Riassunti di Biologia Molecolare Modulo 3 - Il codice genetico e la Regolazione dell'Espressione Genica

Università di Catania

LUIGI FIORENTINO

Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

Modulo 3

MODULO 3: Il codice genetico – mutazioni soppressore. Regolazione dell’espressione genica – regolazione dell’inizio della trascrizione nei procarioti: il modello dell’operone ed il fago lambda - La regolazione traduzione-dipendente dell’mRNA e della stabilità delle proteine.

Meccanismi di regolazione trascrizionale negli eucarioti – fattori di trascrizione – i domini di legame al DNA - la trasduzione del segnale – regolazione della struttura della cromatina – silenziamento genico.

Tecniche di Biologia molecolare: l’elettroforesi di macromolecole biologiche – sonde d’ibridazione – il clonaggio genico – le librerie: genomiche e a DNA – la PCR – il Sequenziamento.

Capitolo 14: Il codice genetico

Il cuore centrale del Dogma della biologia è certamente il concetto secondo il quale l’informazione a partire dell’alfabeto a quattro lettere (le basi azotate) della catena polinucleotidica del DNA venga “tradotto” in un linguaggio a 20 lettere (gli aminoacidi) che costituiscono le componenti fondamentali di qualsiasi catena polipeptidica.

Il codice genetico prevede proprio questo: è la modalità mediante la quale l’informazione presente nelle sequenze codificanti del DNA venga letta a triplette di nucleotidi (o codoni).

Come abbiamo visto, la traduzione di informazioni genetiche nelle sequenze di amminoacidi si svolge sui ribosomi ed è mediata da speciali molecole adattatrici note come tRNA o RNA transfer i quali riconoscono gruppi di tre nucleotidi consecutivi, i codoni.

Con quattro possibili nucleotidi in ciascuna posizione del codone, il numero totale di permutazioni di queste terzine è 64 (4³), valore senz’altro superiore al numero di aminoacidi esistenti in natura.

La cosa del tutto sorprendente è che 61 delle 64 possibili terzine specificano per un amminoacido mentre soltanto tre codoni costituiscono i codoni di stop. Ciò significa che esistono codoni sinonimi, ossia triplette diverse ma codificanti per lo stesso aminoacido; da ciò si può intuire che ogni aminoacido è specificato da più di un codone, prerogativa del codice genetico chiamata degenerazione del codice (genetico).

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Prendendo come esempio i codoni, UUU e UUC essi infatti sono codoni sinonimi della fenilalanina, mentre la serina è codificata da i sinonimi UCU, UCC, UCA, UCG, AGU e AGC.

Il codice genetico sebbene si presenti, con piccolissime eccezioni, identico in tutti i domini della vita ma tuttavia non può dirsi universale, piuttosto sarebbe corretto ritenerlo come un codice “quasi” universale.

Se da un lato infatti è vero che i risultati del sequenziamento di genomi su larga scala hanno ampiamente confermato l’attesa universalità del codice genetico, cosa che senz’ombra di dubbio ha consentito di accrescere e migliorare la comprensione sui meccanismi che governano la vita in tutte le sue forme, dall’altro il riscontro secondo cui in alcuni organelli subcellulari, il codice genetico risulta essere in realtà leggermente diverso dal codice standard, ha fatto vacillare tale rinomata universalità del codice.

Questo dato di fatto è stato constatato anche durante il sequenziamento dell’intero genoma mitocondriale umano da 16.569 bp ma è stato osservato anche per i mitocondri del lievito, di Drosophila e delle piante superiori.

Le note sequenze codificanti per proteine hanno rivelato quali e quante differenze sussistono tra i due codici genetici, ovvero quello standard e quello mitocondriale (Tabella accanto, la si confronti con la tabella a pagina precedente):

• UGA in questo codice ad esempio non è un codone di stop ma tale codone specifica Trp per il triptofano. Quindi, l’anticodone di un tRNA mitocondriale riconosce sia la tripletta UGG che quella UGA, anche in questo caso il codice mitocondriale risulta degenerato proprio come accade nel codice genetico standard.
• La metionina interna (in frame) è invece codificata sia dall’AUG che dal codone AUA.
• Nei mitocondri dei mammiferi, i codoni AGA e AGG non sono codoni di arginina (nel codice "universale" ne esistono ben 6 per questo aminoacido) ma, anzi, sono codoni di stop; pertanto, vi sono quattro codoni di stop (UAA, UAG, AGA e AGG) nel codice mitocondriale dei mammiferi.
• Nei mitocondri di Drosophila (moscerino comune della frutta), anche AGA e AGG non sono codoni dell’arginina ma specificano per la serina. Forse non a caso, anche i tRNA mitocondriali sono insoliti rispetto alle regole con cui decodificano i messaggi mitocondriali.

