Misurazione dei recettori negli esperimenti di saturazione

Misurazione dei recettori negli esperimenti di saturazione

Gli esperimenti di saturazione permettono di determinare due importanti caratteristiche dell’interazione tra farmaco e recettore: il numero totale di recettori presenti in una preparazione e l’affinità del farmaco per il recettore.
Il primo parametro misurabile è il numero totale di recettori presenti nella preparazione, indicato come Bmax. La Bmax rappresenta il numero massimo di molecole di farmaco radioattivo che possono legarsi ai recettori presenti. Poiché ogni molecola di farmaco radioattivo legata corrisponde a un recettore occupato, il valore della Bmax permette di ricavare il numero totale di recettori presenti nella preparazione.
Il secondo parametro è rappresentato dall’affinità del farmaco per il recettore, che è inversamente proporzionale alla Kd (costante di dissociazione).
La Kd rappresenta la concentrazione di farmaco necessaria per occupare il 50% dei recettori totali presenti nella preparazione. Pertanto, più bassa è la Kd, maggiore è l’affinità del farmaco per il recettore.

Interazione farmaco-recettore

L’interazione tra farmaco e recettore può essere descritta attraverso una reazione reversibile:
r + f ⇄ rf
dove r rappresenta il recettore, f il farmaco libero e rf il complesso farmaco-recettore.
La costante di dissociazione è definita come:
Kd = ([r] × [f]) / [rf]
ed è inversamente correlata alla costante di associazione (Ka):
Kd = 1/Ka
Una Kd bassa indica che il complesso farmaco-recettore è stabile e che il farmaco possiede un’elevata affinità per il recettore.

Esecuzione di un esperimento di binding per saturazione

Per eseguire un esperimento di binding per saturazione si utilizza un omogenato di tessuto contenente i recettori da studiare. L’omogeneizzazione permette di separare i recettori dalle strutture cellulari del tessuto.
I recettori vengono successivamente incubati con concentrazioni crescenti di un farmaco radioattivo. Dopo il legame farmaco-recettore, la preparazione viene sottoposta a filtrazione: il farmaco radioattivo libero attraversa il filtro, mentre il complesso recettore-farmaco radioattivo rimane trattenuto.
Aumentando progressivamente la concentrazione del ligando radioattivo, aumenta il numero di recettori occupati fino a raggiungere un punto in cui tutti i siti recettoriali disponibili risultano occupati. In questa condizione si raggiunge la saturazione del sistema.

Curva di saturazione e determinazione della Bmax

Nella curva di saturazione, sull’asse delle ascisse viene riportata la concentrazione di farmaco radioattivo, mentre sull’asse delle ordinate viene riportata la quantità di farmaco radioattivo legata ai recettori, che corrisponde indirettamente al numero di recettori occupati.
Inizialmente, aumentando la concentrazione del farmaco, aumenta anche il numero di recettori occupati. Questo incremento però non continua indefinitamente, perché i recettori disponibili sono limitati.
Quando tutti i recettori sono occupati, la curva raggiunge un plateau. Questo valore massimo corrisponde alla Bmax, cioè al numero totale di recettori presenti nella preparazione.

Determinazione della Kd

Dopo aver determinato la Bmax, è possibile calcolare la Kd, che indica l’affinità del farmaco per il recettore.
Poiché la Kd corrisponde alla concentrazione di farmaco necessaria per legare il 50% dei recettori disponibili, per determinarla si individua sulla curva il punto corrispondente alla metà della Bmax. Da questo punto si traccia una proiezione verso l’asse delle ascisse e si legge la concentrazione di farmaco corrispondente.

Il valore ottenuto rappresenta la Kd.
Una Kd bassa indica che è sufficiente una piccola quantità di farmaco per occupare metà dei recettori e quindi che il farmaco possiede un’elevata affinità.
Al contrario, una Kd elevata indica che è necessaria una maggiore concentrazione di farmaco per ottenere la stessa occupazione recettoriale e quindi che l’affinità è inferiore.
Ad esempio, se un farmaco presenta una Kd di 10⁻⁸ M e un altro farmaco una Kd di 10⁻⁶ M, il secondo necessita di una concentrazione cento volte maggiore per occupare il 50% dei recettori. Pertanto il primo farmaco ha un’affinità maggiore.
Se invece un farmaco presenta una Kd di 10⁻¹⁰ M, sarà sufficiente una concentrazione cento volte inferiore rispetto al farmaco con Kd di 10⁻⁸ M per ottenere la stessa occupazione recettoriale.

Significato farmacologico dell’affinità recettoriale

L’affinità di un farmaco per il recettore è importante perché è correlata alla potenza farmacologica.
Un farmaco con elevata affinità generalmente richiede una dose minore per ottenere un determinato effetto terapeutico rispetto a un farmaco con minore affinità per lo stesso recettore.
Tuttavia, un’elevata affinità non significa necessariamente che un farmaco sia più efficace dal punto di vista terapeutico. L’affinità rappresenta solamente uno dei parametri che influenzano la dose necessaria per ottenere un effetto.
L’affinità misurata negli esperimenti di binding è correlata alla potenza del farmaco osservata negli esperimenti dose-risposta e contribuisce alla definizione della dose terapeuticamente utile.

Esperimenti di binding per competizione

Gli esperimenti di binding per saturazione richiedono l’utilizzo di farmaci marcati radioattivamente. Questa procedura è poco conveniente quando devono essere analizzati migliaia di composti, perché ogni molecola dovrebbe essere modificata con un tracciante radioattivo.
Per questo motivo vengono utilizzati gli esperimenti di binding per competizione, che permettono di studiare l’interazione di farmaci non marcati con lo stesso recettore.
In questo tipo di esperimento, i recettori vengono incubati con una concentrazione fissa e bassa di ligando radioattivo e con concentrazioni crescenti di ligando non marcato, definito anche ligando freddo.
Lo scopo è verificare se il ligando freddo sia in grado di competere con il ligando radioattivo per lo stesso sito recettoriale.
Se due farmaci riconoscono lo stesso recettore, entrano in competizione perché entrambi cercano di occupare il medesimo sito di legame.

Meccanismo della competizione recettoriale

Inizialmente il ligando radioattivo si lega ai recettori disponibili. Successivamente viene aggiunto il ligando freddo, che compete con il ligando radioattivo.
Aumentando progressivamente la concentrazione del ligando non marcato, questo sostituisce sempre più il ligando radioattivo dai recettori, riducendo la quantità di radioattività associata al recettore.
Il principio dell’esperimento è quindi che il ligando freddo, se riconosce lo stesso bersaglio molecolare, è in grado di spiazzare il ligando radioattivo dal recettore.