Concetti Chiave
- Il clonaggio genico consente di produrre grandi quantità di segmenti di DNA specifici attraverso processi di frammentazione e clonazione.
- Il DNA genomico viene suddiviso in frammenti più piccoli mediante nucleasi di restrizione, creando una genoteca genomica tramite l'uso di vettori plasmidici come BAC.
- Per identificare un gene all'interno dei frammenti clonati, si utilizza una sonda complementare che ibrida con il clone corretto nella genoteca.
- La genoteca di cDNA è composta da DNA complementare prodotto da RNA messaggeri, differente dalla genoteca genomica che contiene introni.
- Ogni genoteca di cDNA varia a seconda del tipo di tessuto da cui è estratto l'mRNA, fornendo rappresentazioni specifiche delle sequenze codificanti.
Con il clonaggio genico è possibile, produrre grandi quantità di un determinato segmento di DNA.
Come possiamo identificare uno specifico gene che vogliamo clonare?
Processo di frammentazione del DNA
Viste le enormi dimensioni della molecola di DNA, per rendere più semplice la ricerca di un gene che si vuole clonare, il primo passo consiste nel suddividere il DNA genomico in frammenti più piccoli, che possano essere maneggiati più facilmente. Uno dei procedimenti più utilizzati consiste nell’estrarre il DNA da un tessuto e nel tagliarlo con una nucleasi di restrizione, formando migliaia di frammenti. In condizioni sperimentali adeguate si inserisce ognuno dei frammenti in un vettore plasmidico adatto. Il vettore generalmente utilizzato in queste procedure è chiamato BAC (cromosoma artificiale batterico), un vettore plasmidico di Escherichia coli. I plasmidi ricombinanti vengono messi in una coltura di Escherichia coli a una concentrazione tale da far sì che ogni batterio inglobi un solo plasmide. Tutti i frammenti vengono così clonati e nel loro insieme formano una genoteca genomica.
Utilizzo di sonde per l'identificazione
Come si fa a trovare un gene in questa libreria composta da tutti i frammenti clonati?
Si può utilizzare una specifica sonda, complementare al gene che cerchiamo, e farla ibridare con i nostri frammenti, in modo da individuare il clone corretto. A seconda del tipo di tecnica utilizzata per frammentare il DNA genomico, si possono costruire molte genoteche genomiche diverse.
Genoteca di cDNA e differenze
Un altro tipo di banca del DNA è la genoteca di cDNA (DNA complementare). Anch’essa, come quella genomica, è composta da cloni di frammenti di DNA, ma con una differenza sostanziale: il DNA di una genoteca di cDNA non è DNA genomico ma DNA copiato da RNA messaggeri estratti da uno specifico tessuto. Per preparare una genoteca di cDNA si estrae l’mRNA dalle cellule e, utilizzando la tascrittasi inversa, si copiano, ottenendo così molecole di DNA complementare (cDNA). Questi cDNA vengono poi clonati come i frammenti delle genoteche genomiche, per produrre una genoteca di cDNA. Poiché le cellule dei vari tessuti producono differenti molecole di mRNA, per ogni tipo di tessuto si otterrà una diversa genoteca di cDNA. Un’importante differenza tra i due tipi di librerie del DNA è che le genoteche genomiche contengono grandi quantità di introni, mentre i cloni di cDNA contengono solo sequenze codificanti.
Domande da interrogazione
- Qual è il primo passo per identificare un gene da clonare?
- Come si può trovare un gene specifico all'interno di una genoteca genomica?
- Qual è la principale differenza tra una genoteca genomica e una genoteca di cDNA?
Il primo passo consiste nella frammentazione del DNA genomico in pezzi più piccoli, utilizzando una nucleasi di restrizione per formare migliaia di frammenti, che vengono poi inseriti in un vettore plasmidico come il BAC, creando una genoteca genomica.
Si utilizza una sonda specifica, complementare al gene cercato, che ibrida con i frammenti clonati per individuare il clone corretto all'interno della libreria.
La differenza principale è che la genoteca genomica contiene introni e rappresenta il DNA genomico, mentre la genoteca di cDNA è composta da sequenze codificanti ottenute da RNA messaggeri, quindi non contiene introni.
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