Riassunto esame Genetica molecolare

Genetica molecolare

Articolo scientifico

• Scritto con linguaggio formale.
• Obiettivo: rendere disponibile per tutti una serie di dati ottenuti da studi ed esperimenti.
• Alcuni includono i risultati di esperimenti mirati.
• Gli autori possono anche fornire una propria interpretazione riguardo a ciò che le nuove informazioni forniscono e come contribuiscono alla comprensione di come il mondo naturale funziona.
• Pubblicato in giornali.
• Sottoposto ad una revisione paritaria prima di essere pubblicata, in modo che altri esperti possano valutarlo e magari anche raccomandare alcuni esperimenti in più in modo da supportare meglio ciò di cui si sta trattando.

Processo di revisione paritaria

Reviewers (2 o più). Lo leggono, lo analizzano e valutano se le conclusioni sono supportate dalle prove e se gli studi sono innovativi, importanti ed interessanti: valutano inoltre il disegno sperimentale e i dati presentati, e se necessario, ove gli esperimenti non sono abbastanza rigorosi da supportare le interpretazioni fatte dagli autori, proporre nuovi esperimenti da svolgere.

Editor. Valuta se l’argomento trattato nell’articolo è consono a ciò di cui tratta il giornale.

Autore. Scrive l’articolo.

Ritorna all’editore, il quale dopo aver analizzato il tutto e aver appurato che sono state effettuate le revisioni consigliate, deve decidere se accettarlo, rifiutarlo o richiedere altre modifiche.

Di nuovo ai reviewers che accettano o lo rifiutano.

Ritorna all’autore che si occupa di revisionare l’articolo.

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Com’è strutturato un articolo scientifico

• Titolo.
• Informazioni sull’autore.
• Abstract → un riassunto di ciò che viene trattato nell’articolo scritto dall’autore.
• Introduzione → dichiarazione su ciò che già si sa riguardo l’argomento di studio, si citano altri lavori scientifici, si rivela ciò che si è scoperto o studiato e le proprie ipotesi a riguardo.
• Risultati → descrizione delle ricerche effettuate e i risultati ottenuti. Per presentare questi possono essere utilizzati grafici, tabelle, video, diagrammi e fotografie.
• Discussione → analisi e interpretazione dei dati presentati che integri le nuove informazioni con i risultati precedenti e delle volte può generare delle nuove ipotesi da verificare.
• Metodi → descrizione su come sono stati condotti gli studi e tutti i dettagli degli esperimenti in modo da poterli riprodurre.
• Bibliografia → la lista degli articoli citati nell’articolo.

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DNA

→ Miescher primo ad isolare gli acidi nucleici da globuli bianchi nel pus di una benda chirurgica, notò che ciò che aveva isolato era costituito dal 14% di N e dal 3% di P e la definì ‘nucleina’.

→ Altmann nel 1889 (anni dopo Miescher) propose il termine ‘acido nucleico’.

La storia dei due acidi nucleici (DNA ed RNA) coincide con la storia della stessa biologia molecolare, la quale nasce dalle indagini cristallografiche sulle molecole biologiche negli anni ’30. Prima del 1929 non era chiara la distinzione tra DNA ed RNA: il DNA veniva considerato come l’acido nucleico degli animali mentre l’RNA come quello delle piante.

→ Astbury fisico inglese, pioniere negli studi di diffrazione a raggi X sulle molecole biologiche. Lavorò sulla cheratina e fornì le basi per la scoperta dell’a elica da L. Pauling. Dal 1937 si focalizzò sul DNA. I dati riportati furono importanti per M. Wilkins e R. Franklin e quindi di conseguenza per W & C che nel 1953 dedussero la struttura del DNA.

→ Levene biochimico ebreo, identificò i componenti del DNA e formulò alcune ipotesi sulla struttura di quest’ultimo, in seguito rilevate corrette.

Componenti disposti con una sequenza ripetuta (fosfato-zucchero-base) che chiamò ‘nucleotide’ ed ipotizzò che le molecole di DNA fossero dei filamenti composti da nucleotidi collegati tra loro attraverso i gruppi fosfato, considerati scheletro del DNA.

Le sue idee complessive considerate non corrette poiché riteneva che ci fossero solo 4 nucleotidi per molecola.

→ Griffith biologo inglese, effettuò un esperimento nel 1928 che riporta il suo nome, riuscendo a rilevare la presenza di un principio trasformante. Esperimento importante in quanto aprirà la strada alla scoperta del DNA come molecola contenente l’informazione genetica e poiché suggerisce che i batteri erano in grado di trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione.

