Modulo di Oncologia

Tumorigenesi

La trasformazione neoplastica: cause ed effetti

Lezione 1 Prof. Chiaramonte

• Neoplasia = massa abnorme di tessuto che cresce in modo deregolato e progredisce similmente anche dopo la cessazione dello stimolo iniziale che l’ha causata.
• Iperplasia = c’è uno stimolo iniziale e si ha una crescita di cellule, è una situazione di adattamento e quindi finito lo stimolo si torna al livello di omeostasi, di equilibrio.

Es.: Carcinoma è un tumore delle cellule epiteliali. Si chiamano così nella loro forma maligna, quando hanno invaso o metastatizzato il tessuto circostante.

Cause del cancro

• Di tipo esogeno: sostanze chimiche, virus e batteri, radiazioni.
• Di tipo endogeno: ormoni, dieta, componente ereditaria.
• Agenti, sostanze chimiche, virus, batteri, radiazioni, che inducono mutazioni, modificazioni irreversibili del DNA.
• Alterazioni epigenetiche.
• Elementi non considerati dannosi, ormoni.

Meccanismi di difesa della cellula dalle mutazioni

Meccanismi di difesa della cellula dalle mutazioni: sistemi stereotipati, già attivi, pronti a contrastare il danno genotossico. Immagine slide 5.

1. Blocco della proliferazione e replicazione del DNA: si evita di produrre un clone con il DNA mutato, se trasferito alle cellule figlie il DNA danneggiato viene percepito come corretto, sano.
2. Attiva i meccanismi di riparazione del DNA: riparo del DNA danneggiato e la cellula può riprendere la replicazione e in mitosi trasferire il DNA alle due cellule figlie.
3. Suicidio cellulare o apoptosi per non trasmettere DNA danneggiato alle cellule figlie.

Controllo del ciclo cellulare

Punto 2. Il cancro prevede un ridotto controllo del ciclo cellulare: i punti di controllo impediscono la progressione del ciclo fino al raggiungimento delle caratteristiche necessarie per passare al punto successivo.

Il punto di controllo di G1 è il più importante.

I fattori di crescita come fattori mitogeni sono uno stimolo positivo per il passaggio di questo checkpoint.

In caso di non superamento del checkpoint la cellula va in uno stato di quiescente.

La presenza di danni al DNA, anche in S, la pol può sempre inserirli, si controlla sempre.

I checkpoint G1 e G2 sono simili.

Nel punto di controllo dell’assemblaggio del fuso durante la mitosi, si controlla che i cromosomi siano attaccati correttamente al fuso.

Il meccanismo deputato al controllo dei checkpoint in caso di tumore viene rallentato e le cellule danneggiate superano i punti di controllo più facilmente anche se non tutti i parametri sono rispettati: se una cellula con danno al DNA supera la fase G1 trasmetterà il DNA danneggiato alle cellule figlie.

• La tendenza, propensione della cellula ad acquisire nuove mutazioni, ad oncogeni, oncosoppressori, è chiamata instabilità genetica.

La riparazione del DNA avviene con meccanismi non efficienti: propensione a instabilità genetica.

La sopravvivenza è una caratteristica delle cellule tumorali nonostante il DNA danneggiato, evadono le risposte di difesa al danno ed evitano la morte cellulare, punto 3: propensione a instabilità genetica.

I meccanismi di regolazione sono molto complessi e mediati da centinaia/migliaia di proteine differenti: non c’è un effetto tutto o niente in una cellula tumorale, ci sarà un’indipendenza ma non sarà completamente fuori controllo, se non in fase terminale o in caso di alterazioni ad un gene fondamentale che di solito si trovano in tutti i tipi di tumore ad un certo punto di progressione.

L’obiettivo della risposta cellulare al danno genotossico è:

• Impedire l’acquisizione di mutazione.
• Impedire l’acquisizione di instabilità genetica, = propensione continua ad acquisire mutazioni nel tempo anche quando non c’è la stimolazione genotossica iniziale.

La tumorigenesi come processo multi-fasico

La tumorigenesi è un processo multi-fasico.

L’avvio di un tumore si ha quando la cellula viene definita trasformata: ha acquisito una sufficiente deregolazione tale per cui da questo punto non sarà più controllabile, non si potrà più tornare indietro. Cellula neoplastica.

