Concetti Chiave
- La clonazione genetica inizia con l'isolamento di un plasmide e del DNA contenente il gene desiderato, entrambi trattati con un enzima di restrizione.
- Il frammento di DNA eucariotico viene legato covalentemente al plasmide attraverso l'enzima DNA-ligasi, creando un plasmide ricombinante.
- Il plasmide ricombinante viene introdotto in cellule batteriche, che lo replicano ad ogni divisione, formando cloni cellulari del gene inserito.
- La donazione genica può avvenire anche attraverso DNA virale, con l'inserimento del gene nei fagi e successiva replicazione in E. coli.
- Per le cellule vegetali, si utilizza la "pistola genica" per introdurre il DNA in coltura, sparando particelle metalliche cariche di DNA nelle cellule.
Sperimentalmente ci si serve dell’inserimento di un determinato gene in un plasmide per ottenere molte copie (clone) del gene desiderato.
Processo di clonazione genetica
In una prima fase della donazione genica si isolano un plasmide (vettore di clonaggio) e il DNA recante il gene desiderato. Nella clonazione genetica il gene da clonare appartiene a una molecola di DNA eucariotico.
Successivamente sia il plasmide sia il DNA eucariotico vengono trattati con uno stesso enzima di restrizione,che taglia le molecole liberando estremità coesive; si isola il frammento del DNA eucariotico recante il gene da donare.
Il plasmide e il frammento del DNA eucariotico vengono messi in contatto e le estremità coesive del plasmide si legano covalentemente con quelle del
frammento di DNA; l’enzima DNA-ligasi rende stabile il legame.
Il plasmide ricombinante viene aggiunto a una coltura batterica e introdotto in questo modo in una cellula batterica, che lo replica ad ogni divisione.
Con la riproduzione batterica coincide così la vera donazione del gene: il batterio dividendosi forma un clone cellulare e il gene inserito nel plasmide ricombinante viene a sua volta donato.
Tecniche di donazione genica
Quando il vettore di donazione è rappresentato da DNA virale, il gene desiderato viene inserito nei DNA di un fago, digerito con un enzima di restrizione; il DNA ricombinante viene poi introdotto in cellule di E. coli ove si replica, formando un clone di fagi, che recano il gene in esame
La donazione genica può avvenire anche utilizzando colture di cellule eucariotiche in vitro: in tal caso il DNA ricombinante viene introdotto nelle cellule attraverso microiniezioni oppure mediante elettroporazione, procedimento che procura l’apertura di pori della membrana plasmatica mediante il passaggio di un impulso elettrico in una soluzione contenente le cellule.
Per le cellule vegetali, che in coltura si prestano molto facilmente alle manipolazioni genetiche, si usa la “pistola genica”, ovvero si spara nelle cellule il DNA da donare, adeso a particelle microscopiche metalliche.
Domande da interrogazione
- Qual è il primo passo nel processo di clonazione genetica?
- Come avviene l'inserimento del gene nel plasmide?
- Quali tecniche possono essere utilizzate per la donazione genica nelle cellule eucariotiche?
Il primo passo consiste nell'isolamento di un plasmide e del DNA contenente il gene desiderato, che appartiene a una molecola di DNA eucariotico.
Il plasmide e il DNA eucariotico vengono trattati con lo stesso enzima di restrizione, che taglia le molecole e libera estremità coesive; successivamente, queste estremità si legano covalentemente grazie all'enzima DNA-ligasi.
Nelle cellule eucariotiche, il DNA ricombinante può essere introdotto tramite microiniezioni o elettroporazione, mentre per le cellule vegetali si utilizza la "pistola genica" per sparare il DNA, adeso a particelle metalliche.
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