Riassunti di Biologia Molecolare MODULO 2 - Da Ricombinazione Sito-Specifica a Sintesi Proteica

Università di Catania

Luigi Fiorentino

Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

Modulo 2

Modulo 2: Adattamenti della ricombinazione a situazioni specializzate: la ricombinazione sito-specifica. I trasposoni a DNA - I retrotrasposoni. Esempi di regolazione della trasposizione.

La trascrizione – le RNA polimerasi – la trascrizione nei batteri e negli eucarioti. Maturazione dell’RNA – lo splicing ed il suo macchinario – lo splicing alternativo – l’editing dell’RNA.

La sintesi proteica nei procarioti e negli eucarioti – classi di RNA coinvolte nella traduzione – il ribosoma - fasi della traduzione.

Capitolo 10: La ricombinazione sito-specifica e la trasposizione

Finora abbiamo trattato la ricombinazione omologa e alcuni suoi risvolti, esistono tuttavia altri processi che garantiscono tanto nei procarioti quanto negli eucarioti la ricombinazione genica: la ricombinazione conservativa sito-specifica (conservative site-specific recombination, CSSR) e la ricombinazione per trasposizione (in genere detta trasposizione) che nel loro insieme sono responsabili di molti riarrangiamenti del DNA (che dimostrano la plasticità del genoma). La prima avviene tra due definiti elementi di DNA, mentre la trasposizione è un evento di ricombinazione tra sequenze specifiche e siti del DNA non specifici (ossia le sequenze trasponibili sono specifiche, ma possono trasporre in qualsiasi regione del DNA del cromosoma batterico, senza specificità) e rappresenta la principale fonte di mutazione spontanea.

I due tipi di ricombinazione genetica determinano effetti importanti che confermano la plasticità del genoma ed hanno in comune alcune fondamentali caratteristiche molecolari, in particolare la presenza di proteine, le ricombinasi, che riconoscono le specifiche sequenze di DNA dove deve avvenire la ricombinazione. Le ricombinasi avvicinano ed uniscono questi specifici siti in un complesso nucleoproteico, detto complesso sinaptico all’interno del quale, queste catalizzano il taglio e la riunione delle molecole dell’acido nucleico provocando o un’inversione del tratto di DNA o il suo movimento verso un nuovo sito.

Ricombinazione conservativa sito-specifica

La ricombinazione conservativa sito-specifica (CSSR), è normalmente il meccanismo utilizzato dal fago nell’evento dell’infezione della cellula del procariote ospite: il segmento di DNA che viene spostato porta sul sito dello scambio genico degli specifici elementi, costituiti da corte sequenze (15/20 paia di basi), detti siti di ricombinazione. Un tipico, non a caso, esempio di questo tipo di ricombinazione è dato dall’ŝŶƚĞŐƌĂnjŝŽŶĞĚĞůŐĞŶŽŵĂĚĞůĨĂŐŽʄŶĞůĐƌŽŵŽƐŽŵĂďĂƚƚĞƌŝĐŽ, durante la quale la ricombinazione riguarda sempre esattamente la stessa sequenza nucleotidica all’interno di due siti di ricombinazione, uno sul DNA fagico e l’altro su quello batterico.

I siti di ricombinazione portano due tipi di elementi di sequenza: quelli specificamente legati dalla ricombinasi e le sequenze dove avviene il taglio del DNA e la riunione.

Comunque, la CSSR può dare origine a tre diversi tipi di riarrangiamento del DNA:

• L’inserzione di un segmento di DNA in un sito specifico a struttura simile nel DNA di un altro organismo (come avviene durante l’ŝŶƚĞŐƌĂnjŝŽŶĞĚĞůĨĂŐŽʄ = formazione del profago);
• La delezione di un tratto di DNA (es: reversione del profago);
• L’inversione di un pezzo di doppia elica.

Il risultato finale dipende dall’organizzazione dei siti di riconoscimento per la ricombinazione e dalla direzionalità di certe sequenze sulla molecola o le molecole di DNA che partecipano all’evento. Ciascun sito di ricombinazione è costituito da un paio di sequenze di riconoscimento della ricombinasi palindromiche (indicate in rosso e blu scuro nella figura), organizzate in modo simmetrico: tali sequenze fiancheggiano una corta sequenza centrale asimmetrica, nota come regione dello scambio non palindromica (in nero), dove avviene il taglio e la riunione del DNA (è quella che nei fatti viene scambiata al termine dell’evento e quindi subisce ricombinazione).

