve includere il frammento in un materiale di adeguata consistenza. Più frequentemente si usa la paraffina. Il tessuto deve essere prima sottoposto a sostituzione dell’acqua che contiene, prima con alcol etilico e poi con un solvente della paraffina (xilolo). Quindi il frammento viene immerso nella paraffina fusa. Una volta che la paraffina si è solidificata si può procedere alla sezione. Per questo si usa uno strumento chiamato microtomo.

Se invece usiamo un tessuto precedentemente congelato, questo ha già la consistenza adeguata per essere sezionato usando un microtomo particolare detto criostato. La sezione congelata viene quindi rapidamente scongelata e colorata per essere osservata.

Colorazione

La maggior parte dei coloranti usati in istologia è data da molecole idrosolubili e quindi disciolte in acqua.

• Coloranti basici: ematossilina ha affinità per le molecole acide come ad esempio il DNA (strutture basofile).
• Coloranti acidi: eosina si legano a molecole basiche, come ad esempio molte proteine citoplasmatiche (strutture acidofile). La combinazione più usata è la miscela ematossilina-eosina nella quale l’ematossilina colora in blu la cromatina del nucleo e l’eosina colora in rosa-rosso alcune parti del citoplasma.

Altri tipi di colorazioni sono:

• Colorazione tricromica: È un metodo di colorazione istologica che utilizza due o più coloranti acidi insieme a un poliacido. La colorazione differenzia i tessuti colorandoli in colori contrastanti. Così si aumenta il contrasto delle caratteristiche microscopiche nelle cellule e nei tessuti, il che le rende più facili da vedere se osservate al microscopio. La parola "tricromica" significa "tre colori". Il primo protocollo di colorazione è stata la colorazione tricromica di Mallory, che colora in modo differenziato gli eritrociti con un colore rosso, il tessuto muscolare con un colore rosa e il collagene con un colore blu.
• Colorazione di Giemsa: Si basa sulla differenziazione dei costituenti cellulari che hanno reazione basica, i quali fissano l'eosina (acida) colorandosi in rosso-arancio. Gli altri componenti cellulari aventi reazione acida si colorano in blu, con i prodotti di ossidazione del blu di metilene azzurri (basici).

Immunoistochimica e immunofluorescenza

Queste metodiche permettono di visualizzare specifiche macromolecole (antigeni) utilizzando anticorpi che le riconoscono e sono coniugati con molecole “visibili”. L’immunoistochimica sfrutta la capacità degli anticorpi di distinguere differenze anche minime tra una proteina e l’altra. Gli anticorpi si legano infatti alle proteine in modo specifico. Iniettando in animali la proteina da studiare induciamo i loro linfociti a reagire contro questa proteina a loro estranea (antigene), producendo anticorpi che specificamente la riconoscono. Da sangue di questi animali è possibile isolare gli anticorpi prodotti da vari cloni linfocitari (anticorpi policlonali) ed usarli per studiare tessuti in cui l’antigene deve essere localizzato. Si può anche fare una coltura in vitro dei linfociti dell’animale immunizzato, per ottenere la selezione dei singoli cloni linfocitari attivati a produrre anticorpi contro diverse porzioni della molecola iniettata. In tal modo è possibile produrre in vitro una quantità illimitata di anticorpi specifici, gli anticorpi monoclonali. In questa metodica l’anticorpo si lega all’antigene ma essendo esso stesso una molecola non è visibile. Dobbiamo quindi rendere visibile l’anticorpo per cui questo può essere modificato attraverso il legame ad esso di molecole dette fluorocromi: questi, se colpiti da raggi di luce dello spettro non visibile dall’occhio umano (come ad esempio l’ultravioletto), diventano visibili: il preparato rimarrà al buio salvo che nei punti in cui si è legato l’anticorpo fluorescente (microscopio a fluorescenza).

Gli anticorpi possono essere resi visibili anche associando loro un enzima ed usando come marcatore l’attività enzimatica legata all’anticorpo. Questo metodo consente di studiare il preparato con un normale microscopio a luce visibile e quindi di avere un’illuminazione di tutto il preparato.

