Concetti Chiave
- Per inserire un gene in un plasmide, il DNA plasmidico viene trattato con un'endonucleasi di restrizione e unito al gene tramite la DNA ligasi, creando DNA ricombinante.
- La DNA ligasi è fondamentale nella duplicazione del DNA, unendo frammenti di Okazaki e consentendo la congiunzione di DNA anche da organismi diversi.
- Questo enzima catalizza la formazione di legami covalenti tra i nucleotidi, ricostruendo l'ossatura zucchero-fosfato del DNA.
- Dopo l'inserimento del gene nel plasmide, il vettore viene trasformato in batteri come Escherichia coli, che si moltiplicano rapidamente per ottenere molteplici copie del DNA ricombinante.
- Il recupero del gene esogeno avviene tagliando il plasmide con enzimi di restrizione e separando il gene tramite elettroforesi su gel.
Inserimento del gene nel plasmide
Per inserire in un plasmide il gene che si vuole clonare, è necessario trattare il DNA plasmidico purificato con una endonucleasi di restrizione (la stessa utilizzata per ottenere dal DNA di origine il gene o frammento d’interesse). Il plasmide viene tagliato in un solo punto e le estremità libere vengono unite con quelle del gene esogeno, grazie all’azione di un enzima: la DNA ligasi. Si forma così una molecola stabile di DNA ricombinante.
Funzione della DNA ligasi
Nelle cellule, la DNA ligasi è un enzima con la funzione di unire tra loro, durante la duplicazione del DNA, i frammenti di Okazaki. Viene ampiamente utilizzato nella tecnologia del DNA ricombinante, poiché consente al biologo di congiungere due frammenti qualsiasi di DNA mediante legami covalenti.
La DNA ligasi è in grado di unire in provetta anche DNA provenienti da organismi diversi, formando molecole che in natura non esistono. L’enzima DNA ligasi catalizza la congiunzione di due frammenti di DNA di qualsiasi origine, ricostruendo (con consumo di ATP) l’ossatura zucchero-fosfato tra i nucleotidi.
Moltiplicazione del DNA ricombinante
Dopo aver inserito il gene esogeno nel vettore, il plasmide viene introdotto per trasformazione in un batterio (generalmente Escherichia coli, ampiamente utilizzato in ingegneria genetica) e si fa crescere il batterio in un apposito terreno, dove si moltiplicherà molto rapidamente in modo da ottenere un elevato numero di copie del DNA ricombinante.
A ogni ciclo di divisione batterica raddoppia anche il numero di copie della molecola di DNA ricombinante. Dopo circa 24 ore si ottengono centinaia di milioni di copie del plasmide e quindi del gene. I batteri vengono in seguito lisati e viene purificato il DNA plasmidico. Le copie del gene esogeno vengono recuperate tagliando il plasmide con l’apposito enzima di restrizione e separando il gene mediante elettroforesi su gel.
Domande da interrogazione
- Qual è il processo per inserire un gene in un plasmide?
- Qual è il ruolo della DNA ligasi nella tecnologia del DNA ricombinante?
- Come avviene la moltiplicazione del DNA ricombinante?
Per inserire un gene in un plasmide, il DNA plasmidico purificato viene trattato con un'endonucleasi di restrizione per tagliarlo e unire le estremità libere del plasmide con quelle del gene esogeno grazie all'enzima DNA ligasi, formando così una molecola di DNA ricombinante.
La DNA ligasi unisce frammenti di DNA durante la duplicazione e nella tecnologia del DNA ricombinante, permettendo di congiungere due frammenti di DNA di qualsiasi origine mediante legami covalenti, formando molecole che in natura non esistono.
Dopo l'inserimento del gene nel plasmide, il plasmide viene introdotto in un batterio come Escherichia coli, dove si moltiplica rapidamente. Ogni ciclo di divisione batterica raddoppia il numero di copie del DNA ricombinante, portando a centinaia di milioni di copie dopo circa 24 ore.
Accedi a tutti gli appunti
Tutor AI: studia meglio e in meno tempo
