Modulo di Anatomia patologica

Prof. Pelosi anatomia patologica

Tecniche di base in anatomia patologica e colorazioni non immunoistochimiche

L’anatomia patologica è la branca specialistica della Medicina che si occupa della diagnosi delle malattie umane mediante l’esame morfologico macro-microscopico e l’esame molecolare degli organi, dei tessuti e delle singole cellule.

L’applicazione di procedure, concetti, metodologie diagnostiche esiste anche in altri campi delle scienze: patologia vegetale, patologia in ambito veterinario…

L’esame morfologico macro-microscopico è l’investigazione fatta con gli occhi (nell’approccio microscopico uso anche di microscopio) di quello che è il modo di presentazione della malattia.

Si può così fare diagnosi morfologica che deriva dall’aspetto esteriore o microscopico della malattia, è l’analisi di come si presenta. Si analizzano gli organi, i tessuti, le singole cellule.

Questo è l’approccio tradizionale dell’anatomia patologica che negli ultimi anni, con il progresso della medicina e l’espansione delle tecniche di biologia molecolare è diventato la diagnosi molecolare.

L’indagine anatomopatologica che fa il patologo è di tipo diagnostico e ha l’obiettivo di arrivare al riconoscimento di una malattia. Consente di distinguere cellule e tessuti normali da quelle/i in cui si sia sviluppata un’alterazione, soprattutto morfologica, di qualunque natura essa sia: infiammatoria, neoplastica, dismetabolica o regressiva.

• L’esame citologico permette di riconoscere come sono alterate le cellule a livello individuale.
• L’esame di un tessuto o istologico a livello collettivo.
• L’esame o riscontro diagnostico a livello di un organo o dell’interno corpo umano.

NB.: La malattia deriva da un’alterazione di cellule.

Se le lesioni indotte da una malattia sono specifiche e caratteristiche, il loro riscontro, attraverso un ragionamento logico di tipo deduttivo-induttivo, e non attraverso il risultato di una macchina, comporta la diagnosi di malattia.

La diagnosi del patologo è la base su cui si basano il 95% delle terapie che sono somministrate ai pazienti.

Rapporto dell’anatomia patologica verso le altre medicine di laboratorio, che danno la definizione di un’alterazione biologica chiamata biomarcatore, disconnessa però dal ragionamento clinico = diagnosi e non test.

Es.: iperuricemia non vuol dire gotta.

Iperglicemia non vuol dire diabete.

Isolamento di un germe non vuol dire malattia infettiva.

La diagnosi anatomopatologica non è fatta da una macchina o è una procedura automatica di laboratorio, ma è fatta da un essere umano come frutto di un “ragionamento logico” deduttivo/induttivo.

Il clinico dice al laboratorio che materiale invia, le informazioni necessarie e fondamentali per il lavoro del patologo.

La richiesta di un esame di anatomia patologica è fatta attraverso un supporto cartaceo o elettronico e non detto a voce.

Un reparto di anatomia patologica deve essere estremamente organizzato.

Esso possiede un laboratorio di anatomia patologica organizzato in fasi:

• Accettazione del campione → presa in carico. Da questo momento il laboratorio è responsabile dal punto di vista legale di tutto quello che accade al campione: perdita, danneggiamento…
• Riduzione macroscopica.
• Processazione, inclusione.
• Taglio, colorazione.
• Diagnosi del patologo.

NB.: Sui campioni, vetrini istologici, biocassette…, sono presenti dei codici a barra bidimensionali che consentono di tracciare tutte le fasi lavorative e che sono letti da dei lettori.

Tipologie di esami di anatomia patologica:

• Esami citologici.
• Esami istologici.
• Esami complessi.
• Esame estemporaneo, intraoperatorio, nel corso dell’intervento chirurgico.
• Riscontro diagnostico e autopsia, dell’intero corpo umano.

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Esami citologici

Campione citologico costituito da un insieme di cellule prelevate dal corpo umano con varie modalità.

Sono cellule disaggregate: non hanno, rispetto al contesto nativo, la medesima disposizione nello spazio.

La citologia diagnostica, o clinica o cito-diagnostica, ha elaborato una serie di parametri interpretativi per poter arrivare ad una diagnosi.