1. La cellula sana riceve uno stimolo, sostanze cancerogene, stimolazione di tipo mutageno.
2. La cellula acquisisce le prime mutazioni, in oncogeni e oncosoppressori, che vengono fissate al DNA: lievissimo livello di instabilità, al successivo ciclo cellulare è ancora sotto controllo ed è difficile acquisisca ulteriori mutazioni.
3. Per acquisire ulteriori mutazioni la cellula deve, a livello dei punti di controllo del ciclo cellulare, deve avere dei segnali mitogeni, = stimoli proliferativi che possono essere anche fisiologici come gli ormoni, non solo patologici, molto forti da farla entrare in fase di sintesi: trasmissione del DNA, anche se mutato, alle cellule figlie; indipendenza minima dal controllo del ciclo cellulare.
4. Acquisizione di instabilità genetica: deregolati oncogeni e oncosoppressori che controllano processi di crescita, riparazione del DNA...
5. Progressione: dalla prima cellula trasformata si dà origine ad un clone di cellule che nel tempo acquisiranno mutazioni sempre diverse, sotto-cloni diversi geneticamente l’uno dall’altro; conferiscono globalmente alla massa tumorale la capacità di sopravvivere, cooperano, lavorano sinergicamente, a tutte le azioni che l’organismo mette in atto: capacità di invasione tessuto circostante ed eventuale metastatizzazione.

NB.: Processo multi-fasico che prima porta alla formazione di una cellula trasformata e poi progressione e acquisizione di nuove mutazioni che portano ad avere maggiore aggressività e acquisizione di malignità.

Alterazioni permanenti del DNA sono puntiformi, delezioni, aberrazioni...

Tipi di mutazioni

Le mutazioni possono alterare:

• La sequenza codificante: variazione qualitativa dell’azione della proteina codificata.
• Le regioni regolative, promotori, enhancer: variazione quantitativa, espressione maggiore o minore della proteina codificata da quel gene.
• Il numero di copie di un gene: variazione quantitativa.

Le mutazioni si possono suddividere in:

• Mutazioni ereditarie: trasmesse dai genitori e presenti fin dalla nascita; mutazioni sulla linea germinale, ovulo e/o spermatozoo. Circa il 10% dei tumori sono ereditari.
• Mutazioni somatiche: prodotte durante il ciclo vitale di una cellula dell’organismo adulto.

Cause endogene di danno genotossico

1. Errori della DNA polimerasi nella replicazione: inefficienza del proof reading, inefficienza della riparazione mediata da sistema di mismatch repair, presenza di sequenze ripetute, microsatelliti, per la pol difficili da replicare correttamente, slippage = scivolamento.

Effetto blando e che avviene raramente, solitamente i tumori richiedono lo stimolo di un mutageno iniziale.

2. Attacco delle specie reattive dell’ossigeno, ROS, prodotte da intermedi metabolici nella cellula, es.: durante la respirazione cellulare, e non smaltite dal sistema di detossificazione.

Questo comporta per esempio l’acquisizione di un ossigeno in più e cambio di base del DNA.

Cause esogene

Cause esogene: agenti chimici mutageni, radicali liberi dell’ossigeno.

1. Cancerogeni chimici mutageni.
2. Fisiche: radiazioni, asbesto.
3. Agenti infettivi virali: virus della leucemia a cellule T umana, papilloma virus, virus di Epstein-Barr.

Cancerogeni

Gli agenti cancerogeni sono sostanze elettrofile, cioè che possiedono atomi privi di uno o più elettroni nell’orbitale esterno, altamente reattive, che possono reagire con componenti cellulari nucleofile, ricche di elettroni, come il DNA.

Cercano di acquisire stabilità recuperando elettroni da sostanze nucleofile, ricche di elettroni, come il DNA, nelle cellule.

Si dividono in due categorie:

1. Cancerogeni ad azione diretta: per espandere la loro funzione non necessitano di trasformazione chimica.
2. Cancerogeni ad azione indiretta o procancerogeni: richiedono una conversione metabolica in vivo, subire l’azione di alcuni enzimi che li attivano, in genere avviene nel fegato, per diventare attivi e dare origine a cancerogeni terminali.

NB.: I cancerogeni inducono mutazioni, sono mutageni: correlazione diretta. Immagine slide 17-18.

Test di Ames

Per verificare se una sostanza è cancerogena si vede se ha una capacità mutagena. Test di Ames: è un test di mutagenicità che sfrutta la capacità della sostanza di revertire un carattere auxotrofo His- nel batterio Salmonella typhimurium.

Il batterio piastrato necessita istidina dall’esterno per crescere.

Si osserva se la sostanza posta al centro della piastra riesce a revertire il carattere auxotrofo di His- His+, crescono anche in mancanza di istidina.

NB.: Questo è fattibile solo per mutageni con azione diretta, che non devono essere attivati.

