Riassunto biochimica

Le biomolecole

I 4 elementi più abbondanti presenti nella materia vivente sono:

• Azoto
• Idrogeno
• Carbonio
• Ossigeno

Mediante legami covalenti, il carbonio è capace di formare catene lineari, ramificate e strutture cicliche. Vengono quindi aggiunti a questi scheletri di carbonio gruppi di atomi, chiamati gruppi funzionali, che conferiscono alla molecola specifiche proprietà chimiche. Questi composti vengono definiti composti organici.

Molte delle molecole d’interesse biologico derivano dagli idrocarburi, ovvero composti costituiti da atomi di C uniti tra loro da legami covalenti e contenenti atomi di H. Gli atomi di H possono essere sostituiti con una varietà di gruppi funzionali creando numerose famiglie:

• Alcoli (gruppo ossidrilico)
• Ammine (gruppo amminico)
• Aldeidi e chetoni (gruppo carbonilico)
• Acidi carbossilici (gruppo carbossilico)

Le biomolecole hanno dimensioni e strutture tridimensionali caratteristiche che derivano dallo scheletro carbonioso e dai gruppi funzionali sostituenti.

In una molecola organica quando 4 gruppi o atomi diversi sono legati allo stesso atomo di C, questo viene detto carbonio asimmetrico e può esistere in due diverse forme isomeriche, chiamate stereoisomeri.¹ Un tipo particolare di stereoisomeri sono gli enantiomeri, immagini speculari non sovrapponibili, che hanno le stesse caratteristiche chimiche ma differiscono tra loro per una proprietà fisica, la capacità di ruotare il piano della luce polarizzata. I composti con atomi di C asimmetrico vengono detti composti chirali, tutti gli amminoacidi (eccetto la glicina) contengono un centro chirale.

Le variazioni della struttura tridimensionale vengono descritte in termini di:

• Configurazione: disposizione spaziale di una molecola data dalla presenza di doppi legami intorno ai quali non è possibile ruotare oppure dai centri chirali interni ai quali i sostituenti sono disposti in sequenze specifiche;
• Conformazione: disposizione spaziale dei gruppi sostituenti che sono liberi di assumere posizioni diverse nello spazio, senza rompere legami ma basandosi soltanto sulla libertà di rotazione.

Se un composto che contiene un centro chirale viene sintetizzato in laboratorio, si creerà una miscela contenente tutte le forme chirali possibili di quel composto e che quindi non ruoterà il piano della luce polarizzata. Questa miscela si chiama miscela racemica.

Le reazioni che avvengono nelle cellule possono essere suddivise in 5 categorie principali:

• Ossidazione e riduzione
• Trasferimento di gruppi funzionali
• Reazioni che riorganizzano la disposizione dei legami intorno ad uno o più atomi di carbonio
• Reazioni che rompono o formano legami C-C
• Reazioni in cui due molecole condensano con eliminazione di una molecola di acqua

Amminoacidi

Le proteine sono gli strumenti attraverso cui si esprime l’informazione genetica. Sono costituite dallo stesso gruppo di 20 aa legati tra loro attraverso legami covalenti in caratteristiche sequenze lineari.

Le cellule possono produrre diversi tipi di proteine con proprietà e attività diverse semplicemente legando tra loro gli stessi 20 aa ma in sequenze diverse.

Tutti gli aa possiedono un gruppo amminico e un gruppo carbossilico legati allo stesso carbonio, definito α (atomo asimmetrico eccetto quello della glicina); differiscono tra loro per la catena laterale R che influenza la solubilità dell’aa in acqua.

La nomenclatura degli aa è basata sulla configurazione assoluta della gliceraldeide, stabilita dalla sua diffrazione ai raggi X e si basa su due configurazioni: L o D, che si riferiscono alla configurazione assoluta dei 4 sostituenti² interni al centro chirale.

¹ Stereoisomeri: particolari isomeri che hanno la stessa connettività, ovvero i cui atomi sono legati tra loro nello stesso modo ma differiscono per la loro disposizione nello spazio.

² Diffrazione ai raggi X: determina la struttura di composti organici ed inorganici, per la comprensione delle funzioni e dei meccanismi molecolari.