La cellula

Introduzione

La cellula è l’unità fondamentale degli organismi viventi. La cellula eucariota è caratterizzata dalla suddivisione del protoplasma in due parti separate dall’involucro nucleare:

• Nucleo: Contiene la cromatina, uno o più nucleoli e il DNA. Di solito è situato centralmente ed è generalmente unico. Oltre a permettere la riproduzione della cellula, dirige e controlla le attività citoplasmatiche.
• Citoplasma: Contiene gli organuli cellulari specializzati in specifiche funzioni. È la sede di tutte le funzioni connesse con la vita cellulare.

La cellula è poi avvolta dalla membrana plasmatica, che regola gli scambi con l’ambiente esterno. La forma e le dimensioni variano da cellula a cellula. In generale negli organismi pluricellulari le cellule hanno dimensioni tra 20 e 30 micrometri e quindi sono visibili solo al microscopio. Alcune cellule sono anche capaci di movimento, distinto in tre tipi: movimento ameboide (presente soprattutto nei protozoi, che comprendono i batteri e le alghe), il movimento ciliare e il movimento per flagelli.

La membrana plasmatica

Viene chiamata anche membrana plasmatica o plasmalemma. È costituita fondamentalmente da lipidi che determinano la sua grande fluidità. I lipidi più rappresentati sono i fosfolipidi, formati da una testa polare idrofilica, diretta verso la superficie esterna ed interna della membrana (quindi verso la sostanza extracellulare e verso il citoplasma, entrambi di natura acquosa) e da una coda apolare idrofobica, orientata verso l’interno della membrana a doppio strato lipidico.

Al microscopio elettronico la membrana plasmatica, in sezione trasversale, appare costituita da due strati esterni densi, di 2 nanometri di spessore, corrispondenti alle teste polari, e uno strato intermedio chiaro, di 3,5 nanometri, che corrisponde alle catene alifatiche apolari. Al microscopio elettronico si può notare come la componente proteica può spostarsi lungo il piano della membrana in quanto la componente lipidica ha una consistenza molto fluida ("organizzazione a mosaico fluido").

Altri componenti importanti della membrana sono le proteine che determinano le funzioni della membrana. Sono di due tipi:

• Proteine intrinseche o integrali: Alcune attraversano completamente la membrana sporgendosi sia sul lato esterno che interno (proteine transmembrana) mentre altre possono essere immerse in parte nello strato lipidico e in parte sporgere su uno solo dei due versanti.
• Proteine estrinseche o periferiche: Sono associate alla superficie esterna o interna del doppio strato lipidico.

Alcune glicoproteine di membrana svolgono la funzione di recettore per cui riconoscono e legano ligandi, molecole dello spazio extracellulare, con lo scopo di trasmettere informazioni all’interno della cellula. Quando il recettore lega il ligando viene indotto un cambiamento conformazionale del recettore che determina l’attivazione di vari eventi intracellulari allo scopo di modificare l’attività della cellula.

Vi sono tre tipi di recettore:

• Recettori a sette domini transmembrana accoppiati a proteine G
• Recettori ad attività enzimatica intrinseca
• Recettori annessi a canali ionici

I recettori a sette domini transmembrana sono i più numerosi. Sono molecole con una lunga catena polipeptidica organizzata in una struttura transmembrana a serpentina. Quando il ligando lega l’estremità che sporge all’esterno della cellula induce una modificazione del recettore stesso a livello intracellulare che fa sì che questo leghi una proteina G che si attiva per cui una delle subunità della proteina G, che si dissocia dal recettore, va ad aprire un canale ionico o ad attivare un enzima di membrana.

I recettori ad attività enzimatica intrinseca hanno un dominio extracellulare che lega il ligando, e un dominio intracellulare. Il legame del ligando a un recettore associato ad un enzima porta all’attivazione dell’enzima intracellulare. I recettori annessi ai canali ionici, quando legano il ligando, determinano l’apertura del canale stesso.