Per effetto della direzionalità delle sequenze della regione di scambio a monte e a valle, un sito di ricombinazione ha sempre una polarità, l’orientamento dei due siti presenti su una sola molecola di DNA può essere o del tipo ripetizione invertita o ripetizione diretta: la ricombinazione tra un paio di siti invertiti inverte il pezzo di DNA tra di essi compreso; al contrario, la ricombinazione che avviene con il medesimo meccanismo tra due siti organizzati in modo diretto (non invertiti) provoca la delezione del tratto di DNA incluso mentre, si ha un’inserzione quando due siti di ricombinazione presenti su due molecole diverse sono uniti per lo scambio.

Famiglie di ricombinasi

Nelle cellule esistono due famiglie di ricombinasi per le reazioni conservative sito-specifiche: le ricombinasi in serina e le ricombinasi in tirosina; per entrambe le famiglie, il meccanismo fondamentale consiste nella formazione, durante il taglio del DNA, di un intermedio covalente proteina-DNA.

Per la ricombinasi in serina è la catena laterale di un residuo di serina situata nel sito attivo della proteina a portare l’attacco (nucleofilo) ad uno specifico legame fosfodiesterico presente sul sito di ricombinazione, mentre per la ricombinasi in tirosina è la catena laterale di una tirosina, presente nel sito attivo, che attacca e poi unisce covalentemente il DNA; in entrambi i casi, successivamente al legame sulle sequenze di riconoscimento le ricombinasi tagliano a livello della sequenza fiancheggiante (la regione di scambio non palindromica e asimmetrica), determinando la formazione di un intermedio covalente proteina-DNA (fig. sotto) che conserva l'energia del legame fosfodiesterico, e viene successivamente idrolizzato, (invertendo il processo di taglio) per far sì che i filamenti di DNA possono essere riuniti.

In questa reazione inversa, un gruppo 3’ OH del DNA interrotto attacca il legame covalente che unisce la proteina al DNA, processo che richiude covalentemente la rottura della doppia elica e libera una molecola di ricombinasi.

La CSSR avviene sempre tra due siti di ricombinazione: come abbiamo visto precedentemente, questi siti possono essere sulla stessa molecola di DNA (per l’inversione e la delezione), o su due molecole diverse (per l’integrazione); ogni sito di ricombinazione è costituito da una doppia elica di DNA, per questo per dare origine al DNA riarrangiato, si deve avere la rottura di quattro singoli filamenti di DNA (due per ogni duplex) e, quindi, la riunione con un diverso filamento partner.

Una molecola di ricombinasi attua tutte queste reazioni di taglio formando un tetramero (un dimero per ogni duplex). La differenza tra le due famiglie di ricombinasi sta nel fatto che mentre quelle in serina tagliano ed uniscono tutti e quattro i filamenti di DNA in un singolo ciclo di taglio, quelle in tirosina, dapprima tagliano ed uniscono due filamenti di DNA e, solo dopo, tagliano ed uniscono gli altri due filamenti e completano così la reazione in due cicli di taglio successivi.

Ricombinasi in serina

Le ricombinasi a serina aderiscono alle sequenze di riconoscimento palindromiche a livello dei loro siti su ciascun duplex. Il residuo di serina di ciascuna subunità su ogni duplex porta un attacco nucleofilo al fosforo del fosfato in 5’ applicando un nick sfalsato su ciascun filamento del duplex di circa 2 nucleotidi.

La formazione dell’intermedio covalente proteina(serina)-5’P-DNA permette lo scambio, guidato dalle subunità della proteina (R3 si scambia con R1) nella maniera già analizzata precedentemente (invasione e successiva formazione dell’intermedio di Holliday), la risoluzione finale è mediata dall’attacco nucleofilo del gruppo 3’OH libero del nuovo filamento a carico dell’intermedio covalente DNA-proteina: questo attacco di fatto permette la reversione del taglio e la riunione dei filamenti con il rilascio da ciascun duplex delle ricombinasi.

A questo punto si è avuta ricombinazione a livello della regione centrale, non palindromica del sito, ossia la cosiddetta regione di scambio a sequenza direzionata.

Esempi di ricombinasi in serina possono essere la trasposasi del fago Tn3 e la resolvasi. La caratteristica più cruciale della struttura cristallografica di una ricombinasi a serina è l'interfaccia ampia e piatta tra i due dimeri della ricombinasi: quello “superiore” e quello “inferiore” (Fig. a).