Utilizzò per l’esperimento due ceppi di Streptococcus pneumoniae: R = rugoso, privo di capsula e non virulento; e S = liscio, con capsula e patogeno.

Vi era qualche sostanza all’interno di S, che non veniva degradato con il calore, in grado di trasformare il ceppo R in S e di uccidere il topo. Questo venne definito come ‘fattore/principio trasformante’ e come tutti gli altri scienziati di quel tempo, erroneamente lo ritenne di natura proteica.

Figura 1. Esperimento di Griffith

→ Schrodinger fisico e matematico austriaco, Nobel per la fisica nel 1933. Nel 1937 focalizzò i suoi studi sul DNA contribuendo alla definizione della sua struttura.

Nel 1944 formulò l’ipotesi del ‘cristallo aperiodico’, ovvero che il materiale genetico era costituito da una molecola di grandi dimensioni dalla struttura non ripetitiva stabile da mantenere l’informazione genetica.

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→ Avery medico canadese, biologo molecolare e pioniere nell’immunologia. Nel 1944, insieme a C. MacLeod e M. McCarty, elaborò un importante esperimento in vitro, individuando come principio trasformante il DNA.

→ A. Hershey e M. Chase confermarono il ruolo del DNA nell’ereditarietà grazie all’esperimento del frullatore, in cui dimostravano che il materiale genetico del batteriofago T2 era il DNA.

Figura 3. Esperimento di Avery

Figura 2. Esperimento di Avery

I ricercatori allestirono due esperimenti, prepararono una coltura di batteriofagi marcati con 36S (solo nel rivestimento proteico) ed un’altra di batteriofagi con 32P (solo nel DNA).

Ciò che era penetrato nelle cellule batteriche era il DNA marcato radioattivamente, i rivestimenti proteici erano rimasti all’esterno. Figura 4. Esperimento di Hershey e Chase.

→ E. Chargaff chimico austriaco che ricorrendo alla cromatografia su carta riuscì a separare le molecole del DNA nelle sue basi e determinare le loro percentuali. Per determinare l’abbondanza delle basi l’assorbanza agli UV allo spettrofotometro di ognuna.

Regole di Chargaff (1950):

• Qualunque sia la fonte del DNA → Purine = Pirimidine → A+G = T+C.
• La composizione in basi del DNA, espressa come la percentuale G+C%, è costante per ciascuna specie, ma varia moltissimo da una specie all’altra.

Chargaff notò che la viscosità del DNA diminuisce drasticamente a T tra 70° e 80°, indicando che i legami presenti nel DNA, importanti per la struttura, sono legami termosensibili quali i legami H.

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Caratteristiche acidi nucleici

• Nucleoside = zucchero pentoso (ribosio o desossiribosio) + base azotata → grazie ad una reazione di condensazione in cui si forma un legame -glicosidico.
• Nei nucleosidi pirimidinici abbiamo un legame -N1-glicosidico, in quelli purinici abbiamo, invece, un legame -N9-glicosidico.
• 2-desossi-D-ribosio, aldopentoso che manca di un atomo di ossigeno in C2 → più stabile.
• D-ribosio, aldopentoso che presenta un atomo di ossigeno in C2.
• In soluzione predomina la forma chiusa grazie ad una reazione intramolecolare dove gruppo aldeidico al C1 reagisce con gruppo OH in C4 formando un emiacetale (reazione reversibile anche se equilibrio spostato verso la forma emiacetalica).
• Ciclizzando, l’anello furanosico che si viene a formare presenta due diverse conformazioni detti ‘anomeri’ (differiscono per la posizione del gruppo OH legato al C1 rispetto al piano), che sono: e.
• L’anomero → è più stabile quindi più presente → confrontando gruppo OH in C1 con gruppo in C5 risulta trans.
• L’anello furanosico del ribosio non esiste come struttura perfettamente planare ma possiede una struttura tridimensionale in cui i quattro elementi dell’anello (i vertici del pentagono) giacciono sullo stesso piano e un quinto membro dell’anello fuori dal piano → conformazione detta a ‘busta’.

Gli atomi di carbonio C-2 o C-3 possono assumere questa conformazione ponendosi fuori del piano: sia sullo stesso lato del piano dove si trova l’atomo di carbonio C-5 (configurazione C- endo), sia sul lato opposto (conformazione C-eso), mentre C-1, C-2, C- 4 e l’atomo di ossigeno O sono complanari (giacciono sullo stesso piano).