Nelle soluzioni acquose gli aa possono agire da acidi o da basi. Gli aa che hanno un solo gruppo amminico e un solo gruppo carbossilico cristallizzano dalle soluzioni acquose come specie completamente ionizzate note con il nome di zwitterioni.³

Gli aa possono essere suddivisi in base alle proprietà dei loro gruppi R:

1. Gruppi R alifatici non polari: non polari e idrofobici
   • Alanina
   • Valina
   • Leucina
   • Isoleucina
2. Gruppi R aromatici: non polari
   • Fenilalanina
   • Tirosina
   • Triptofano
3. Gruppi R carichi negativamente: hanno carica negativa a pH 7
   • Glutammato
   • Aspartato
4. Gruppi R carichi positivamente: hanno carica positiva a pH 7
   • Lisina
   • Arginina
   • Istidina
5. Gruppi R polari non carichi: molto più solubili in acqua, in quanto contengono catene laterali che possono creare legami a H con l’acqua
   • Serina
   • Treonina
   • Cisteina
   • Metionina
   • Asparagina
   • Glutammina
6. AA non standard:
   • 4-Idrossiprolina
   • 5-Idrossilisina
   • N-Metillisina
   • Carbossilglutammato
   • Selenocisteina
   • Ornitina
   • Citrullina

Durante una titolazione si ha una graduale aggiunta o rimozione di protoni.⁴

Facciamo l’esempio con la glicina. Ogni molecola di base aggiunta determina la rimozione netta di un protone da una molecola di aa. A pH molto basso la specie ionica predominante è quella completamente protonata (⁺H₃N-CH₂-COOH). Al punto di mezzo della prima fase di titolazione, sono presenti in quantità equimolari il donatore di protoni (⁺H₃N-CH₂-COOH) e l’accettore di protoni (⁺H₃N-CH₂-COO⁻). Al punto di mezzo di una titolazione il pH corrisponde alla pK del gruppo protonato che viene titolato. Al pH 5,97 (punto di flessione), sta iniziando la rimozione del secondo protone. A questo pH la glicina è presente in larga misura nella specie ionica ⁺H₃N-CH₂-COO⁻. La seconda fase della titolazione corrisponde alla rimozione di un protone dal gruppo amminico. Il pH è 9,60 e corrisponde alla pKa del gruppo amminico. La titolazione è finita intorno al pH 12 in cui la forma predominante è H₂N-CH₂-COO⁻.

La prima informazione che possiamo ottenere dal grafico è la misura quantitativa del pKa di ciascun gruppo ionizzante. La seconda è la capacità tamponante⁵ dell’aa. La terza è la relazione tra la sua carica elettrica netta ed il pH della soluzione. Nel punto di flessione l’aa è presente nella sua forma dipolare ma ha carica netta 0. Questo pH viene detto punto isoelettrico ed è dato dalla media aritmetica dei valori dei due pKa.

³ Zwitterione: molecola elettricamente neutra che però presenta sia cariche positive che cariche negative.

⁴ Titolazione: tecnica di analisi chimica utilizzata per determinare la concentrazione incognita di un acido o una base in una soluzione facendola reagire con una soluzione a concentrazione (titolo) nota rispettivamente di una base o di un acido (titolante).

⁵ Capacità tamponante: quantità di acido o base forte che deve essere aggiunta a un litro di soluzione affinché si verifichi la variazione di una unità di pH.

Introduzione allo studio delle proteine

Le proteine vengono classificate in base alla loro funzione:

• Enzimi
• Proteine strutturali
• Proteine di trasporto
• Proteine di membrana
• Proteine contrattili e motili
• Proteine di riserva
• Proteine di difesa
• Proteine regolatrici

I piccoli polipeptidi sono sequenziati utilizzando procedimenti automatizzati. Per sequenziare un’intera catena polipeptidica, viene utilizzato un metodo chimico noto con il nome di degradazione di Edman, marca e stacca soltanto il residuo ammino-terminale da un peptide, lasciando tutti gli altri legami peptidici intatti.

Per quanto riguarda i grandi peptidi, questi vengono rotti in pezzi più piccoli in modo tale da essere sequenziati correttamente. È composto da diverse tappe:

1. Rottura dei ponti disolfuro: possono generare delle interferenze con il procedimento.
2. Rottura della catena polipeptidica: si possono usare diversi metodi. Un gruppo di enzimi (chiamati proteasi) e di reagenti chimici che rompono il legame peptidico adiacente ad uno specifico residuo amminoacidico.
3. Sequenziamento dei peptidi: tutti i frammenti peptidici prodotti vengono sequenziati con la degradazione di Edman.
4. Ordinamento dei frammenti peptidici: un altro campione del peptide nativo viene rotto in piccoli frammenti usando un enzima o un reagente chimico diverso, che spezzi la catena in posizioni diverse da quello precedente. Viene ora esaminata la sequenza amminoacidica di ogni frammento ottenuto con i due tipi di rottura della catena polipeptidica con l’intento di trovare peptidi della seconda serie la cui sequenza generi una continuità, mediante sovrapposizioni, tra i peptidi della prima serie. I peptidi generati dalla seconda procedura di frammentazione che si sovrappongono come sequenza forniscono l’ordine corretto in cui disporre i peptidi generati dalla prima frammentazione.
5. Localizzazione dei ponti disolfuro: quando la sequenza è stata completata, la tappa successiva è la determinazione della posizione dei ponti disolfuro. Un campione della proteina viene frammentato con un enzima proteolitico questa volta senza rompere i ponti disolfuro. Se i peptidi ottenuti con questa frammentazione vengono confrontati con quelli generati all’inizio in cui i ponti disolfuro erano stati eliminati in precedenza, nella prima serie mancheranno due peptidi che saranno sostituiti da uno più grande. I due peptidi scomparsi rappresentano le regioni della catena intatta che sono unite dal ponte disolfuro.

Le proteine omologhe sono evoluzionisticamente correlate e di solito svolgono la stessa funzione in specie diverse. Molte posizioni nella sequenza amminoacidica sono occupate dagli stessi residui amminoacidici in tutte le specie e vengono chiamati residui invarianti. In altre posizioni, invece, può esserci una variabilità considerevole di aa, passando da una specie all’altra. Questi residui vengono detti residui variabili.

I residui variabili possono essere divisi in conservativi se le sostituzioni coinvolgono residui amminoacidici simili, e in non conservativi se le sostituzioni coinvolgono residui amminoacidici casuali.

La struttura tridimensionale delle proteine

Soltanto una delle innumerevoli conformazioni teoricamente possibili è quella che tende a predominare, cioè quella che è termodinamicamente più stabile e che quindi possiede la minor energia di Gibbs. Le proteine che si trovano nella loro conformazione funzionale vengono dette native.

Struttura primaria

Definita come la sequenza degli aa uniti da legami peptidici e la posizione dei ponti disolfuro.⁶

La conformazione di una proteina viene stabilizzata dalla presenza dei ponti disolfuro e dalle interazioni deboli non covalenti: i legami H e le interazioni idrofobiche, ioniche e di van der Waals. Le interazioni idrofobiche contribuiscono molto alla stabilità di una proteina in quanto l’interno di una proteina è un nucleo molto denso di catene laterali di aa idrofobici. La formazione di un legame è accompagnata da una variazione favorevole di energia libera.

⁶ Legame peptidico: legame responsabile dell’unione degli aa e della conseguente formazione di peptidi e proteine. Si tratta di un legame covalente che si genera tramite un processo di condensazione tra il gruppo amminico e il gruppo carbossilico.

Le proteine possono essere divise in:

• Fibrose: la cui catena polipeptidica è disposta in lunghi filamenti o foglietti;
• Globulari: la cui catena polipeptidica è avvolta su se stessa fino a raggiungere una forma sferica o globulare.

Grafico di Ramachandran: un grafico in cui Ψ è in funzione di Φ che mostra le conformazioni possibili per la maggior parte dei residui aa:

• Le aree in blu scuro sono conformazioni che tutti gli aa possono assumere.
• Quelle con blu leggermente più chiaro sono conformazioni che possono assumere tutti gli aa tranne la valina e la isoleucina.
• Le aree azzurre sono conformazioni talvolta instabili ma presenti in alcuni tipi di molecole.

Gli atomi di carbonio α di aa adiacenti sono separati da 3 legami covalenti disposti in questo modo: Cα-C-N-Cα. Studi della diffrazione ai raggi X hanno dimostrato che il legame C-N in un peptide è più corto di un legame C-N in un’ammina e che gli atomi associati al legame sono complanari. Ciò indica la presenza di una risonanza o di una parziale ridistribuzione delle due coppie di elettroni tra O e N, generando un dipolo elettrico. I 4 atomi che compongono il legame peptidico sono disposti sullo stesso piano, in modo che O e H sono in posizione trans. I legami ammidici C-N non sono in grado di ruotare liberamente a causa del loro parziale carattere di doppio legame. La rotazione è permessa solamente intorno ai legami N-Cα e Cα-C. Per convenzione gli angoli formati dalla rotazione di questi due legami sono indicati con Φ e Ψ. Sempre per convenzione questi due angoli sono uguali a 0 nella conformazione in cui i due legami peptidici collegati da un singolo Cα sono sullo stesso piano. Φ e Ψ possono assumere valori da -180° a +180°, ma molti risultano impossibilitati a causa di interferenze steriche tra atomi dello scheletro del polipeptide e delle catene laterali.