Questa struttura è in gran parte idrofobica e fornisce una piccola barriera alla rotazione delle metà superiore e inferiore del complesso l’una attorno all’altra. Tuttavia, alcune regioni a carica complementare (positivo-negativo o viceversa) possono servire a stabilizzarne la struttura in modo specifico nella orientazione iniziale e in quella ruotata di 180°, pertanto, l’analisi di questo complesso supporta fortemente il modello secondo cui il meccanismo di ricombinazione sia costituito prima dal taglio del DNA con formazione dell’intermedio covalente enzima-DNA, poi una rotazione di 180° dei dimeri nel complesso proteina-DNA; e infine l’attacco da parte dei terminali 3’-OH a carico degli intermedi risolvasi-DNA per l’unione dei filamenti (joining) nella configurazione ricombinata.

Esperimenti più precisi hanno successivamente consentito di risolvere una volta per tutte il meccanismo che attraverso successive rotazioni a carico dell’enzima porta alla ricombinazione sito-specifica di due tratti di DNA a livello dei siti di ricombinazione (vedi figura prima).

Ricombinasi in tirosina

Per quanto riguarda la famiglia delle ricombinasi in tirosina, anche in questo caso le subunità della ricombinasi (un tetramero) si legano ciascuno ad un duplex a livello delle rispettive sequenze di riconoscimento sul sito di ricombinazione. L’ossidrile in catena laterale della tirosina a livello del sito catalitico apporta un attacco nucleofilo al fosforo in 3’ di un nucleotide a livello del sito di scambio, il taglio ancora una volta è sfalsato di almeno 2 nucleotidi su ciascun filamento del duplex.

A questo punto l’intermedio covalente è praticamente identico a quello che si forma con le ricombinasi in serina, se non fosse che proprio per via della diversa localizzazione dal taglio, la proteina è legata al DNA attraverso il fosforo al 3’ quindi, l’intermedio sarà: proteina (tirosina) -3’P-DNA ed anche in questo caso l’energia di legame conservata nell’intermedio servirà a revertire il taglio nella riunione dei filamenti.

L’intermedio guida lo scambio che nella fattispecie avviene quando ciascuna estremità di taglio 5’-OH sui filamenti tagliati apporta un attacco nucleofilo all’intermedio sull’altra doppia elica successivamente all’invasione del filamento e la formazione della giunzione di Holliday. Solo a questo punto anche gli altri due filamenti ancora intatti di ciascun duplex subiscono il taglio ad opera delle subunità di ricombinasi legate ad essi (R2 e R4) per avviare un secondo ciclo di scambi, le estremità 5’-OH del nick agiscono sugli intermedi covalenti reciproci DNA-proteina con lo stesso meccanismo precedentemente visto, scambiandosi il partner e risolvendo così, allo stesso tempo, la giunzione di Holliday precedentemente formatasi.

Esempi di ricombinasi a tirosina sono le Ointegrasi del fago e le ricombinasi Cre del fago P1 e le ricombinasi XerC e XerD di E. coli importanti per il completamento della replicazione.

La ricombinasi Cre

Un ottimo esempio di ricombinasi in tirosina è fornito dalla struttura della ricombinasi Cre: un enzima codificato dal fago P1, che serve a linearizzare il genoma virale durante l'infezione. I siti di ricombinazione del DNA, su cui Cre agisce, sono detti siti lox: le strutture Cre-lox mostrano che la ricombinazione richiede quattro subunità di Cre, quali ciascuna delle è legata ad un sito di legame sulla molecola di DNA substrato.

Generalmente la conformazione del DNA in queste fasi è una struttura planare cruciforme con ogni “braccio” di questa giunzione legato da una subunità Cre. Il tetramero Cre esiste in due diverse conformazioni, 1 e 2, con due subunità ciascuna (un dimero ciascuna). Solo in una di queste conformazioni può tagliare e riunire il DNA, quindi, solo una coppia di subunità per volta è in una conformazione attiva (in verde), nel secondo ciclo di taglio la coppia di subunità nella conformazione attiva viene switchiata nella forma inattiva mentre le altre due subunità precedentemente inattive vengono attivate.