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Nei mitocondri dei mammiferi sono presenti solo 22 tRNA, mentre occorre un minimo di 32 molecole di tRNA necessarie per decodificare il codice "universale" stando alle regole del tentennamento della base, questo perché anche gli stessi tRNA mitocondriali non sono soggetti alle stesse regole di quelli cellulari nel decodificare i messaggeri.

Come conseguenza di questo fatto si ha che, quando uno stesso amminoacido è specificato da quattro codoni differenti (recanti tuttavia la stessa base in prima e seconda posizione), solo un singolo tRNA mitocondriale risulta coinvolto (mentre almeno due tRNA sarebbero richiesti nel codice genetico standard).

Ora, tornando alle caratteristiche del codice genetico standard, attraverso un’accurata supervisione si nota ad ogni aminoacido corrisponda da 1 (nel caso di metionina e triptofano) a 6 codoni e già questa caratteristica ci lascia pensare che tale codice si sia evoluto in modo da ridurre al minimo gli effetti deleteri delle mutazioni, altre caratteristiche del codice genetico standard possono essere così riassunte:

• Mutazioni a carico della prima posizione di un codone spesso forniscono un amminoacido con caratteristiche chimico-fisiche simili (anche se non uguale all’aminoacido originale), ma, cosa ancora più visibile, spesso molti tra i codoni sinonimi che appunto specificano per lo stesso aminoacido, differiscono per una sola base, la terza base.
• Inoltre, codoni con pirimidine nella seconda posizione specificano principalmente aminoacidi idrofobici; codoni con purine in seconda posizione spesso codificano principalmente per amminoacidi polari (vedi Tabella a pag. 318). Tutto questo vuol dire che, qualora in seconda posizione dovesse determinarsi una mutazione per transizione (sostituzioni da A: T a G: C o viceversa), le più comuni mutazioni puntiformi, a carico della base in seconda posizione di un codone, comunque il codone sarà ugualmente in grado di codificare per un aminoacido molto simile se non lo stesso.
• In aggiunta, se un codone presenta una mutazione di transizione nella terza posizione, raramente specificherà per un aminoacido diverso;
• Una mutazione per trasversione in terza posizione poi, circa nella metà dei casi, non avrà conseguenze sull’aminoacido codificato.
• Un’altra caratteristica evidente nel codice è che quando le prime due posizioni di un codone sono entrambe occupate da G e/o C, la presenza nella terza base di uno qualsiasi dei 4 nucleotidi possibili consente comunque al codone di specificare per lo stesso amminoacido (vedi esempi della prolina, dell’alanina, dell’arginina o della glicina).
• D’altra parte, ogni volta che le prime due le posizioni del codone sono entrambe occupate da A o U, la natura del terzo il nucleotide fa la differenza tra codone e codone.

Dal momento che le coppie di basi G: C sono più forti delle coppie A:U, sono spesso tollerate discrepanze (errori di accoppiamento) nell’associazione della terza base del codone quando nelle prime due posizioni si formano coppie di basi forti come appunto G:C.

Quindi, la possibilità che tutti e quattro i nucleotidi nella terza posizione specifichino lo stesso amminoacido, così come tutte le altre caratteristiche di cui si è fatta menzione può essersi evoluta come un meccanismo di sicurezza, un buffer (tampone) per ridurre al minimo gli errori nella lettura di tali codoni e quindi le mutazioni.

Questo ci fa capire come la terza base incide meno sul significato di un codone. La spiegazione di questa caratteristica verrà qui avanti fornita e va ricercata nel meccanismo chimico della traduzione.

