Riassunto esame di Biotecnologie

Viremia/Setticemia: sangue o siero

Singolo animale. Patogeni enterici/Animale da reddito. Respiratori: tamponi. Pool di campioni: sia malati che non.

Patogenesi

Da dove? Da chi? Escreti/Secreti: endoscopia; esame urine; prelievo del seme (2) (1). Animale domestico. Animali malati. Segni clinici evidenti: organi: necroscopia, biopsia.

Dipende dallo scopo. Possibilità di Metapneumovirus aviario. Asintomatici. Presenza del patogeno: monitoraggio. Se ho 95% di probabilità di trovarlo, può bastare un pool di 10 tamponi. Malattia virale acuta = alta influenza. Segni clinici a intermittenza. Retrovirus e Provirus (4).

Campionamento

Quanti? (3) Campionamento. Quando? Frequenza dei malati nella pop. in un arco di tempo. Stima della prevalenza. Identificare presenza patogeno: svezzamento. Timing. Dinamiche/Distribuzione dell'animale durante la sua vita. Incroci/Trasporti da diversi Paesi (6) (5).

Estrazione

Liquido. Meccanico/Digestione enzimatica. Disgregazione dei componenti. Solido. Centrifugazione. Temperatura. Stoccaggio a -20°C per conservazione DNA e -80°C per RNA.

• Più fasi con alcool.
• Fenol-cloroformio.
• RNA Later solution: alternative tengono stabili di NA.
• Biglie magnetiche: si legano al NA e con lavaggio rimuovo gli altri componenti.
• FTA Cards: cartoline che, inattivando i microrganismi + leggere rotture di NA.
• Membrane in silice: NA si attaccano alla membrana e poi vengono estratti.

Pianificazione

Patogenesi. DNA/RNA. Pianificazione. Obiettivo test. Risorse/attrezzature/personale disponibili.

Valutazione dei test diagnostici

Vanno considerati:

• Validità*.
• Riproducibilità*.
• Standardizzazione*.
• Costi.
• Esecuzione ed interpretazione.
• Prelievo del materiale organico occorrente.
• Accettazione (utenti ed esecutori).
• Legislazione.
• Prevalenza infezione da diagnosticare.
• Natura dell’infezione.
• Provvedimenti conseguenti al risultato del test.

Primers

Primers: software per disegno + pubblicati. Meglio ampliconi corti; sequenze + primers. Ta = Tm - 5°C. Disegno primers.

Primers degenerati: primer a basi diverse, si lega nella maggior parte dei siti.

Agenti intercalanti

Si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers = formazione di prodotti a-specifici. Si legano in maniera a-specifica a tutto il DNA nel solco minore. Se sono presenti impurità, daranno un segnale addizionale nella curva di melting e non si riuscirà a distinguere campione da impurità. Es.: SYBR GREEN.

Probes e fluorofori

Molecular Beacon: si srotola + resistente a mis-match. FRET probes: due fluorofori + resistenti a mis-match. Probes (sonde): specifiche per frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti.

Svantaggi: classificazione errata data da:

• Pochi mis-match.
• Virus evolvono.
• Più facile per alti titoli virali.

Hydrolisis probes: 5' reporter che emette fluorescenza + 3' Quencher che arresta fluor.

Ripetibilità

Ripetibilità: il test deve poter essere ripetuto tante volte e dare sempre lo stesso risultato. Bisogna dimostrare che tutte le variabili non influenzano l'amplificato. 3 diluizioni e si testa in tanti replicati e due operatori in giorni diversi. Coefficiente di variazione < 4%.

Analitica e cut-off

Analitica: il test deve riuscire a distinguere analiti target da quelli non target.

Sonde vantaggi: evidenzia solo ciò che si vuole.

• Valido un nuovo metodo.
• Genotipizzazione.
• Sviluppo e cerco vaccini.

Cut-off: punto del grafico al di sotto del quale il risultato è. Modifico i cut-off: -CO = +SE; +CO = +SP.