La presenza di un gruppo OH in posizione 2ʹ del ribosio presente nella molecola di RNA forza il ribosio nella conformazione C3ʹ-endo, a differenza della C2ʹ-endo tipica del deossiribosio, generando così due molecole comunque differenti tra loro.

Anche la nomenclatura sin/anti viene spesso usata.

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• Nucleotide = base azotata, zucchero e una o più molecole di acido fosforico.

→ Deossinucleotidi e ribonucleotidi. Nucleotide è quindi l’estere fosforico di un nucleoside, l’esterificazione avviene al gruppo OH in C5 dello zucchero.

Tecnica della diffrazione a raggi X

Tecnica utilizzata per analizzare la struttura dei cristalli, dallo studio di quest’ultimo è possibile risalire al gruppo spaziale e alla distribuzione degli atomi nella cella elementare.

Tutto ciò viene fatto misurando l’intensità delle riflessioni.

→ R. Franklin biologa inglese che nei primi anni ’50 utilizzò la diffrazione a raggi X per studiare il DNA.

→ M. Wilkins biologo inglese che preparò i campioni di DNA (cristalli) utilizzati dalla Franklin per lo studio.

Le cristallografie che si ottennero dal lavoro di entrambi suggerivano che la molecola del DNA fosse a forma elicoidale o a spirale.

Wilkins, a differenza della Franklin che morì prima, ricevette il Nobel nel 1962 insieme a W&C; inoltre il suo lavoro venne pubblicato su Nature come sostegno alla tesi proposta da W&C (famosa foto 51).

Nel 1951 Franklin iniziò a lavorare come ricercatrice al King’s College di Londra diretto da Wilkins. Le scoperte della Franklin furono rivelate a W&C da parte di Wilkins, anche la famosa foto 51 ottenuta tra il 1° e il 2° maggio, la quale era una delle immagini più nitide ottenute e dimostrava indiscutibilmente che la forma del DNA era quella di un’elica.

Pochi giorni prima di pubblicare l’articolo su Nature, Crick contatta il figlio scrivendogli una lettera e gli annuncia ‘la vita viene dalla vita’ corredando il tutto con un disegno della doppia elica del DNA. Lettera poi venduta all’asta per 6 mln di dollari, imponendo un record.

Il 25 aprile del 1953 viene pubblicato sulla rivista scientifica “Nature” il famoso articolo di W&C. L’articolo venne scritto da Elizabeth, sorella minore di Watson e su richiesta del marito Crick, la pittrice britannica Odile Speed disegnò un bozzetto della struttura del DNA.

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Estratto dell’articolo su Nature

<< Desideriamo suggerire una struttura per il sale dell’acido deossiribonucleico (D.N.A.). Tale struttura presenta caratteristiche originali, di notevole interesse biologico. Una struttura per gli acidi nucleici è stata già proposta da Pauling e Corey. Questi Autori gentilmente ci hanno fornito il loro manoscritto prima della pubblicazione. Il loro modello consiste in tre catene attorcigliate, con i gruppi fosfato vicini all’asse della fibra, e le basi all’esterno. Secondo noi, questa struttura non è soddisfacente per due ragioni: (1) Riteniamo che il materiale che dà i diagrammi ai raggi X sia il sale, non l’acido libero. Senza gli atomi acidi di idrogeno non è chiaro quali forze possano mantenere stabile la struttura, considerando specialmente che i fosfati in prossimità dell’asse, carichi negativamente, si respingono a vicenda. (2) Alcune tra le distanze di van der Waals appaiono essere troppo esigue. Un’altra struttura a tre catene è stata inoltre suggerita da Fraser (in stampa). Nel suo modello i fosfati sono all’esterno e le basi all’interno, tenute assieme da legami idrogeno. Questa struttura, come descritta, è abbastanza mal-definita, e per tale motivo non la commentiamo.

Desideriamo proporre una struttura radicalmente diversa per il sale dell’acido deossiribonucleico. Questa struttura ha due catene elicoidali, ciascuna avvolta a spirale sullo stesso asse (vedi diagramma). Abbiamo fatto le solite ipotesi chimiche, cioè che ciascuna catena consista di gruppi diesterici fosfato uniti a residui di b-D-deossiribofuranosio mediante legami 3’, 5’. Le due catene (ma non le loro basi) sono correlate da una diade perpendicolare all’asse della fibra. Entrambe le catene presentano un andamento elicoidale destrorso, ma a causa della presenza della diade, le sequenze degli atomi nelle due catene vanno in direzioni opposte. Ciascuna catena ricorda approssimativamente il modello N.1 di Furberg; cioè le basi si trovano all’interno dell’elica e i fosfati all’esterno. La configurazione dello zucchero e degli atomi ad esso vicini è aderente alla ‘configurazione standard’ di Furberg, essendo lo zucchero grossolanamente perpendicolare alla base ad esso legata. È presente un residuo su ciascuna catena ogni 3,4 Angstrom nella direzione-z.