Per poter identificare i procancerogeni, si prevede la presenza nel terreno di coltura dell’estratto S9 di fegato di ratto, in cui sono presenti gli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici, principalmente isoforme del citocromo P450, che possono attivare l’effetto mutageno. Si conta il numero di colonie cresciute senza istidina alla fine.

L’efficacia, il potere dei cancerogeni è determinato da: Immagine slide 19 presentazione 1.

• Reattività intrinseca.
• Equilibrio tra attivazione metabolica e inattivazione, = detossificazione.

Citocromo P450

La maggior parte delle sostanze chimiche è metabolizzata dalle monossigenasi citocromo P450.

Composto da un’emoproteina, citocromo P450, da una NADPH-P450 riduttasi.

L’aggiunta di un gruppo idrossile rende le sostanze più facilmente trasportabili in circolo e quindi escrete, ma ne può determinare anche l’attivazione.

Monossigenasi dipendenti dal citocromo P450: nell’uomo esistono diversi isoenzimi citocromo P450 con diversa distribuzione tissutale e con attività preferenziale verso substrati diversi.

Codificato da geni altamente polimorfici che determinano suscettibilità individuale.

Il prodotto del gene CYP1A1, il cit P1-450, metabolizza gli idrocarburi policiclici aromatici, es.: benzopirene.

Il 10% della popolazione bianca possiede una forma altamente inducibile del gene che nei soggetti fumatori causa un aumento pari a 7 volte il rischio di sviluppare carcinomi al polmone rispetto a fumatori con genotipo non permissivo.

Cancerogeni ad azione diretta

ROS: specie reattive dell’ossigeno

1. ROS: specie reattive dell’ossigeno; catena respiratoria, produzione di ROS; effetti dannosi sulle cellule.

Nella catena respiratoria l’ossigeno viene ridotto a H₂O, portando l’estrusione di ioni H+ che formano il gradiente protonico che alimenta la ATP sintasi.

Nella reazione red-ox possono essere persi elettroni che determinano quindi la formazione di ROS, i quali, a loro volta, cercheranno di stabilizzarsi acquisendo elettroni dalle altre molecole, danneggiandole, tra cui il DNA.

Antiossidanti, antociani... e vitamine come risposta ai ROS: la cellula ha un pool di molecole antiossidanti, come le vitamine, che possono donare elettroni ai ROS grazie alla presenza nelle loro catene di doppi legami insaturi senza perdere a loro volta stabilità, quindi evitando che i ROS reagiscano con altre molecole.

Bloccano la diffusione del danno stabilizzando il radicale libero con gli elettroni donati e non necessitano di essere ulteriormente stabilizzati loro stessi.

Tioli come risposta ai ROS: composti sulfidrilici presenti nell’organismo liberi in forma ridotta, come disolfuri o legati a proteine, e capaci di ridurre i ROS mediante trasferimento di elettroni.

Es.: cisteina, cisteinglicina, omocisteina, glutatione, GSH.

Enzimi detossificanti come risposta ai ROS

Enzimi detossificanti come risposta ai ROS, sistema attivo:

• Catalasi.
• Superossido dismutasi.
• Perossidasi riducente verso H₂O₂, richiede l’azione di un co-substrato come donatore di elettroni.

NB.: La stessa reazione può essere catalizzata dalla Glutatione-S-transferasi, GST, e dai composti contenenti gruppi sulfidrilici, -SH, quali ad esempio il Glutatione che è in grado di ridurre i ROS.

Perturbazioni: aumento dell’attività fisica porta un aumento della catena respiratoria, in processi infiammatori i fagociti rilasciano ROS, fumo di sigaretta...

Fumo di sigaretta

Fumo di sigaretta: NO è un vasodilatatore, ha effetti anti-aggreganti e anti-infiammatori. Effetti positivi su ipertensione, aterosclerosi, insufficienza cardiaca, media erezione del pene.

Ma le condizioni ossidanti, Tobacco burning, presenti nell’aerosol di sigaretta portano a:

1. Conversione di NO in NO₂ con perossidazione lipidica e danni al DNA.
2. Formazione di perossinitrito, una forma radicalica a cui è legata la tossicità.

Effetto dei ROS è modifica delle basi del DNA: l’ossidazione e la deaminazione ossidativa.

• Deaminazione: C, citosina o deossi-S-metilcitosina della CpG Island, → T; A → ipoxantina non usata nel DNA ma che si appaierà bene con G, NH₂ = O.
• Ossidazione: G → T, aggiunta = O.

Queste forme di ossidazione normalmente sono riparate dal sistema di riparazione del DNA, Base Excision Repair, -BER-, se questo non è ben funzionante può essere un problema.