Citologia secondo il tipo di prelievo:

• Citologia esfoliativa → si prelevano cellule che esfoliano da una superficie solitamente epiteliale.
• Spontanea, fisiologica o turn over accelerato a causa di processi patologici, urine, escreati, liquido pleurico o ascitico.
• Provocata, spazzolamento o brushing…
• Citologia esfoliativa + spazzolamento: si prelevano sia cellule staccate in quel momento sia quelle già staccate naturalmente.

Es.: PAP test. È una forma di prelievo dove con un’esfoliazione provocata da una spatolina inserita nell’orifizio cervicale esterno che raccoglie le cellule presenti nel canale cervicale e quelle precedentemente esfoliate per mezzo delle secrezioni vaginali.

Il materiale raccolto è adagiato su un vetrino e si ottiene il preparato citologico.

• Citologia agoaspirativa, FNAB/FNAC.
• Nodulo palpabile superficiale, identificazione manuale.

Es.: nodulo alla tiroide o alla mammella.

• Nodulo non palpabile profondo, tecniche radiologiche come ecografia o TC.

Risultato finale: espettorato.

Citologia in fase liquida

Citologia in fase liquida, Liquid Based Cytology: il preparato citologico, indipendentemente dalla modalità di prelievo, è sospeso in un liquido.

Delle macchine poi:

• Contano la densità delle cellule.
• Se eccessiva la densità diluiscono il materiale.
• Fanno passare il materiale attraverso dei filtri permeabili per i liquidi ma non per le cellule che si vogliono intrappolare.

Rovesciando il filtro e appoggiando le cellule sul vetrino si ottiene il preparato, un bollino di circa 1,5 cm di diametro con dei puntini colorati che sono le cellule.

Vantaggi: si riesce ad ottenere un monostrato di cellule separate le une dalle altre, con altre modalità le cellule tendono a sovrapporsi o formare aggregati spessi che non consentono di essere adeguatamente evidenziati.

È applicabile sia a prelievi esfoliativi che di tipo agoaspirato.

Citoincluso

Citoincluso, cellblock: il campione citologico, preparato, è posto in un blocco di paraffina. Si può così tagliare il blocchetto e ottenere delle sezioni per avere tante repliche del materiale citologico e poter fare molte determinazioni molecolari, immunoistochimiche, morfologiche…

Es.: Citoagar. Il campione è incluso in agar solidificato in una pipetta Pasteur.

NB.: Il limite presente da sempre di un preparato istologico è la piccola disponibilità di vetrini, campioni → le tecniche di citologia liquida/citoinclusioni non hanno questo problema.

Nell’esame citologico si può sia fare un esame morfologico, sia applicare tecniche speciali d’indagine: immunocitochimica, FISH, citoinclusione.

Esami istologici

Si guardano dei frammenti multi-/tissutali +/- grandi in cui le cellule sono ancora nella loro conformazione nativa.

• Biopsia incisionale, parte della lesione asportata, o escissionale, tutta la lesione è asportata.
• Biopsia endoscopica, effettuata nel corso di un esame endoscopico.

Es.: Polipo intestinale, si prelevano cellule associate, si preleva una carota tissutale.

• Biopsia per ago, punch.
• Campione operatorio: la parte mantiene, a parte l’alterazione della patologia, la medesima configurazione di quando quella parte di organo era all’interno del corpo umano.

NB.: La diagnosi può non essere conclusiva su un campione citologico ma deve essere conclusiva su uno istologico.

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Esami complessi

Sono un insieme di esami citologici ed istologici, si possono usare entrambi.

Esami estemporanei

Esami estemporanei, intraoperatori: solitamente è un esame istologico, a volte anche citologico.

L’esame intraoperatorio serve a guidare la strategia dell’intervento chirurgico.

Solitamente l’intervento chirurgico è preparato in anticipo, si conosce la diagnosi della malattia di cui soffre il paziente, diagnosi preoperatoria, ma capita che durante la chirurgia si trovi un reperto inaspettato di dimensioni troppo piccole da poter essere identificato da tecniche radiologiche ad esempio.

Il reperto potrebbe portare una modifica completa della strategia chirurgica.

Si fa allora il prelievo del reperto che viene mandato dal patologo che, in 10-15 minuti deve dare una risposta, responso, indirizzando l’intervento.

