Quaderno di laboratorio di Biochimica funzionale

Quaderno di laboratorio

Viana Ilaria

Matricola 20027823

Corso di laurea in Biotecnologie

Indice

• Esperienza online numero 1: enzyme assay...................................................................pag.1
• Esperienza online numero 2: enzyme purification.........................................................pag.10
• Esperienza online numero 3: radio-immunoassay.........................................................pag.14
• Esperienza in laboratorio numero 1: spettrofotometro..................................................pag.17
• Esperienza in laboratorio numero 2: cromatografia a colonna....................................pag.20
• Esperienza in laboratorio numero 3: biochimica clinica...............................................pag.23
• Esperienza online numero 1: calcolo concentrazione proteica.....................................pag.25
• Esperienza online numero 2: diluizioni, concentrazioni e buffer..................................pag.26

Esperienza online

Esperienza n°1: enzyme assay

L’enzyme assay è un saggio enzimatico che analizza la cinetica di un enzima, ovvero una proteina che funge da catalizzatore biologico. La cinetica enzimatica è definita come lo studio della velocità e di come varia la reazione in funzione della variazione di parametri esterni, quindi la capacità dell’enzima di legarsi ad un substrato e aumentare la velocità di formazione del prodotto, misurabile attraverso l’analisi di un prodotto fluorescente o radioattivo.

I parametri fondamentali da valutare per conoscere il funzionamento ottimale di un enzima sono:

• pH: gli enzimi sono sensibili al pH perché esso, più ci si allontana dal range ottimale, più altera la forma tridimensionale dell’enzima rompendo i suoi legami ionici e a idrogeno e lo rende quindi inefficace; la curva della velocità di una reazione catalizzata in funzione della variazione del pH si presenta con un andamento a campana.
• Tempo di incubazione: è importante valutare quanto tempo lasciar agire l’enzima perché dopo una certa soglia, tempo ottimale, comincia ad accumularsi prodotto con conseguente consumo di substrato e la velocità di reazione diminuisce; il grafico della velocità si può approssimare ad una retta fino al tempo ottimale, dopo il quale la velocità si assesta.
• Quantità di enzima utilizzato: il grafico è lineare fino alla quantità ottimale poi a quantità troppo elevate tende a cadere.
• Temperatura di incubazione: la temperatura è fondamentale che sia non troppo elevata perché l’enzima in questo caso verrebbe denaturato e quindi reso inattivo, ma è anche necessario che non sia troppo bassa poiché l’enzima lavorerebbe molto lentamente; è consigliabile tenere una temperatura leggermente inferiore rispetto a quella massima.
• Quantità di substrato utilizzato: la velocità massima si raggiunge nel momento in cui l’enzima è saturato dal substrato; il grafico rappresenta la curva di Michaelis-Menten ovvero la rappresentazione della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato, ramo di iperbole.
• Presenza di inibitori: gli inibitori sono molecole che si legano all’enzima diminuendo la velocità di reazione; possono essere competitivi quando non vanno ad intaccare la Vmax ma alzano il valore della Km, non competitivi quando diminuiscono la Vmax senza variare la Km oppure acompetitivi se intaccano entrambi diminuendoli di uno stesso fattore.

Questo saggio quindi permette di valutare la Km, quantità di substrato che mi fornisce la metà della velocità massima, e la Vmax dell’enzima; dal grafico di Michaelis-Menten possiamo ottenere la Vmax e la Km ricavando i valori della velocità e dalla concentrazione di substrato e facendone i reciproci ottenendo così una relazione lineare. 1

L’enzima in considerazione per questa esperienza è l’enzima numero 3 tra i cinque proposti. Si possono variare i parametri uno alla volta, generando per ogni parametro variato sempre 11 campioni:

pH

1. Il range di pH tra cui scegliere va da 1 a 14, selezionando questo intervallo vengono prodotti 11 campioni che vengono incubati a parametri fissi, tempo di incubazione 10 minuti, temperatura di incubazione 30°C, quantità di enzima utilizzato 100 µL, quantità di substrato utilizzato 100 mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti. Il risultato dell’esperimento evidenzia che a pH molto acidi, sotto 5, e a pH molto basici, sopra 9, l’enzima viene denaturato e quindi reso inefficace, mentre tra 6 e 8 l’efficacia dell’enzima cresce fino ad un punto massimo e poi diminuisce fino a zero. Ripetendo l’esperimento riducendo l’intervallo di pH a 6-8 notiamo che la velocità di reazione dell’enzima è massima a 6,5.