Un importante compito della membrana plasmatica è il trasporto di molecole dall’esterno all’interno della cellula e viceversa. Il trasporto di membrana avviene in due modi: trasporto passivo (secondo il grado di concentrazione del soluto senza consumo di energia) e trasporto attivo (contro il gradiente di concentrazione e con consumo di energia).

Trasporto passivo

Si svolge con due modalità:

• Diffusione semplice: Le molecole, di piccole dimensioni e liposolubili (devono attraversare la membrana che è lipidica), entrano ed escono dalla cellula liberamente dal compartimento con maggiore concentrazione di soluto a quello con concentrazione minore. Degli esempi sono le molecole gassose, come l’ossigeno e l’anidride carbonica, e piccole molecole idrofobiche come l’etanolo e l’ammoniaca.
• Diffusione facilitata: È mediato da specifiche proteine transmembrana che permettono il passaggio di molecole idrosolubili e atomi con carica elettrica come gli ioni (idrogeno, sodio, potassio, cloro, calcio, ecc.). Queste proteine sono di due tipi: le proteine trasportatrici o vettrici e le proteine canale. Esse sono specifiche per il tipo di molecola che trasportano. Il trasporto tramite proteine transmembrana prevede inoltre il fenomeno della saturazione: aumentando la concentrazione della molecola viene raggiunta una saturazione della proteina vettrice oltre la quale la velocità del trasporto non aumenta ulteriormente. Le proteine canale invece consentono il passaggio degli ioni liberi: queste proteine formano dei pori idrofili e selettivi che fanno passare solo gli ioni con carica e dimensione adeguata.

Trasporto attivo

Avviene contro un gradiente di concentrazione ed elettrico e comporta dispendio di energia. Anch’esso è mediato da proteine transmembrana, è saturabile e selettivo.

Un esempio è dato dalla pompa Na/K ATPasi che mantiene le differenze di concentrazione ionica all’interno e all’esterno della cellula. Infatti l’interno della cellula ha bassa concentrazione di Na⁺ ed elevata concentrazione di K⁺, mentre l’esterno della cellula ha un’elevata concentrazione di Na⁺ e di Cl^- e una bassa concentrazione di K⁺. La pompa trasporta fuori dalla cellula il Na⁺ (contro gradiente) e all’interno il K⁺ usando molecole di ATP per ricavare energia.

Ovviamente le molecole di grosse dimensioni non possono utilizzare queste modalità di trasporto. Queste entrano nella cellula per endocitosi ed escono dalla cellula per esocitosi con trasporto mediato da vescicole.

Endocitosi

L’endocitosi permette l’ingresso selettivo di molecole che legano in modo specifico i recettori di membrana. Il legame attiva la proteina clatrina che riveste il versante citoplasmatico della membrana, formando delle piccole invaginazioni, dette fossette rivestite, che inglobano il complesso recettore-ligando. La membrana poi si introflette formando vescicole rivestite di clatrina che poi si staccano dalla membrana. Le vescicole perdono allora il loro rivestimento di clatrina e si fondono con l’endosoma dove depositano il loro contenuto.

La pinocitosi internalizza in modo aspecifico le molecole disciolte nel liquido extracellulare. Può avvenire in due modi:

• La macropinocitosi determina la formazione di protrusioni della membrana plasmatica che poi si fondono tra loro formando vescicole all’interno del citoplasma.
• L’endocitosi mediata da caveolina determina la formazione di piccole invaginazioni della membrana che poi si staccano e riversano il loro contenuto dentro a cellula o fuori, dopo aver attraversato completamente la membrana (transcitosi).

L’ultima modalità di endocitosi è la fagocitosi che permette l’internalizzazione di grosse particelle. Questa è svolta soprattutto dai fagociti (macrofagi e granulociti neutrofili) che inglobano batteri e cellule apoptotiche. È un processo specifico e mediato da recettori. Comporta la formazione di protrusioni di membrana che circondano il materiale da fagocitare e lo inglobano in un fagosoma che viene poi indirizzato ai lisosomi dove avviene la degradazione e digestione delle sostanze fagocitate.