1. Isolamento del campione tissutale.
2. Congelamento del campione con criostato, o microtomo congelatore.
3. Il campione viene tagliato con il microtomo e posto su un vetrino portaoggetti.

NB.: Il vetrino è a T ambiente e così il campione si scongela subito per la differenza di temperatura.

4. Colorazione rapida con ematossilina-eosina.
5. Copertura del vetrino portaoggetti con il copri oggetti.

Si usano degli strumenti chiamati microtomi congelatori o criostati che portano ad una bassa temperatura i campioni tissutali da analizzare.

2. Il patologo fa un prelievo.
3. Il campione deve essere congelato.

• Un tempo si usava l’azoto ma questo ha una congelazione troppo rapida che determina un’evaporazione rapidissima, sublimazione, dell’acqua contenuta nelle cellule; si formano così grosse bolle all’interno delle cellule che le spaccano.
• Si è iniziato ad usare poi l’isopentano, un alcol che sostituisce l’acqua nelle cellule e che si congela meno velocemente dell’H2O e provoca bolle più piccole danneggiando meno le cellule e il tessuto. Ma questo alcol dà una serie di problemi come tossicità.
• Oggi il materiale da congelare è posto nella camera del microtomo congelatore, T di -22/25 °C, e nel giro di pochi minuti si congela.

4. Il campione è tagliato in sezioni sottili di tessuto congelato.
5. Le sezioni sono colorate.
6. Si fa diagnosi.

A che cosa deve servire l’esame estemporaneo:

• A stabilire la presenza e la natura di una lesione.
• A determinare lo stato dei margini chirurgici.
• A stabilire l’adeguatezza diagnostica di un campione, anche se la precisa diagnosi potrebbe non essere possibile in esame estemporaneo.
• Lo scopo principale dell’esame estemporaneo è quello di guidare l’intervento chirurgico.
• Tempistica 10-15 minuti, immuno +20 min.
• Notizie cliniche complete.
• Discussione del caso con il chirurgo, meglio prima!

Riscontro diagnostico

Riscontro diagnostico: è l’esame sul cadavere con finalità clinico-scientifiche per accertare le cause della morte e per ricostruire la cronologia della morte, o epicrisi, mettendo in ordine decrescente di evoluzione temporale le cause che hanno provocato la morte del soggetto.

Con il progresso della medicina il numero di riscontri diagnostici si è drasticamente ridotto.

È chiesto dal medico curante, autorizzata nell’ospedale dal direttore dell’ospedale ed effettuata dal medico patologo.

Cause di morte, cronologia della morte:

• Effetto delle terapie.
• Epidemiologia, studio e ricerca.
• Controllo di qualità globale.
• Informazioni utili alla famiglia in particolare per forme di patologia diffusiva o forme eredito-familiari.

Autopsia

Autopsia, medico legale: è un esame con finalità medico-legali, di tipo giuridico-forense.

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È sempre l’accertamento delle cause di morte ma le implicazioni sono completamente differenti rispetto al riscontro diagnostico.

La datazione della morte è uno dei quesiti più importanti richiesti dal giudice.

È chiesta dal magistrato ed eseguita dal medico legale.

Il patologo ha una legge che obbliga al rispetto del cadavere con tecniche di vivisezione precise che indagano nella cavità cranica, toracica, addominale…

Tempistiche:

• Esame citologico: 3-24 ore → allestimento e colorazione sono veloci.
• È un esame di primo livello, un primo step diagnostico spesso seguito da un:
• Esame istologico: 24-48 ore.
• Esame autoptico: > 48 ore.

Allestimento di un preparato citologico

Ci sono varie modalità di allestimento a seconda di come sono state prelevate le cellule.

1. Strisciamento, se ottenimento da agoaspirazione, o centrifugazione, con citocentrifughe, se ho un liquido.

Obiettivo: far aderire le cellule su un vetrino portaoggetto.

2. Fissazione a fresco o dopo essiccamento.

La fissazione è una procedura che impedisce la degradazione autolitica dovuta alla fuoriuscita degli enzimi dai lisosomi ogni volta che la cellula va incontro ad ipossia.

Per bloccare questi processi degradativi si può asciugare il campione posto sul vetrino agitandolo rapidamente all’aria in modo che venga bloccata l’azione degli enzimi degradanti dei lisosomi, che sono idrolasi, appena è rimossa l’acqua.