Grafico della variazione del prodotto in funzione del pH nell’intervallo 1 - 14

Grafico della variazione del prodotto in funzione del pH nell’intervallo 5 - 9 2

Tempo di incubazione

2. Dopo aver fissato il pH ottimale a 6,5 si può variare il tempo di incubazione per capire dopo quanto tempo la curva inizia ad assestarsi: come primo intervallo il programma fornisce un suggerimento di 0 - 60 minuti come tempo minimo e massimo quindi stabilito questo come range e gli altri parametri, temperatura di incubazione 30°C, quantità di enzima utilizzato 100 µL, quantità di substrato utilizzato 100 mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti, si può notare che la curva è approssimativamente lineare fino a circa 25 minuti. Ripetendo l’esperimento ponendo come range 10 - 30 minuti si può confermare che il tempo di incubazione ottimale per questo enzima è 18 minuti.

Grafico della variazione del prodotto in funzione del tempo di incubazione nell’intervallo 0 - 60 minuti

Grafico della variazione del prodotto in funzione del tempo di incubazione nell’intervallo 10 - 30 minuti 3

Quantità di enzima utilizzato

3. Dopo aver impostato il tempo di incubazione a 18 minuti, si imposta la quantità di enzima che vogliamo introdurre nell’esperimento e come intervallo massimo viene posto 0 - 250 µL con i parametri esterni precedentemente scelti, temperatura di incubazione 30°C, pH 6.5, quantità di substrato utilizzato 100 mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti; dall’esperimento emerge che fino a 200 µL di enzima la curva è approssimativamente lineare, perciò restringendo ancora l’intervallo fino a 200 si può vedere dal grafico che la quantità ottimale di enzima è circa 180 µL.

Grafico della variazione del prodotto in funzione della quantità di enzima nell’intervallo 0 - 250 µL

Grafico della variazione del prodotto in funzione della quantità di enzima nell’intervallo 0 - 200 µL4

Temperatura di incubazione

4. Dopo aver scelto come quantità di enzima da utilizzare 180 µL, è necessario valutare la corretta temperatura a cui incubare perciò poste come condizioni esterne quelle precedentemente scelte, pH 6.5, tempo di incubazione 20 minuti, quantità di substrato utilizzato 100 mmol/L per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti, impostiamo come range di temperatura 0 - 100 °C. Dall’esperimento si può vedere che dopo i 50 °C l’enzima viene inattivato progressivamente; riducendo l’intervallo a 0 - 60 °C si può vedere che la temperatura a cui l’enzima funziona correttamente è 40 °C.

Grafico della variazione del prodotto in funzione della temperatura nell’intervallo 0 - 100 °C

Grafico della variazione del prodotto in funzione della temperatura nell’intervallo 0 - 60 °C5

Quantità di substrato utilizzato

5. Dopo aver scelto come temperatura di incubazione 40 °C bisogna inserire la quantità di substrato che vogliamo introdurre nel campione; si inserisce l’intervallo 0 - 250 µL di substrato e i parametri trovati finora, pH 6.5, tempo di incubazione 18 minuti, quantità di enzima utilizzato 180 µL per un volume totale di 1 ml, inibitori assenti. Si ricava quindi la curva di Michaelis-Menten da cui possiamo ricavare il valore della Km e della Vmax tramite il grafico dei reciproci, 1/S e 1/V.

Grafico di Michaelis-Menten per l’enzima numero 3

Vmax = 1/q = 1/0,0511 = 19,5694716 umol/min

Km=m/q=16,585/0,0511= 324,559687 umol

La Km è alta perciò l’affinità tra substrato e enzima è bassa, ovvero serve un’elevata quantità di substrato per arrivare a metà della velocità massima. 6

Inibitore A

6. Dopo aver valutato l’attività dell’enzima si può provare a inserire un inibitore. Si inserisce l’inibitore alle condizioni esterne trovate precedentemente, pH 6.5, tempo di incubazione 18 minuti, temperatura di incubazione 40 °C, quantità di enzima utilizzato 180 µL, per un volume totale di 1 mL, dai grafici che vengono prodotti dal programma vediamo che a quantità di inibitore basse, 0,125 - 1 mmol/L, l’attività dell’enzima non viene modificata in modo rilevante; aggiungendo più i