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È stato inizialmente proposto che esistesse uno specifico anticodone di tRNA per ciascun differente codone, ma, se così fosse, dovrebbero esistere almeno 61 diversi tRNA, con l’aggiunta dei 3 tRNA che riconoscono i codoni di stop.

In seguito, però, vennero prodotte prove che dimostravano che varie specie di tRNA a sequenza nota e altamente purificati potevano riconoscere numerosi codoni diversi; inoltre vennero scoperti casi in cui una base dell’anticodone non era una delle quattro canoniche, ma era costituita da una base diversa, l’inosina: come tutte le altre basi non canoniche che si ritrovano nei tRNA, questa viene generata attraverso la modifica enzimatica di una base presente all’interno della catena polinucleotidica tRNA.

In particolare, l’inosina deriva dall’adenina, il cui carbonio in posizione 6 viene deaminato per dare il gruppo chetonico dell’inosina (si ricordi che l’inosina è in realtà un nucleoside composto dal ribosio e dalla base ipoxantina).

Nel 1966, Francis Crick introdusse il concetto di appaiamento tentennante (codone-anticodone, anche detto tentennamento) per spiegare queste osservazioni.

Secondo tale concetto, la base all’estremità 5’ dell’anticodone ovvero la prima base dell’anticodone (cui corrisponde la terza nel codone, vedi figura sopra), non è spazialmente confinata differentemente dalle altre due, cioè risente meno della presenza delle basi adiacenti rispetto alle altre due dell’anticodone e questa peculiarità le consente di formare legami idrogeno con una “qualsiasi” (in realtà ci sono delle piccole restrizioni) delle diverse basi situate all’estremità 3’ di un codone, tuttavia non tutte le combinazioni sono possibili:

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Se nella prima base dell’anticodone è presente una C, questa si può soltanto appaiare con la G del codone, quindi è possibile soltanto l’appaiamento canonico; stessa cosa se presente la A nella prima base dell’anticodone, questa potrà appaiarsi con la U del codone.

Un appaiamento più ampio si può già avere se la prima base dell’anticodone è la G, infatti questa si può appaiare sia con la C che con la U di un codone.

Se poi, ad esempio, è l’Uracile a trovarsi nella posizione di oscillazione dell’anticodone, può appaiarsi con l’Adenina o la Guanina, mentre l’Inosina nella prima posizione dell’anticodone può accoppiarsi con Uracile, Citosina o Adenina (Fig. accanto).

Gli accoppiamenti consentiti dalle regole del tentennamento sono soltanto quelli che forniscono distanze ribosio-ribosio prossime a quella delle coppie standard di basi A: U o G: C: le coppie purine-purine (ad eccezione delle coppie I: A) o pirimidina-pirimidina darebbero distanze ribosio-ribosio rispettivamente troppo lunghe o troppo corte.

In generale, le regole di oscillazione non consentono ad una singola molecola di tRNA di riconoscere quattro codoni diversi, infatti, soltanto al massimo tre codoni possono essere riconosciuti da un singolo tRNA e questo caso, tra l’altro, accade solo quando l’inosina occupa la prima (al 5’) posizione dell’anticodone (in quanto, come si è detto questa può appaiarsi sia con l’Uracile che con la citosina o con l’adenina in un codone del trascritto).

Quasi tutte le prove raccolte dal 1966 sino ad oggi supportano comunque il concetto di oscillazione: il concetto ha previsto correttamente che esistono almeno tre tRNA per i sei codoni serinici (UCU, UCC, UCA, UCG, AGU e AGC). Gli altri due aminoacidi (leucina e arginina) codificati da sei codoni presentano anche tRNA diversi per i gruppi di codoni che differiscono nella prima o nella seconda posizione.

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Giustamente, ci si chiede come sia possibile che basi, quali la Guanina, l’Uracile e l’Inosina possano appaiarsi con basi differenti da quelle canoniche o con più basi diverse.

La spiegazione, da un punto di vista molecolare, è fornita dall’oscillazione della base al 5’ dell’anticodone è in grado di oscillare, e tale fenomeno è stato utilizzato per spiegare e reggere la teoria, poi diventata un concetto, dell’appaiamento tentennante codone-anticodone.