Cancerogeni chimici: agenti alchilanti

2. Cancerogeni chimici: agenti alchilanti.

Meccanismo d’azione: non necessitano di attivazione. Alchilazione, es.: metilazione, di basi puriniche.

Possono essere monofunzionali o bifunzionali, gruppo alchilico può legare due basi, e conseguente possibile crosslinking inter-catene e blocco della replicazione.

Avviene la riparazione da parte di ALKB, BER o FANC.

NB.: Alcuni agenti alchilanti sono usati come agenti anti-tumorali e per altri scopi terapeutici:

• Mostarde azotate sono usate come armi chimiche per scopi bellici: gas inodore, incolore, insapore che se inalate comportano mutazioni diffuse. Agisce, usato in modo controllato, da citostatico, blocca la replicazione, contro leucemie, particolari linfomi e nel mieloma, leucemia delle plasmacellule, melphalan si usa nel mieloma multiplo.
• Fosfamidi, ciclofosfamide in particolare, è un agente alchilante usato nella terapia anti-neoplastica, come il precedente, e come immunosoppressore. In piccole quantità prevale l’effetto immunosoppressiva per malattie autoimmuni che hanno il sistema immunitario sempre attivo, in continua iper-proliferazione; la sua azione cancerogena, il mutageno crea mutazioni e danni alle cellule in attiva crescita comportando una loro down-regolazione.
• Aziridine: il tio-TEPA è usato principalmente come mielo-ablativo, cioè per uccidere tutta la popolazione cellulare del midollo osseo per preparare i pazienti che devono ricevere un trapianto di midollo osseo.

Cancerogeni ad azione diretta, devono essere attivati, sono pro-cancerogeni

1. Idrocarburi policiclici aromatici: costituiti da due o più anelli aromatici, sono fra i più potenti cancerogeni. Il danno solitamente è riparato da NER. Sono causa principalmente di carcinomi a polmoni, pelle, vescica. Si trovano nel carbon fossile e nel petrolio. La loro formazione per cause antropiche avviene nel corso di combustioni incomplete di combustibili fossili, legname, grassi, tabacco, incenso e prodotti organici in generale, rifiuti urbani. Possono essere detossificati da GST che presenta varie isoforme, ci sono polimorfismi, la cui mancanza è associata a maggior rischio a sviluppare carcinomi al polmone, vescica, pelle, colon.
2. Amine aromatiche: la loro attivazione avviene nel fegato ad opera del cit P-450; spesso provocano localmente epatocarcinomi. NB.: La specie umana è tra le poche a possedere la glucuronidasi urinaria; riporta in forma attiva la β-naftilamina; danno genotossico alle cellule della vescica; l’incidenza di carcinoma alla vescica è 2-5 vv più alto per i fumatori.
3. Nitrosamine e amidi: la formazione delle nitrosammine avviene nello stomaco o per frittura o arrostitura. Spesso causano carcinoma gastrico o esofageo, sedi frequenti di attivazione. La maggior parte delle nitrosammine provocano l’alchilazione del DNA, BER.
4. Cancerogeni naturali: esistono diversi cancerogeni di questo tipo come la aflatossina B1 prodotta dal fungo Aspergillus flavus, cresce in alimenti mal conservati, come le arachidi, che è un potente cancerogeno epatico e può agire in sinergia con il virus dell’epatite B che interferisce con la detossificazione dell’aflatossina nel fegato.

Agenti promuoventi

• Promotori esogeni: fumo di sigaretta e infezioni, infiammazione inducono danno tissutale e iperplasia reattiva, produzione della proliferazione.
• Promotori endogeni: ormoni, fattori di crescita permettono l’acquisizione di un livello sufficiente di instabilità genetica per cui la cellula è indipendente da stimolazioni esterne; sali biliari, rilasciato in seguito ad assunzione di grassi, in quantità eccessive causano infiammazione con potenziale danno alla regione sottostante, tratto intestinale, che rimane infiammato in modo cronico e si ritorna ai promotori esogeni.

Cause fisiche di mutazioni

Le radiazioni sono caratterizzate da:

• Massa: radiazioni elettromagnetiche non hanno massa, = 0, ma si propagano alla velocità della luce.
• Radiazioni corpuscolate hanno velocità inferiore a quella della luce e hanno massa variabile sub-atomica.

Le radiazioni usate a scopi terapeutici hanno anche un lato negativo, talvolta se non distruggono completamente il tessuto, le cellule tumorali possono attivare una neoplasia, ulteriori mutazioni nei tessuti circostanti che sopravvivono.