Questo scambio è critico per il controllo della progressione della ricombinazione e garantisce che il meccanismo di scambio avvenga in modo sequenziale, ossia che “un filamento alla volta” venga ricombinato. Nella prima fase del processo le due subunità attive della tirosina ricombinasi Cre apportano, grazie alla presenza dell’ossidrile in catena laterale della tirosina sul sito catalitico, un attacco nucleofilo al livello del DNA substrato: i due duplex sono molto vicini, uniti da una sinapsi, a formare dei bracci.

A questo punto si determina un nick con conseguente formazione dei primi due intermedi covalenti Cre-3’P-DNA ed un’estremità 5’ libera su ciascun duplex: è la situazione ideale per avviare lo scambio ove ciascuno dei due filamenti liberi al 5’ a livello della sinapsi invade il duplex del reciproco intermedio, con la formazione della giunzione di Holliday e scioglimento dell’intermedio per reversione del taglio.

Dopo il taglio del primo filamento le due subunità della ricombinasi attive si disattivano mentre quelle precedentemente inattive subiscono una variazione allosterica che ne causa l’attivazione: si dà avvio ad un secondo ciclo di taglio con formazione di intermedio covalente DNA-3’P-proteina e liberazione dell’estremità 5’-OH la quale su ciascun filamento eterologo guidata dalle subunità di Cre invade il duplex opposto e nella reversione del taglio con scioglimento dei reciproci intermedi DNA-proteine si ha quindi anche la risoluzione conseguenziale della giunzione di Holliday prima formata.

Il risultato è un DNA ricombinato in ciascun duplex, a questo punto le ricombinasi vengono rilasciate dai loro siti di riconoscimento ed il processo è terminato.

Funzioni biologiche della ricombinazione sito-specifica

Le cellule e i virus fanno uso della ricombinazione conservativa sito-specifica per una grande varietà di funzioni biologiche, in alcuni casi inseriscono il proprio DNA nel cromosoma ospite. In altri casi, la ricombinazione sito-specifica è usata per alterare l’espressione genica o per aiutare a mantenere l’integrità strutturale di molecole di DNA circolare durante la replicazione del DNA, la ricombinazione omologa e la divisione cellulare.

La segregazione dei cromosomi circolari può quindi richiedere un evento di ricombinazione sito-specifica: nel momento in cui inizia la replicazione del DNA, via via si hanno due copie della stessa molecola, e sequenze omologhe tra i duplex in formazione possono già ricombinare, tuttavia se questi intermedi non vengono risolti si potrebbe determinare un blocco della replicazione. La risoluzione di tali intermedi segue il meccanismo della ricombinazione sito-specifica perché avviene a livello di siti specifici mediata da particolari proteine che li riconoscono.

In ogni caso, il confronto di diversi sistemi di ricombinazione sito-specifica mostra alcune caratteristiche generali: tutte le reazioni dipendono strettamente dall’assemblaggio delle ricombinasi sul DNA e dall’avvicinamento dei due siti di ricombinazione; per alcune reazioni questo assemblaggio è estremamente facile in quanto richiede solamente la ricombinasi e le sue sequenze di riconoscimento sul DNA, mentre altre reazioni richiedono proteine accessorie.

Quest’ultime, dette proteine architettoniche, legano specifiche sequenze di DNA, costringendo la curvatura della doppia elica, avvicinando di fatto sequenze specifiche dapprima lontane e di conseguenza stimolando la ricombinazione (o regolando l’espressione genica). Le stesse proteine possono anche controllare la direzione della ricombinazione: se la proteina architettonica curva in un senso il DNA, i siti non palindromi e asimmetrici ossia quelli corrispondenti alla regione di scambio in corrispondenza dei quali avviene il taglio, assumeranno una certa direzione; al contrario, se la curvatura avviene in maniera opposta allora anche questi siti assumeranno direzione opposta (verranno letti in maniera opposta) e in questo modo si avrà un effetto completamente diverso nel processo di ricombinazione; in tal modo ad esempio la cellula si assicura che avvenga l’integrazione di un segmento di DNA e non la reazione inversa, ossia la sua escissione.

Un esempio di ricombinasi in tirosina è quello dell’integrasi del fago ďĂƚƚĞƌŝŽĨĂŐŽʄŝŶĨĞƚƚĂƵŶďĂƚƚĞƌŝŽ͕ƵŶĂƐĞƌŝĞĚŝĞǀĞŶƚŝƌĞŐŽůĂƚŝǀi porta o all’instaurarsi di uno stato lisogenico quiescente o alla moltiplicazione fagica, in un processo detto crescita litica. Nel primo stato si deve avere l’integrazione del DNA f