L’oscillazione della prima base dell’anticodone le è consentita perché, come si è accennato precedentemente, la sua posizione non è confinata dalla presenza di basi adiacenti o, che a dir si voglia, questa base è in grado di possedere una mobilità maggiore rispetto alle altre che costituiscono l’anticodone.

L’oscillazione della base (si attenzioni che oscilla la base e non l’intero nucleotide) le consente di formare, attraverso i propri gruppi reattivi, legami idrogeno con altre basi generando appaiamenti diversi da quelli standard.

Nella struttura tridimensionale del tRNA, le tre basi dell’anticodone, ed anche le due basi successive (al 3’) nell’ansa dell’anticodone, sono tutte orientate nella stessa direzione, e la loro conformazione esatta è determinata dalle interazioni tra le superfici piatte delle basi impilate (Figura sopra).

In tal modo, la prima base (in posizione 34, al 5’) dell’anticodone si trova all’estremità della pila ed è probabilmente meno limitata nei movimenti di quanto non lo siano le altre due basi dell’anticodone poiché non risente della stessa intensità delle interazioni (interazioni di impilamento) di cui invece risentono le altre due basi: se infatti si attenziona la sua posizione, la posizione 34 sul tRNA, si nota come effettivamente, seppure da un lato questa base sia piuttosto vicina alla seconda base dell’anticodone (in posizione 35 del tRNA) con cui sicuramente interpone delle interazioni di impilamento, dall’altro però la base in posizione 33 si trova molto più distaccata da essa quindi certamente non fa risentire il proprio ingombro sterico e non determina la generazione di forze di impilamento di intensità tale da mantenere ben in posizione la prima base dell’anticodone.

Da ciò infatti deriva la variabilità della base nella terza (al 3’) posizione del codone.

Al contrario invece, la terza base dell’anticodone (quella al 3’) non solo si trova nella parte mediana della pila, ma è sempre affiancata da un’ingombrante purina modificata, pertanto, la restrizione dei suoi movimenti potrebbe spiegare perché non si osserva mai variabilità nella prima posizione (al 5’) del codice genetico standard.

Discorso molto simile poi vale per la seconda base dell’anticodone, strettamente impilata e confinata dalle due adiacenti (la prima al 5’ e la terza al 3’) quindi vincolata da interazioni e pertanto impossibilitata ad oscillare.

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Il codice genetico sottostà a tre regole principali:

• I codoni vengono letti sempre in direzione 5’ → 3’;
• I codoni non si sovrappongono e il messaggio non contiene interruzioni: il ribosoma infatti posiziona un codone alla volta all’interno dei propri siti.
• Il messaggio viene letto con uno schema di lettura fisso, la cosiddetta ORF, determinato dal codone di inizio.

Date queste tre linee guida, bisogna comunque tenere conto del fatto che, come analizzato nel capitolo dedicato (capitolo 8), le mutazioni puntiformi, pur avvenendo anche casualmente, possono alterare la sequenza di un gene: come spesso si è detto, un’alterazione che cambia un codone specifico per un amminoacido in un codone specifico per un altro amminoacido viene detta mutazione missenso.

La conseguenza è che un gene che porta una mutazione missenso produrrà una proteina in cui un singolo amminoacido è stato sostituito da un altro, come nell’esempio classico dell’anemia falciforme, in cui il glutammato in posizione 6 nella subunità β-globina dell’emoglobina è sostituito da una valina.

Un effetto più drastico si ha quando l’alterazione causa la comparsa di un codone di stop, tale mutazione viene detta mutazione nonsenso o mutazione di stop: se tale mutazione avviene nei pressi del centro di una sequenza codificante di un qualsiasi messaggero, dal ribosoma viene rilasciato un polipeptide incompleto, dovuto alla terminazione prematura della traduzione.

Le dimensioni della catena polipeptidica incompleta dipendono dalla posizione in cui è avvenuta la mutazione nonsenso, quindi di rimando, la gravità dell’effetto della mutazione è determinata da quanto risulti mutato il polipeptide prodotto: infatti le mutazioni che avvengono vicino all’inizio di un gene producono polipeptidi molto corti, mentre quelle che avvengono vicino alla fine producono polipeptidi di lunghezza quasi normale.

Come si è visto nel Capitolo precedente, gli mRNA che contengono codoni di stop prematuri vengono degradati rapidamente nelle cellule eucari