Riassunto di Genetica agraria

Genetica

Che cos'è la genetica?

La genetica è la scienza che studia la biodiversità, le biotecnologie e l'eredità dei caratteri.

• Eredità: i viventi generano una discendenza a loro simile. Ciò avviene mediante la riproduzione che può essere asessuata (riproduzione agamica, si originano dei cloni che sono organismi identici alla pianta madre) o sessuata (due cellule specializzate si uniscono creando uno zigote, simili tra loro e assomigliano ai genitori, ma non sono mai uguali tra di loro (variabilità)).
• Biodiversità: può essere intraspecifica (variabilità genetica tra membri della stessa specie, individui simili tra loro che creano progenie fertile) oppure interspecifica (variabilità genetica tra specie diverse) degli ecosistemi (comprende le comunità biologiche che interagiscono tra di loro e con l'ambiente circostante).

Cellula

La cellula è l'entità su cui si basa la vita. Può essere eucariotica, più complessa, poiché vi è un nucleo ben definito, o procariotica, senza il nucleo. Nelle cellule procariotiche troviamo la classe dei batteri, che hanno una struttura semplice e un breve ciclo colturale. Possono essere unicellulari o pluricellulari e si riproducono mediante scissione cellulare, che consiste nel raddoppio del materiale genetico e la successiva divisione in due nucleotidi, infine abbiamo la creazione del clone identico alla cellula madre.

Nelle cellule ritroviamo le molecole che contengono l'informazione genetica, cioè l'insieme delle istruzioni per creare le proteine. Abbiamo due tipi principali: DNA (acido desossiribonucleico) e RNA (acido ribonucleico). Entrambi sono costituiti da acido fosforico, zuccheri, e basi azotate: purine (G e A) e pirimidine (C e T), dove la T viene sostituita da U nell'RNA. I legami idrogeno si creano tra una purina e una pirimidina (AT con 2 legami) e (GC con 3 legami).

DNA

Acido desossiribonucleico Quando descriviamo graficamente il DNA dobbiamo immaginare una doppia elica costituita dallo scheletro, ovvero il filamento esterno (costituito da zucchero e gruppi fosforici, ma non contiene l'informazione genica) e dagli scalini (costituiti dalle basi azotate e l'informazione genica). La molecola di DNA è una delle molecole più grandi conosciute, misurabile in Dalton che corrispondono alla massa di un atomo di H.

Se questi legami a idrogeno si rompono, possiamo avere la replicazione del DNA che può essere:

• Semiconservativa: metodo di sintesi del DNA studiato da Watson e Crick che permette di spiegare l'isolamento di nuove molecole di DNA, e ogni nastro serve come stampo per il completamento creando doppie eliche che si legano.
• Conservativo: i due filamenti di DNA si riaggregano.
• Dispersivo: i nastri si rompono in più punti, quindi abbiamo la separazione, per poi ricostruire le due eliche nelle quali sono disposti casualmente pezzi di sintesi.

La DNA polimerasi è una proteina che favorisce l'attacco di nucleotidi ed è capace di indirizzare la sintesi del DNA in un'unica direzione, distinguendo un filamento veloce (modo continuo) e un filamento guida (discontinuo).

Cromosomi

Il DNA è organizzato in cromosomi composti da fasce di cromatina. Ogni specie ha un numero cromosomico caratteristico che si indica con N (cellula genetica o aploide) e 2N (cellula somatica o diploide). Mediante esso identifichiamo il cariotipo (presentazione ordinata del corredo cromosomico) e il genoma (insieme materiale ereditario).

Cromatina: complesso di macromolecole che si trovano nel nucleo in strutture complesse DNA + proteine. Inoltre, abbiamo degli istoni, che sono proteine che formano la nucleasi, con varie funzioni tra cui rafforzare la macromolecola durante meiosi e mitosi, prevenire danni del DNA e controllare l'espressione genica durante la sua replicazione.

Studio del DNA

Per studiare il DNA dobbiamo effettuare estrazione e purificazione.

• Estrazione: le cellule devono essere disgregate mediante una soluzione detergente, sali e magnesio.
• Denaturazione: le proteine vengono denaturate utilizzando il fenolo e successivamente vi è una centrifugazione che permette di dividere il DNA in parte pesante e leggera. Successivamente, con l'aiuto di alcol che allontana le molecole di H₂O, abbiamo una precipitazione.

Elettroforesi

Processo che si basa sulla capacità delle molecole di essere dotate di una carica elettrica. Questo permette il movimento di queste cariche dal catodo (-) all’anodo (+), e i più piccoli si muovono più velocemente di quelli grandi.