Struttura secondaria

Definita come organizzazioni, regolari e ricorrenti nello spazio, dei residui amminoacidici adiacenti di una catena polipeptidica.

Sono presenti diversi tipi di struttura secondaria. I più importanti sono α-elica e la struttura β.

• α-elica: è la più semplice disposizione che una catena polipeptidica può assumere. È una struttura elicoidale dove lo scheletro del polipeptide è strettamente arrotolato intorno all’asse longitudinale della molecola e le catene laterali dei residui amminoacidici sporgono verso l’esterno dello scheletro elicoidale. L’unità ripetitiva è un singolo giro dell’elica che si estende per una lunghezza di 0,56 nm lungo l’asse della molecola e corrisponde alla periodicità osservata. I residui amminoacidici hanno conformazioni con angoli Ψ variabili da -45° a -50° e angoli Φ di circa -60° e ogni giro dell’elica contiene 3,6 residui amminoacidici. L’avvitamento dell’elica è destrorso. La struttura è stabilizzata da legami H tra l’atomo di H legato all’atomo di N elettropositivo di ogni legame peptidico e l’atomo di O carbonilico elettronegativo del quarto residuo amminoacidico successivo posto nella direzione dell’ammino-terminale dell’elica. Ogni giro dell’elica è tenuto unito a quello adiacente da diversi legami H che, mediante la somma dei loro effetti rendono stabile la struttura. Non tutti i peptidi possono formare α-eliche stabili. Ad esempio se una catena polipeptidica contiene molti residui di Glu adiacenti, non si potrà formare una α-elica in quanto a pH 7 hanno una carica negativa che, essendo vicini tra loro, si respingono. Stessa cosa per Lys e/o Arg che, al contrario, a pH 7 possiedono una carica positiva. Un’altra limitazione è data dai residui di Pro che, avendo l’N legato in un anello rigido non è possibile alcuna rotazione intorno al legame.
• Conformazione β: è la conformazione più estesa delle catene peptidiche. In questa conformazione lo scheletro della catena polipeptidica è esteso con un andamento a zig zag. Ad esempio, nella fibroina le catene polipeptidiche a zig zag sono disposte l’una affianco all’altra formando una struttura che ricorda una serie di pieghettature e che viene chiamata foglietto ripiegato.

Nella conformazione β i legami H possono essere sia intracatena che intercatena. I gruppi R dei residui amminoacidici adiacenti sporgono al di fuori della struttura a zig zag alternativamente da una parte o dall’altra, creando una tipica organizzazione sfalsata. Le catene polipeptidiche adiacenti in un foglietto ripiegato possono essere parallele o antiparallele. Le due strutture sono simili ma il periodo è più breve in quella parallela.

Esistono altre strutture spesso presenti in un certo tipo di proteine. Ad esempio:

• Elica del collagene
• Ripiegamenti β o angoli β: presenti dove le catene peptidiche cambiano bruscamente direzione. La struttura è un ripiegamento di 180° che comprende 4 residui amminoacidici.

Esempi di proteine fibrose. Queste donano resistenza ed elasticità alla struttura di cui fanno parte, hanno strutture relativamente semplici e sono idrofobici a causa dell’alta presenza di aa idrofobici sia sulla superficie che all’interno della proteina.

• α-cheratina: proteina che resiste alla tensione. È una α-elica destrorsa, contiene molti residui idrofobici, ovvero Phe, Ile, Val, Met e Ala. La resistenza alla tensione viene amplificata dall’avvolgimento di più catene elicoidali unite a formare una superelica che ha andamento opposto a quello delle singole eliche, ovvero sinistrorso. La resistenza di queste strutture viene amplificata da legami covalenti trasversali tra le catene polipeptidiche all’interno dei filamenti a elica e tra multi-eliche. Questi legami, in questa struttura sono ponti disolfuro mentre in quelle più dure e resistenti il 18% dei residui amminoacidici sono cisteine impegnate in ponti disolfuro.
• Collagene: proteina che resiste alla tensione. Ha una struttura unica, è un’elica sinistrorsa con 3 residui amminoacidici per giro. Nella struttura alcuni aa sono più rappresentati degli altri: la Gly corrisponde al 35% dei residui totali, l’Ala l’11% e la Pro e la Hyp il 21%. La sequenza polipeptidica corrisponde all’unità tripeptidica ripetuta Glu-X-Pro oppure Glu-X-Hyp. Anche in questa struttura le singole catene si uniscono