Il fissativo più utilizzato è l’alcol etilico, etanolo, al 95%.

3. Colorazione.

Le cellule sono trasparenti, non si possono vedere per contrasto su un vetrino trasparente.

La colorazione usata per moltissimi campioni citologici è la colorazione di Papanicolaou, messa a punto da questo medico greco, che è particolarmente adatta per i PAP test perché le cellule oltre che colorate, rimangono sufficientemente trasparenti da far vedere anche ciò che sta sotto e consentire quindi di valutare anche quando le cellule si stratificano.

Altre colorazioni opacizzano il citoplasma e non permettono di vedere i dettagli delle cellule in presenza di sovrapposizioni e strati.

La colorazione di Papanicolaou usa tre coloranti applicati in successione:

• Ematossilina di Harris, filtrare → colora di blu +/- intenso in base al grado di condensazione della cromatina i nuclei e in generale gli acidi nucleici.

I nuclei ricchi in eucromatina saranno meno colorati di quelli ricchi in eterocromatina.

• Miscela EA, soluzione policroma di eosina + bruno Bismark + verde luce: EA50 per preparazioni ginecologiche, EA65 per preparazioni non-ginecologiche → colora il citoplasma con tonalità da grigio-verde fino a verde-blu.
• Orange G6, OG6 → permette di vedere le cellule squamose cheratinizzanti.

Colorazione panottica di May-Grünwald-Giemsa

Colorazione panottica di May-Grünwald-Giemsa: si usa in casi particolari come quando si hanno preparati di tipo ematologico.

Effetto Romanowsky-Giemsa = colorazione metacromatica differenziale.

• Nucleo in tonalità blu-viola.
• Citoplasma in tonalità dal blu al rosa.

Usa i coloranti in ordine:

• May-Grünwald: colorante primario [eosina Y anionica (-) e blu di metile cationico (+) a formare eosinato di blu di metilene].
• Giemsa: colorante secondario [eosina Y anionica (-), Azur B ed eosinato di blu di metilene].

È chiamata “panottica” perché consente di colorare tutte le cellule presenti in un determinato campione con modalità differenti a seconda del tipo di cellula o delle varie componenti nucleari e non delle cellule.

È particolarmente utile nell’esame dei campioni ematologici di sangue periferico e midollare perché colora molto bene in modo differenziale i granuli presenti nella popolazione di leucociti e quindi consentendone l’identificazione.

4. Esame microscopico.

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NB.: L’esame citologico è di primo livello non per importanza ma semplicemente perché viene fatto prima in un percorso diagnostico.

Gli esami citologici sono molto economici e per questo sono applicati nei programmi di screening citologico, es.: PAP test per prevenzione carcinoma della cervice dell’utero.

Allestimento di un preparato istologico

Il campione deve essere posto all’interno di una cassetta da inclusione, una cassetta forellata che consente il passaggio di vari fluidi, alcoli, acqua, xilolo, che sono usati durante le procedure di allestimento del preparato istologico.

Le cassette hanno dimensioni standardizzate e sono contrassegnate da codice a barre per poterle riconoscere in modo univoco e dal numero istologico.

1. Riduzione o campionamento.

Si deve ridurre il campione più grosso e complesso in piccoli pezzetti in modo da poterlo fare entrare nella cassetta da inclusione.

2. Fissazione.

Serve ad evitare i fenomeni degradativi autolitici post-mortali, da enzimi litici liberati dai lisosomi, che impedirebbero il riconoscimento morfologico.

Il processo non è sinonimo di necrosi perché è una procedura chimico-fisica che blocca la vita della cellula mantenendone l’integrità morfologica nei limiti del possibile, quindi impossibile totalmente.

Si usano oggi dei fissativi chimici che permettono di bloccare i processi autolitici post-mortali.

• Fissativi che determinano la coagulazione delle proteine: etanolo, metanolo, acetone, acido acetico…
• Fissativi che determinano la formazione di legami covalenti tra residui amminoacidici, cross-linking, legami crociati: formaldeide, glutaraldeide…
• Fissativi composti con entrambe le precedenti funzioni: alcol + formalina, formaldeide + glutaraldeide…

Il fissativo più utilizzato è la formalina in una soluzione acquosa di aldeide formica al 4%.

L’aldeide formica in cond