Abbiamo assunto un angolo di 36° tra residui adiacenti sulla stessa catena, cosicché la struttura si ripete dopo 10 residui su ciascuna catena, cioè dopo 34 Angstrom. Poiché i fosfati sono all’esterno, i cationi hanno un facile accesso ad essi. Si tratta di una struttura aperta, con un contenuto d’acqua piuttosto elevato. Con un minore contenuto acquoso ci si attende un inclinamento delle basi che permetterebbe alla struttura di diventare più compatta.

La caratteristica originale della struttura è rappresentata dal modo con cui le due catene sono tenute assieme dalle basi puriniche e pirimidiniche. I piani delle basi sono perpendicolari all’asse della fibra. Esse sono unite a coppie, una singola base su una catena unita mediante legami idrogeno a una singola base sull’altra catena, in modo tale che le due basi giacciono fianco a fianco con coordinate-z identiche. Affinché il legame possa avvenire, una base della coppia deve essere una purina e l’altra una pirimidina. I legami idrogeno sono formati come segue: purina posizione 1 con pirimidina posizione 1; purina posizione 6 con pirimidina posizione 6.

La sequenza delle basi su una singola catena non sembra essere limitata in alcun modo. Tuttavia, se possono essere formate solo specifiche coppie di basi, ne consegue che, data la sequenza di basi su una catena, la sequenza sull’altra catena viene determinata automaticamente. Sperimentalmente è stato determinato che il rapporto fra la quantità di adenina e timina e il rapporto fra guanina e citosina sono sempre molto vicini all’unità per l’acido deossiribonucleico. >>

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Struttura secondaria del DNA

Gli aspetti essenziali del modello di Watson e Crick sono:

• Lo scheletro di ciascun’elica è composto dai residui di deossiribosio uniti mediante legami fosfodiesterici covalenti in posizione 5’ e 3’ sull’anello dello zucchero.
• I due filamenti (eliche) del DNA sono uniti all’interno della struttura da legami idrogeno che occorrono tra le basi puriniche di una catena e le basi pirimidiniche dell’altra (le basi puriniche e pirimidiniche si trovano infatti all’interno mentre i gruppi fosforici e gli zuccheri sono all’esterno) inoltre il piano delle basi è perpendicolare all’asse dell’elica e il piano degli zuccheri forma un angolo quasi retto con quello delle basi.
• L’adenina è sempre accoppiata alla timina e la guanina è sempre accoppiata alla citosina, in base a fattori sterici e di formazione dei legami idrogeno.
• La sequenza precisa delle basi porta l’informazione genetica.
• Le estremità di ciascun filamento di DNA sono chiamate 5’ e 3’. Per convenzione, con il 5’ si indica la sequenza più vicina all’inizio del gene, con il 3’ si indica la sequenza più vicina alla fine del gene.
• I due scheletri corrono in direzioni opposte, sono antiparalleli.
• Il DNA è sempre sintetizzato dal 5’ al 3’.
• Il diametro dell’elica è di 20°A, le basi adiacenti sono separate da 3,4°A lungo l’asse dell’elica e formano tra loro un angolo di 36°.
• La struttura dell’elica si ripete quindi 10 residui di ciascuna catena intervalli cioè di 34°A.

L’appaiamento delle basi

L’aspetto più importante della doppia elica del DNA consiste nella specificità dell’accoppiamento delle basi. Le restrizioni steriche sono imposte dalla natura regolare ad elica dell’ossatura costituita da zuccheri e gruppi fosforici, di ciascuna catena polinucleotidica.

I legami glicosidici di una coppia di basi sono sempre distanti tra loro 10,8°A. Infatti,

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una coppia di basi purinica-pirimidinica si adatta in maniera perfetta in questo spazio che non è altrettanto sufficiente per due purine mentre due pirimidine sarebbero invece troppo lontane l’una dall’altra per formare legami idrogeno. Pertanto, la coppia di basi nell’elica del DNA deve essere sempre costituita da una purina e da una pirimidina per problemi sterici.