1. Preparazione dell’attrezzatura e posizione dei pettini nei rispettivi incastri basandosi sui campioni disponibili.
2. Preparazione di una soluzione acquosa con ioni che permettono il passaggio della corrente e una soluzione gelatinosa chiamata matrice (solitamente viene utilizzato l’Agar). Successivamente si immette il liquido all’interno del contenitore e si lascia raffreddare.
3. Preparazione dei campioni del DNA a cui verranno aggiunti dei marcatori per vedere più facilmente il DNA. Solitamente viene usato il bromuro di etidio.
4. Si tolgono i pettini una volta che il liquido si è solidificato e successivamente si inseriscono i campioni di DNA con l’aggiunta di saccarosio, permettendo alla soluzione di essere più densa.
5. Viene fatta passare energia per il tempo necessario. Dopo aver tolto il gel, viene effettuata una fotografia e osservate le molecole.

Denaturazione

La stabilità dell'elica è assicurata da un grande numero di legami che legano le catene. Se abbiamo la rottura di questi legami e quindi la separazione delle basi, abbiamo la separazione dei due filamenti. I più importanti agenti denaturanti sono la temperatura e la luce ultravioletta.

Restrizione e Ligazione

Il DNA può essere manipolato mediante enzimi come la ligasi (salda gli acidi nucleici) o la nucleasi (taglia gli acidi nucleici). In particolare, quest’ultima si divide in esonucleasi (tagliano l’estremità della catena del DNA utilizzati per correggere la duplicazione del DNA) e endonucleasi (compiono il taglio all’interno della catena).

• In particolare, osserviamo l’endonucleasi di restrizione, enzimi di origine batterica che tagliano il DNA dopo una specifica sequenza di basi. Il taglio può essere asimmetrico (che letto sia da 5’-3’ che da 3’-5’ è uguale).

Ibridazione

Il DNA viene estratto e sottoposto ad elettroforesi con gel di agar in modo da separarne i frammenti in base al peso molecolare. Successivamente, si denaturano e si trasferiscono su una membrana di nitrocellulosa dove ritroviamo le coppie denaturate da una sequenza di DNA sonda. I filamenti della sonda portano all’ibridazione quelli complementari sulla membrana. Successivamente, abbiamo il lavaggio e mediante l’utilizzo della lastra radiografica vengono fissate le emissioni del radioisotopo nella sonda. Successivamente, si possono osservare le macchie corrispondenti ai frammenti di DNA che rappresentano la sequenza identica a quella della sonda.

PCR

Consiste nell’isolamento e amplificazione del DNA di interesse tramite reazioni a catena della polimerasi; quindi, siamo in grado di produrre modelli di DNA n volte in base a una sequenza target. La reazione si esegue mediante vari step a diversa temperatura e successivamente il ciclo si può ripetere infinite volte, mediante un termociclatore.

1. Denaturazione: separazione dei filamenti del DNA aumentando la temperatura fino a 95°.
2. Appaiamento: temperatura abbassata fino a 50° per permettere l’annidamento dei primer sulle regioni del DNA e quindi abbiamo la presenza dell’inizio della sequenza target.
3. Allungamento: i primer fanno in modo che l’enzima TAC polimerasi crei un filamento complementare al filamento di base, formando così solo molecole di DNA target. Successivamente, il ciclo viene ripetuto, ottenendo molecole solo formate da filamenti target.

Sequenziamento del DNA

Permette di studiare i nucleotidi presenti nella molecola di DNA.

• Come prima cosa, effettuo la PCR. Successivamente, le coppie che formo vengono denaturate, interviene la DNA polimerasi che mediante un primer crea un nuovo filamento complementare con nucleotidi modificati (abbiamo la presenza di un legame H invece del legame OH), inoltre sono costituiti da marcatori. Quando avviene l'unione di uno di questi nucleotidi modificati, si ha l’arresto della sintesi (metodo a terminazione di catena Sanger).
• Successivamente, si denatura il DNA nuovamente e avviene un processo di elettroforesi che permette ai frammenti di DNA di migrare verso il polo positivo. Al termine della corsa, un laser eccita i marcatori percependone il colore della base azotata di conseguenza possiamo decifrare la sequenza completa che è complementare.

RNA e tipi di RNA

RNA (acido ribonucleico) è responsabile della trascrizione del materiale ereditario dal nucleo al citoplasma e della successiva produzione di proteine. A differenza del DNA, è costituito da un solo filamento, e a livello di basi azotate l’uracile sostituisce la timina. L’unione tra le basi azotate viene regolata mediante la RNA polimerasi, ma il processo di trascrizione è fondamentale per la sintesi proteica.